深入剖析！如何利用CRISPR技术编辑人类诱导多能干细胞？

深入剖析！如何利用CRISPR技术编辑人类诱导多能干细胞？

2016年09月06日讯 过去10年里诞生了两种非常有用的生物学工具，第一个就是人类诱导多能干细胞（iPSCs），这是一项荣获诺贝尔奖的先进科技产物，2006年时研究者开始对小鼠进行实验，随后在人类机体中进行实验，研究者表示他们有可能将成体的皮肤细胞转化成为多能干细胞，随后这些多能干细胞就能够被诱导转化成为任何类型的细胞，这些细胞是个体基因组在细胞尺度的化身，而且其可以帮助科学家开发出那些不能取自活体的细胞类型，ipsCs通常能够提供方法来模仿单成因及复杂的人类疾病，同时还可以指导进行基于细胞的疗法。

第二项工具就是CRISPR-Cas9系统，其能够对基因组中的任何区域进行准确的编辑，当涉及传统永生的细胞系，比如HeLa或HEK293细胞系时，利用CRISPR进行切割或许会作为一个新手让研究者学习数周，第二波基于CRISPR的方法常常是通过增强或者减弱基因表达的水平来发挥作用的，而不是进行基因的切割，这或许可以使得这种方法变得更加有用。

上述两种技术的结合或将带来不可估量的效应，利用CRISPR编辑的iPSCs可以使得科学家对基因进行操作来研究在特殊疾病背景下的基因功能，或者去纠正病人细胞中的遗传缺陷，而其中一种挑战就是帮助定位的无缝基因编辑技术或许就能够确定不同ipsC细胞系的遗传变异，CRISPR-Cas9技术就能够帮助科学家制造出新型的仅通过单个核苷酸改变且用作特殊个体的质控细胞。

尽管CRISPR-Cas9和人类iPSCs已经成为研究者在实验室中老生常谈的话题了，但对两者进行统一却并不容易，想要研究基因功能的科学家如今正在发现，在培养基中很难维持人类ipsCs，而且也很难利用CRISPR进行操作。

最基本的工作流程

编辑且控制人类iPSCs细胞中的基因表达往往以两条平行的工作流开始，首先就是保证多能细胞的可靠来源，其次就是设计导向RNA，即可以靶向作用基因且具有20个核苷酸的序列。为了利用导向RNA和Cas9核酸酶来转染细胞，电穿孔技术就是主要的方法，因为其能够帮助科学家在维持细胞活性的同时将大量的DNA及蛋白质输入到细胞中，由于人类多能干细胞在运输过程中会沉默基因的表达，因此就应当尽可能地避免慢病毒运输。研究者通过追踪细胞的形态、多潜能标志以及细胞分化的能力来评估细胞的多能性，核型分析技术通常就能够确保细胞中有着正常数量的染色体，而且ipsC细胞系可以被用来广泛购买。

人类多能干细胞VS人类肿瘤细胞系

首先研究者在人类癌细胞系中尝试CRISPR-Cas9工具，当他们准备转移到研究人类多能干细胞时，他们发现人类的iPSCs属于劳动密集型分布，而且难以维持。来自哈佛医学院的研究者Susan Byrne说道，有经验的研究者常常会花费一个月时间来学习人类iPSC的基本培养技术，即使那样，由于新步骤和试剂的出现，利用这些细胞进行研究仍然是一个需要持续学习的过程。干细胞非常特殊，其质量影响着我们培养细胞以及利用导向RNAs靶向作用细胞的能力，而我们看到的改变依赖于单一的供体及重编程的方法，有时候我们不得不优化制造特殊干细胞系的步骤。来自霍普金斯大学医学院的研究者Linzhao Cheng说道，在一般情况下，甚至利用健康细胞系时，我们应当期望降低10倍效率来将对人类ipsCs和ESCs进行编辑。

开始了解我们的基因

研究者表示，我们应当研究基因位点并且理解这些序列的功能，比如，在基因编辑之后被干扰的基因仍然会表现出某些生物活性，在某些情况下我们应当考虑基因位点发生了双重切割，而这目的是为了切除更大的基因区域。

