山中伸弥PNAS：提高干细胞重编程效率的新方法(诱导性多功能干细胞的研究历史)

山中伸弥PNAS：提高干细胞重编程效率的新方法

2016年10月27日讯 最近在美国国家科学院学报PNAS上发表的一项研究中，诺奖得主、首次制备了诱导多功能干细胞（iPSCs）的山中伸弥（Shinya Yamanaka）博士，和他Gladstone研究所的同事，通过对一种罕见的遗传性疾病进行研究，找到了一种方法来提高干细胞重编程的效率。

iPSCs--从皮肤细胞制备而来的干细胞，可以转化成身体中任何类型的细胞，从而彻底改变了生物医学科学。它们有助于再生医学和药物发现的突破，从而超越了研究人员曾经想到的可能性。但是，就像任何新技术一样，iPSCs也有需要改进的空间。例如，使用现有的技术，只有不到百分之一的成人皮肤细胞被重编程为iPSCs。

Gladstone研究所高级研究员、日本iPSC研究和应用中心（CiRA）主任山中伸弥说：“iPSCs的制备效率低下，是将这一技术应用于生物医学的一个主要障碍。我们的研究发现了一种令人惊讶的方式，可增加我们生成的iPSCs的数量。”

科学家们以一个非常不同的目标开始：制备一个细胞模型来研究进行性骨化性纤维发育不良（FOP）。这种极为罕见的遗传性疾病，可导致肌肉、肌腱和韧带转化成骨质，因此绰号“石人综合症”。这种疾病是由ACVR1基因中的一个突变造成的，它能过度激活一个对于胚胎发育非常重要的细胞信号过程，并涉及一个称为BMP的蛋白质。

令人惊讶的是，科学家们发现，与健康者相比，他们用来自FOP患者的细胞制备出的iPSCs细胞更多。他们认为，这是因为BMP信号可促进细胞更新--一个细胞复制的能力，并使它们保持在一个多功能的状态，能够成为任何类型的细胞。这两个特征是干细胞的关键特性。为了证实他们的预感，研究人员阻止BMP信号通路，这会导致FOP患者细胞产生更少的iPSCs。相反，激活这个信号通路可产生更多的iPSCs。

本文第一作者、山中伸弥以前的博士后Yohei Hayashi博士说：“最初，我们想建立一个FOP模型，也许可以帮助我们了解特定基因突变如何影响骨形成。我们惊奇地发现，来自FOP患者的细胞比来自健康人的细胞能够更高效地重编程。我们认为，这可能是因为导致骨细胞增殖的相同途径，也有助于干细胞再生。”

本文共同作者、Gladstone研究所高级研究员Bruce Conklin补充说：“这项研究首次表明，一个自然发生的基因突变可提高iPSC生成的效率。用携带遗传突变患者的细胞制备iPSCs不仅对疾病模型是有用的，而且也为重编程过程提供了新的见解。”

前不久，山中伸弥及其Gladstone心血管疾病研究所的科学家们用白血病抑制因子（LIF）、骨形成蛋白4（BMP4）、溶血磷脂酸（LPA）和抗坏血酸（AA）由小将小鼠始发态多能干细胞转化为原始态多能干细胞。这项研究发表在十月十四日的美国国家科学院院刊PNAS杂志上。

另外，今年2月份，山中伸弥还在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》杂志上发表综述文章，全面回顾了iPS重编程的发展历程。

诱导性多功能干细胞的研究历史

诱导多能干细胞最初是日本人山中伸弥（ShinyaYamanaka）于2006年利用病毒载体将四个转录因子的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。随后世界各地不同科学家陆续发现其他方法同样也可以制造这种细胞。
2007年11月20日，美国威斯康星大学詹姆斯·汤姆森的研究小组在<科学>杂志发表体细胞转变成“诱导性多能干细胞”（iPS细胞）的成果，而日本京都大学教授山中申弥领导的研究小组也于同日在《细胞》杂志发表类似的研究结果。紧接着皮肤细胞转为干细胞后，美国马萨诸塞州怀德海特生物医学研究所的雅各布·汉纳的小组用来自患病小鼠尾巴的皮肤细胞产生了诱导性多能干细胞。
2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。
2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接著，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的iPS细胞培育出鼠角膜上皮细胞。
2009年3月伊始，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则在<细胞>杂志上宣布，他们可以将iPS细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证由此获得的神经元细胞的基本功能不受影响。
2009年7月，iPS细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据英国《自然》杂志网站报道，中国科学家周琪和高绍荣等人利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了iPS细胞具有实用性。

