简单小窍门，将CRISPR-Cas9基因编辑效率提高5倍

简单小窍门，将CRISPR-Cas9基因编辑效率提高5倍

2016年08月19日讯 加州大学伯克利分校的研究人员现在找到了一种方法，可在大多数类型的人类细胞中将CRISPR-Cas9切割及让基因丧失功能的效率提高5倍，使得构建及研究基因敲除细胞系变得更容易，并有潜力让突变基因丧失功能作为一种人类疗法。

科学家们在不断地发现新基因或它们编码的蛋白，但要阐明它们在体内或疾病中的作用则难得多。发现这一作用的关键在于要让基因丧失功能，看看当除去它时会发生什么。

尽管CRISPR-Cas9可以加速生成基因敲除细胞系的过程，研究人员有时必须制造并筛查这一遗传剪刀的许多变体来找到能够很好地起作用的CRISPR-Cas9。加州大学伯克利分校的研究人员发现进行简单的调整，可以将这一过程的效率提高许多倍。

关键是将不与人类基因组中任何DNA序列匹配的一些DNA短片段，与CRISPR-Cas9蛋白一起导入到细胞中。这些称作为寡核苷酸的DNA短片段似乎干扰了细胞中的DNA修复机制，将普通CRISPR-Cas9s的编辑性能提高了2.5-5倍。

首席研究员、加州大学创新基因组计划科学主任、分子与细胞生物学副教授Jacob Corn说：“事实证明，如果你做件非常简单的事--只是供给细胞在人类基因组中任何地方没有同源性的、廉价的合成寡核苷酸，编辑率将提高5倍。”这一技术可以提高所有CRISPR-Cas9s的效率，甚至是那些最初根本无法发挥作用的CRISPR-Cas9。

获得更高的效率，研究人员将能够更成功地构建出他们想要的基因敲除细胞系，随后利用它们来探索一个基因或一组基因的功能。因为大多数长寿细胞系都来源于癌细胞，包括非常受欢迎的HeLa细胞系，这些细胞系的每个基因通常具有超过正常两个以上的拷贝。这使得难于同时敲除所有的拷贝，更高的效率大大提高了成功的机会。

当要敲除基因纠正人体内的遗传突变时高效率也很重要。医生们一直在考虑敲除使得人们容易罹患感染性疾病，如艾滋病，或自身免疫、炎症或神经退行性疾病的一些基因。Corn和同事们描述的这种方法是否能够用于治疗仍有待观察，但它对于实现研究目的非常有效。

CRISPR-Cas9分子是由一个蛋白质剪刀Cas9蛋白，和告诉Cas9结合与切割DNA位置的地址所构成。这一技术依赖于，当你切割DNA时细胞的修复机制并不总是能正确重建DNA链，而是在让基因丧失功能，破坏其活性的序列中生成了一个错误。

地址是由20个核酸分子构成，与靶基因DNA序列互补的向导RNA。这一向导RNA像一条尼龙搭扣那样结合DNA，导致了Cas9切割双链DNA。

自加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和于默奥大学的Emmanuelle Charpentier在2012年发明这一技术以来，一些向导RNAs能够很好地起作用，导致Cas9近100%切割基因并让其丧失功能，而另一些结合但却很少或根本不敲除基因的原因一直是个谜。Corn说，切割效率随细胞类型和特定细胞系而异。

Corn怀疑，Cas9偶然不良的切割效率可能与DNA的修复方式有关，因为细胞间DNA的修复机制有差异。他推断，与人类DNA非同源的任意DNA链或许可以扰乱修复过程，提高基因敲除成功率。

Corn将CRISPR-Cas9基因编辑描绘为是切割与DNA修复之间的一场竞争：在Cas9切割DNA后，细胞会精确地替换切割DNA，Cas9再度切割DNA，在无休止的切割和修复循环中直至修复酶生成一个错误，基因最终功能失常。或许，寡核苷酸降低了修复过程的保真度，或让细胞切换至更易出错的一种修复，使得Cas9能够更为容易地打断基因。

Corn说，下一个前沿是利用DNA修复的一些特性，提高序列插入，用正常的基因来替换缺陷基因，并有可能治愈一种遗传性疾病。

CRISPR/Cas系统可以构建出多个基因精确突变的小鼠，但其效率低下阻碍了生成足够数量的转基因小鼠来建立人类疾病模型。通过添加一种抗癌药物Scr7到遗传编辑的受精卵中，Whitehead研究所的科学家将CRISPR/Cas的效率显著提高了19倍。

通过将CRISPR/Cas9系统注入到受精卵中，可一步构建出携带单基因或多基因突变或获得其他遗传改造的小鼠。尽管这一技术是有效的，但它需要进行显微注射--只能一次对一个受精卵实施这一有着一定技术难度且耗时的操作。在发表于2015年6月《Genetics》杂志上的一篇研究论文中，研究人员证实电穿孔是一种可替代显微注射的更快、更高通量的策略。

来自中国医学科学院、上海科技大学的研究人员报告称，在大鼠中他们通过抑制非同源末端连接（NHEJ）以及利用Cas9蛋白提高了CRISPR/Cas9介导的精确基因组编辑的效率。这一研究成果发布在2016年5月10日的RNA Biology杂志上。

CRISPR: 基因编辑原理及应用

CRISPR的全称Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，意为成簇规律间隔短回文重复序列，Cas则是CRISPR-associated (Cas) systems。

CRISPR/Cas 系统是原核生物的免疫系统，这个系统可以识别出外源 DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，用来抵抗外源遗传物质比如噬菌体病毒和外源质粒的入侵。这与真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。

CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来，该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。

??nature video视频： CRISPR: 基因编辑原理及应用

基因敲除：sgRNA+Cas9
基因敲入：sgRNA+Cas9+目的基因（HDR模版）

5‘端开始数20个碱基这一段是需要设计的，这一段用来识别目的基因上的靶标，并通过碱基互补配对原理与靶点位置结合。
gRNA再往后数76个碱基，是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的，就像转运RNA一样可以形成空间结构，然后就可以和Cas9酶相结合。
这样一条完整的gRNA就可以识别靶点，并且把与它自身结合的Cas9酶带到这个靶点，引导Cas9酶在靶点处对目的基因的双链DNA进行切断，从而达到基因编辑的目的。

目前又很多在线工具可以用于设计sgRNA

不同的导入方式基因标记效率和脱靶效率不同

参考：
CRISPR实验究竟怎么做？手把手教给你
CRISPR/Cas9 基因编辑全套操作和解决方案（TAKARA 讲解）

本文地址:http://dadaojiayuan.com/jiankang/303805.html.

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