选择多种导向RNAs并且对其进行检测，如今大量的软件都能够选择导向RNAs，但我们要记住，特殊的导向RNA似乎并不能很好地进行工作，或者根本不会工作；来源于事实的一个非常简单且最容易被忽视的原因就是根据我们的向导设计我们或许并没有相关的基因组，此外我们也应当需要考虑向导的活性。

敲除VS精确编辑

当利用CRISPR-Cas9切割基因时，两个主要的分子途径就会开启来进行DNA修复，而且最终会确定随后编辑作用的保真性，这两个修复通路同时会发生，用作基因敲除的非同源性末端接合（NHEJ）能够在DNA中产生小型的插入位点或剔除位点来阻断基因的功能；另外一种名为同源性直接修复（HDR）的作用则会基于供体的长链DNA来产生精确的核苷酸改变。

目前研究者Hockemeyer及其同事正在开发新型策略来使得同源性直接修复发挥主要作用，比如应用特殊的化学物或利用来自不同物种的Cas9酶等，研究者说道，我认为在未来几年里我们解决这些问题指日可待。

研究者Conklin的团队开发出了一种快速的数字PCR技术，其能够对HDR和NHEJ的修复率进行定量，在包括人类ipsCs的多个细胞类型中，上述两种修复率并没有互相关联，这就表明，相比单单测定一种修复率而言，同时测定两种修复率是非常明智的，尤其是当目标是HDR的时候。

对切割进行特性描述

在细胞分化前和分化后，测定或者掌握细胞的表型，比如形状或特殊标志物的存在，都是我们证实是否在合适位置切割的最基本的方法，利用和待编辑基因互补的DNA来补充编辑的细胞或许能够恢复细胞的表型，如果细胞表型太精细不能测出微小改变的话，研究者或许就应当尝试对基因进行第二次编辑来将其恢复至野生型。

此外研究者还抽取了基因编辑的基因组进行调查，比如利用这些区域的PCR和Sanger测序结果等，一种名为TIDE的算法可以重建预期突变的身份，同时还能够揭示其发生的机制。研究者Mali说道，对所有的蛋白编码基因和外显子组进行测序或许就能够帮助挑选已经验证的编辑，测序是当前的主要分析方法；从另一方面来讲，随着时间遗传差异性会不断积累，而这与细胞系并无关联。

脱靶效应

一种抑制脱靶编辑的主要方法就是至少利用两种或多种靶向作用相同位点的不同“向导”，而这或许并不可能给出相同的脱靶结果；一般而言，脱靶效应并不是主要的问题所在，至少对于大多数基础科学家而言是这样的，相比癌细胞系而言，脱靶效应往往并不太可能发生于人类的多能干细胞中，但研究者如果真得非常关心的话，进行全外显子组测序或许就是最佳的方法了。

控制基因的表达而不是对基因进行编辑

如果希望对多能干细胞中对多能性表现非常重要的基因进行敲除的话，很明显我们的运气并不够好，我们或许并不能用死细胞得出太多信息，在这种情况下，我们就需要提高或减弱基因的表达，而扩大CRISPR-Cas9工具的功能或许就能达到这种目的；研究者们通常会使用一种“死亡版本”的Cas9，其能够结合到基因组中的预定位置但并不会切割DNA序列，相反，死亡版本”Cas9的不同突变体要么会抑制转录（称之为CRISPR干扰，CRISPRi），要么会激活表达。

近来一项研究发现，对ipsCs筛查寻找功能缺失区域时，相比CRISPR-Cas9而言，CRISPRi或许会比传统的CRISPR更加有效，CRISPRi能够沉默95%的细胞中的基因表达，而CRISPR-Cas9仅能够沉默60%至70%细胞中基因的表达，这是因为CRISPR-Cas9并不总是会引发移码突变，而移码突变通常会使得蛋白质部分或完全失去功能，也就是说，成功地沉默基因的表达往往因细胞类型和位点不同而不同。

基因表达控制和基因编辑之间的主要差异就是，在基因表达控制下，我们或许并不能永久地改变基因组，我们可以扰乱细胞的功能，比如沉默基因表达随后逆转基因的抑制作用；此外，相比CRISPR-Cas9而言，脱靶效应或许更少地同CRISPRi和CRISPRa（CRISPR激活）相关。调节基因表达面临的一个挑战就是研究者很难选择或设计一套坚实的导向RNAs，研究者表示，在理想状况下他们可以避免基因组的区域被核小体紧密围绕，而蛋白的缠绕往往会使得基因沉默，但在某些情况下，这些区域就很有可能是研究者所要靶向作用的区域。