我国科学家在干细胞制备技术上取得新突破，该技术可以应用于哪些临床实验？

多潜能干细胞具有无限增殖特性和分化成生物体所有功能细胞类型的能力，因此被称为“种子细胞”，但其只短暂存于胚胎发育的早期阶段，随后便会分化为各种类型的成体细胞。

近年来，诱导多能干细胞技术的建立，在细胞治疗、药物筛选和疾病模型等领域产生了广泛的应用价值，尤其是为患者构建自体特异性干细胞系，大大加速了干细胞临床应用的进程。

在哺乳动物自然发育过程中，多潜能干细胞只短暂存在于胚胎发育的早期阶段，随后便会分化为构成生物体的各种类型的成体细胞，丧失其“种子细胞”的特性。如何逆转这一自然发育过程，使高度分化的成体细胞重新获得类似胚胎发育早期的多潜能状态，一直是干细胞与再生医学领域最重要的科学问题之一。

多潜能干细胞具有无限增殖的特性和分化成生物体所有功能细胞类型的能力。这些神奇的特质，使其在细胞治疗、药物筛选和疾病模型等领域具有广泛的应用价值，是再生医学领域最为关键的“种子细胞”。

为了让干细胞诱导更安全、更有效率，邓宏魁团队十几年来持续开展小分子的寻找工作。受低等动物再生过程启发，团队发现高度分化的人成体细胞在特定化学小分子组合的诱导下，可以发生类似低等动物细胞可塑性变化。

干细胞归巢是指干细胞在多种因素的影响下，从原位定向迁移至靶组织并定植存活的过程。干细胞具有很强的归巢能力，其归巢到靶组织分为3步：首先识别微内皮血管，然后透过内皮，最后进入靶组织再生。

免疫是人体抵挡疾病，尤其是铲除进入人体的病原微生物(细菌、病菌、寄生虫等)和监控、杀灭肿瘤细胞的关键因素。因而，免疫系统是人体的防卫部队，免疫细胞则是这个防卫部队中的战斗员。

老年人因为免疫细胞削减，免疫细胞活性下降，抗病才调下降，因而容易发生肿瘤和其它疾病。免疫功用阑珊是变老的重要标志之一，而干细胞移植能够有用跋涉人的免疫功用，因而，干细胞移植是保护人身体健康和变老的较有用实施之一。

诱导性多能干细胞的新方法

研究人员用来产生诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的方法既花时间而且效率又低。按照当前的方法，当把四种转录因子导入成体细胞如皮肤细胞中时，利用上千个皮肤细胞最终只能获得几个iPSCs。为此，在这项新的研究中，来自美国桑福德-伯纳姆医学研究所(Sanford-Burnham Medical Research Institute)的研究人员寻求激酶抑制剂的帮助，其中这些抑制剂阻断激酶---一类在细胞通信、存活和生长等方面发挥着重要作用的酶---的活性。他们发现几个激酶抑制剂当加入到起始细胞(如皮肤细胞)时，有助于产生比标准方法还要多的iPSCs。这些发现将可能加快很多领域的研究，和更好地能够让全世界的科学家们研究人类疾病和开发出新的治疗方法。相关研究结果于9月25日刊登在Nature Communications期刊上。
论文通信作者Tariq Rana博士解释道，“获得iPSCs依赖于调节细胞内的通信网络。因此，当开始操作细胞中哪些基因开启或关闭来产生多能性干细胞时，人们很可能激活了许多激酶。因为许多活性的激酶可能抑制iPSCs产生，所以对我们而言，加入激酶抑制剂来降低这种障碍可能就有意义。”
根据未参与这项研究的沙克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)癌症中心主任Tony Hunter博士的说法，鉴定出改善产生iPSCs效率的小分子为在治疗上能够使用这些细胞迈出重要的一步，而且Tariq Rana的这项新研究发现了一类蛋白激酶抑制剂能够有效地促进iPSCs形成，因此这些抑制剂在产生用于实验研究和治疗目的的iPSCs中应当是非常有用的。
在这项研究中，Rana实验室研究生Zhonghan Li着手寻找可能加快产生iPSCs过程的激酶抑制剂。利用斯坦福-伯纳姆医学研究所康拉德-普利贝斯化学基因组中心(Conrad Prebys Center for Chemical Genomics)提供的240多种抑制激酶的化合物，Li费力地将它们一个接一个地加入到他培养的细胞中然后等待观察会有什么发生。几种激酶抑制剂产生更加多的iPSCs，在某些情形下，对于培养它们的小盘子而言，能够产生太多的iPSCs。特别地，最为强效的抑制剂靶向三种激酶：AurkA、P38和IP3K。
在其他同事的帮助下，Rana和Li还证实了这些发现的特异性，甚至确定了一种抑制剂发挥有益作用背后的机制。
Rana说，“我们发现操纵这些激酶的活性能够显著性地增加细胞重编程效率。不过，更重要的是，我们也对重编程的分子机制提供了新的深入认识，并且揭示出这些激酶的新功能。我们希望这些发现将促进人们进一步筛选可能在iPSC疗法中有用的小分子。”

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