对于研究者而言，将CRISPRi和CRISPRa有效成功地运输到人类多能干细胞中非常复杂，研究者Cowen指出，目前除非使用病毒载体的运输方法，否则仍然很难将CRISPRi和CRISPRa运输到70%至80%的细胞中，而目前我们仅仅谈论的是30%至40%的细胞，研究者认为这或许能给他们带来一定帮助，因为在某些情况下他们很难或者不可能将ipsC分化成为特殊类型的细胞，研究者Cowen长期利用CRISPRa来激活并且验证报道基因，他表示，在我们实验室利用肾脏内皮细胞就能够知道报道基因是否在正常工作。

CRISPR基因编辑将首次用于人类治疗失明

根据新闻报道，第一项测试人体内基因编辑技术CRISPR的研究即将在美国展开。

根据美联社报道，该研究计划使用CRISPR治疗导致失明的遗传性眼部疾病。

的人这种情况有一个基因突变，影响视网膜的功能，视网膜是眼睛后部的感光细胞，对正常视力至关重要。这种情况是Leber先天性黑蒙的一种形式，据美国国家卫生研究院称，儿童失明最常见的原因之一，每10万名新生儿中就有2至3名会受到影响。

这种治疗方法将使用CRISPR来纠正突变，CRISPR是一种让研究人员能够精确编辑DNA的工具美联社报道，在一个特定的地点，

的研究人员将使用一种注射剂将治疗直接传递到感光细胞，根据Editas Medicine公司的一份声明，Editas Medicine公司正在与Allergan一起进行这项研究。

这项试验将总共招收18名患者，儿童（3岁及以上）和成人。

这项新研究不同于中国科学家去年用CRISPR编辑双胞胎婴儿基因组的有争议的研究。美联社报道，在这种情况下，这位中国科学家编辑了胚胎的DNA，这些基因改变可能会遗传给下一代。美联社说，在这项新的研究中，在儿童和成人身上进行的DNA编辑不能传给他们的后代。

科学家们刚刚用CRISPR解开人类基因组做了10件令人惊奇的事情：仿生人类的6个分子里程碑：最初发表在《生命科学》上的十大技术 。

简述crisprcas9的原理和用途

简述crisprcas9的原理和用途如下：

CRISPR-Cas9技术原理：CRISPR-Cas9技术包含两种重要的组分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的gRNA。CRISPR-Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNA引导Cas9核酸酶对特异靶向DNA进行识别和切割，造成DNA的双链或单链断裂，然后，细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复，即非同源性末端接合或同源介导的修复。

CRISPR-Cas9用途：利用两种修复机制，可以实现基因的插入和敲除。没有模板的情况下，利用NHEJ修复，随机插入或缺失序列造成基因敲除。有模板存在的情况下，可通过HDR修复在剪切位点引入目的修饰基因，实现基因的定点修改。

主要功能

CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。

以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。

专利授权

2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的第一个专利授权。专利权限包括在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中使用CRISPR。这意味着拥有在除细菌之外的所有生物，包括老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权力。

CRISPR Cas9知识储备第一弹：简介

CRISPR Cas9 -- C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats CRISPR- A ssociated P roteins 9

Crispr-CAS9系统最初在细菌和古生菌中观察到，作为一种适应性微生物免疫系统，提供对外来病毒和质粒的获得性免疫；已测序物种中，40%的细菌和90%的古生菌可观察到CRISPR基因座，且细菌中可能存在一个以上的基因座。

入侵的外来DNA被Cas核酸酶切割，然后以间隔序列的形式被保守的重复序列捕获并整合到crispr位点，所获得的间隔物作为创建短CRISPR RNA（crRNAs；create short CRISPR RNAs ）的模板，它与反式激活cRNA（tracRNA；trans-activating crRNA ）形成复合物；它们一起起到引导链的作用，将cas9核酸酶导向互补的入侵DNA（3）。一旦结合，cas9蛋白通过其HNH和RuvC-like核酸酶结构域分别切割“crRNA互补”及反义链。

文献中已描述45个不同的cas蛋白家族，每一个家族在合成cRNA、整合新的间隔序列和切割入侵DNA中具有不同的作用。CRISPR-Cas系统通常分为三类，这取决于Cas蛋白质序列和结构：I型、II型和III型。目前常用于基因组编辑的CRISPR-Cas9系统是一个Ⅱ型CRISPR-Cas系统，它是从化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）改编而来的。

内切酶是化脓性链球菌产生的细菌CAS9核酸酶蛋白。CAS9核酸酶具有两个DNA剪切结构域（Ruvc1和HNH-like核酸酶域），可剪切双链DNA使双链断裂（DSB；double strand breaks）。

gRNA是一种工程化的单链嵌合体RNA，结合了细菌tracrRNA的支架功能和细菌crRNA的特异性。gRNA 5'端的最后20bp作为一个归位装置，通过RNA-DNA碱基配对，将CAS9/GRNA复合物招募到PAM(protospacer adjacent motif )上游特定的DNA靶位。不同菌株和不同类型的CRISPR-Cas蛋白之间的PAM序列不同，化脓性链球菌Cas9的序列是5’-NGG。目前的CRISPR-CAS9系统可以直接用于任何5’-N20-NGG DNA序列，并产生精确的双链断裂。然后，通过在几乎所有细胞类型和生物体中发现的两种通用修复机制修复DSB：非同源末端连接（NHEJ；the non-homologous end-joining ）或同源定向修复（HDR；the homology-directed repair）。

NHEJ修复路径是一种容易出错的修复机制，用于在没有合适的修复模板的情况下修复双链断裂。NHEJ通路试图将DSB的切割端连接在一起。然而，这一过程往往导致DSB位点的插入或删除（indels）突变，导致移位或引入永久性破坏目标基因开放阅读框的成熟前终止密码子。尽管NHEJ的INDEL结果很大程度上是随机的，但是科学家们可以通过将gRNA定位于相关基因的N末端来确保最大程度的基因破坏；这将确保框架移位突变不会导致部分功能性基因产物。在利用NHEJ修复通路时，设计第一或第二外显子中的gRNA并避免靶基因的内含子区是一个很好的实践。

除NHEJ，细胞还能够利用一种更精确的修复机制，即同源定向修复（HDR）途径。这种修复机制可以用来引入特定的核苷酸修饰基因组DNA。在这种方法中，将与预期编辑位点上游和下游序列高度同源的DNA修复模板连同适当的gRNA和CAS9核酸酶一起引入细胞。在这种合适的模板存在下，不易出错的HDR机制可以通过重组忠实地对CAS9诱导的DSB站点进行所需的更改。在设计修复模板时，请确保目标序列没有紧跟PAM序列，或者PAM序列被排除或变异。这是为了避免使用相同的CRISPR-CAS9系统对修复模板进行降解。

CRISPR-CAS9系统可以通过gRNA的设计针对任何基因组区域的特异性取决于位于目标序列下游的PAM序列。作为细菌和古细菌免疫系统，PAM识别序列激活CAS9的核酸酶域，从而作为区分自我和非自我的手段（如：阻止CRISPR基因座被靶向）。

PAM识别序列因来源于CAS9核酸酶的细菌种类和类型而异。最常用的II型CRISPR系统使用来自化脓性链球菌的CAS9核酸酶。这种特殊的核酸酶在GRNA序列的3'端识别5'-NGG。其他市售CAS9可识别其他PAM序列。

Table 1 : PAM Sequences from Different Species and Subtypes of Cas Nucleases.

Cas9 Nickase是Cas9的一种突变形式，其RuvC1 或HNH-like核酸酶域中分别有D10A 或H840A 突变，这种突变形式导致在目标位点产生单链刻痕而不是双链断裂。由于单链断裂（或缺口）通常使用完整的互补DNA链作为修复模板通过HDR 途径快速修复，因此Cas9 Nickase可将脱靶效应最小化。

为了利用Cas9 Nickase进行基因组编辑，需要两个gRNA。这两个gRNA需设计在相反的DNA链上，但其距离很近，以确保一旦两个链被Cas9 Nickase切割，DSB就会被诱导。这对Cas9 Nickase修改减少了脱靶效应，因为需两个gRNA共同产生一个DSB。一旦形成DSB，NHEJ或HDR路径将被激活以完成基因组编辑过程。

如果共同引入含有所需修饰的修复模板DNA与gRNA和Cas9 nickase，则Cas9 Nickase也可用于通过同源重组产生核苷酸修饰。

Table 2 : Cas9 Nickase and Nuclease Usage in Gene Disruption and Specific Gene Modification

Cas9双突变体或Null突变体是通过突变野生型Cas9的两个切割结构域而产生的。 这种Cas9蛋白保留了通过gRNA：基因组DNA碱基配对与基因组DNA结合的能力。 与Cas9核酸酶和Cas9 Nickase可以实现永久性基因破坏不同，Cas9 Null突变体不引入任何基因组修饰。 通过将Cas9双突变体与其他效应蛋白融合，CRISPR Cas9系统可以将其作用扩展到基因调控，基因组成像，染色质或DNA修饰以及染色质免疫沉淀。

Table 3 : Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases

large size and G-rich PAM sequence

Cpf1于2015年底由麻省理工学院的Feng Zhang小组发现。在16种候选Cpf1蛋白中，两种在哺乳动物细胞中最具潜力的高特异性基因组编辑工具：asCpf1和lb2Cpf1。这些核酸酶在人类细胞中具有与常用spCas9相当的靶向切割效率。

Cpf1允许新的定位可能性，因为它识别富含T的PAM位点。与Cas9的富含G的PAM要求相比，这显着扩大了可能的基因组目标的范围。虽然Cas9可能是靶向富含G的区域的优选核酸酶，但Cpf1可用于靶向富含T的区域。在哺乳动物细胞中，Cpf1可以靶向如支架/基质附着区域和着丝粒DNA的难以延伸的DNA片段。使用Cpf1还可以探索由富含AT的结构域控制的细菌基因组，例如引起疟疾的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）。同样，在Cas9的表达有毒的情况下，Cpf1可能是Cas9的有用替代品，如在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和几种蓝细菌（Cyanobacteria）中所见。

Cpf1需要较短的guide RNA才能运作。虽然Cas9需要tracrRNA的存在来处理crRNA，但Cpf1可以自己处理pre-crRNA。这对于生物技术特别感兴趣，因为与用于Cas9的~100nt tracrRNA / crRNA杂交体相比，Cpf1可以仅用~42nt crRNA靶向。这将工程化sgRNA的大小减少了一半以上，同时还简化了与合成和化学修饰相关的方法和成本。这种自编辑功能也使Cpf1成为多重基因组编辑的最佳选择，因为更多的sgRNA可能适合一个载体。

另一个显着差异是Cas9在切割后产生平端，而Cpf1留下可用于定向克隆的粘性5'突出端。产生粘性末端的其他方法，例如限制酶消化，具有比Cpf1更短的识别序列，因此切割性较低。已经利用Cpf1的这种特性在体外进行高度特异性的DNA组装。在体内使用这种方法，科学家们可以对非分裂细胞（如神经元）进行DNA敲入，通过HDR进行基因组编辑尤其具有挑战性。

Cpf1切割PAM位点下游18-23bp的DNA，导致NHEJ修复双链DNA断裂后对识别序列没有破坏。导致Cpf1能够进行多轮DNA切割，并且增加了进行所需基因组编辑的机会。相比之下，由于Cas9仅在PAM位点上游切割3bp，因此NHEJ途径导致indel突变，其破坏识别序列，从而防止进一步的切割轮次。理论上，重复的DNA切割轮次应该导致Cpf1导致靶基因的沉默增加，并且在敲入实验的情况下，发生同源定向修复的机会更大。
Zhang等人的一项研究。表明Cpf1介导的基因组编辑可用于纠正诱导多能干细胞和小鼠的肌营养不良基因突变。这导致基因表达恢复，小鼠症状得到纠正。 Cpf1也已成功用于蛋白质-sgRNA复合物中，以突变大豆和烟草植物中的基因。

虽然化脓性链球菌Cas9（S. pyogenes Cas9; spCas9）是最常用的CRISPR核酸酶，但最近的注意力已转向从金黄色葡萄球菌中分离的微型Cas9核酸酶（S. aureus; saCas9）。这种小核酸酶通过使生物体内基于CRISPR的基因编辑更加可行，具有改变生物医学研究产业的巨大潜力。 SaCas9和spCas9能够以相当的效率在体内切割真核DNA。但saCas9具有几个特性，使其对某些应用更有用。

SaCas9比spCas9小约1kb，使其能够更有效地包装到较小容量的腺相关病毒（AAV）中，为调控元件，crRNAs和tracrRNAs留下额外空间。通过将Cas9和sgRNA包含在一个构建体（称为All-In-One载体）中，可以在一个转染/转导步骤中完成Cas9表达和sgRNA靶向。由于其低免疫原性和选择性感染某些组织类型的能力，AAV是用于体内研究的优选基因递送方法。

同样，与spCas9相比，saCas9为基因组编辑开辟了新的可能性，因为它具有不同的定位能力。 spCas9识别5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9识别5'-NNGRRT-3'。可用于PAM序列的更多种类意味着可用于基因组编辑的增加的基因座数量。当需要使用同源定向修复精确编辑基因时，这是特别有益的，因为当识别序列非常接近待编辑区域时HDR最有效。

saCas9较长的PAM的一个缺点是，该序列在基因组中的发生频率低于spCas9的PAM序列，限制了其潜在的效用。 然而，saCas9较长的PAM序列应该有助于防止脱靶的切割，因为它具有更高的特异性。

麻省理工学院张实验室于2015年进行的一项研究调查了体内saCas9的表现。 他们将携带saCas9的AAV注射到小鼠体内以破坏PCSK9基因，该基因与家族性高胆固醇血症有关。 这导致1周后肝组织中基因修饰> 40％，注射后4周没有毒性迹象。 最近的其他工作已经用于开发具有使用分子进化的松弛PAM识别特异性的变体saCas9。 与野生型saCas9相比，这种变体允许更大范围的潜在编辑目标，同时保留其小尺寸传达的优势。

锌指核酸酶（Zinc-finger Nucleases; ZFNs）
转录激活因子样效应核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases; TALENs）

Table 4 : Comparison of current genome editing technologies

An Intro to CRISPR Cas9

“基因魔剪”安全性再遇什么挫折？

6月11日，顶级学术期刊《自然》（Nature）子刊《自然-医学》（Nature Medicine） 同时发表了两篇新成果，给持续受到追捧的“基因魔剪” CRISPR技术泼了冷水。来自瑞典卡洛林斯卡研究所和剑桥诺华生物医学研究院的两个研究团队分别将关注点投到了一处：CRISPR编辑成功或增加患癌风险。

两个团队认为，CRISPR/Cas9基因编辑过程中造成的DNA双链断裂，会激活p53蛋白通路，引起人多能干细胞的凋亡。反过来也就是说，经基因编辑后还能存活下来的细胞，通常存在p53功能缺陷。?

p53缺陷是至今已知的与癌症相关的最普遍的基因突变。p53基因被称为“抑癌基因”，其编码的p53蛋白的重要作用之一是调控细胞分裂和增殖。正常情况下，一旦该基因察觉有严重DNA损伤或染色体结构变异的“坏”细胞，p53基因会抑制细胞的分裂，并引导细胞自杀，因此也被冠以“基因警察”称号。?

CRISPR技术的安全性再次受到质疑后，首当其冲的是几家基因编辑领域内的公司。Editas Medicine、Intellia Therapeutics、CRISPR Therapeutics这三家在纽约纳斯达克上市的公司， 6月11日当天股票均大幅下挫，跌幅分别为7.8%、9.81%和12.59%。截至6月12日，仅Intellia Therapeutics一家收住跌势翻红，上涨1.55%。?

增加患癌风险
此前的研究发现，CRISPR/Cas9技术运用到人多能干细胞（hPSC）时，效率通常低下，仅为其他细胞类型的1/5或1/10。然而，多能干细胞因其具有分化成多种成体细胞的潜能，在疾病治疗时被寄予厚望。??研究团队认为，在基因编辑前后，确保p53功能正常至关重要。毕竟，如果编辑成功的前提是p53缺陷，运用到临床治疗的后果是增加患者的患癌几率。

CRISPR Therapeutics首席执行官Sam Kulkarni此番也表示，该研究结果看起来是有道理的。并表示，这是我们该重视的地方，尤其是目前 CRISPR 疗法被应用于越来越多的疾病中。我们要确保这些编辑过的细胞不会在回输体内后成为癌细胞。

来源：澎湃新闻网

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