俄学者从末代沙皇血衣中分离出dna,迷案或解开(基因工程史上的伟人？？！)

俄学者从末代沙皇血衣中分离出dna,迷案或解开

据俄罗斯媒体援引斯维尔德罗夫斯克州法医鉴定机构负责人涅沃林的话说，该机构专家从收藏在圣彼得堡埃尔米塔日(冬宫)博物馆的一件“血衣”上成功获取了尼古拉二世的血液样本，并在分子-遗传基因实验室进行了化验分析。该法医鉴定局从中成功分离出了末代沙皇的dna，并获得了完整的遗传图谱，它由十三个人类dna检测位点和十五个取自y染色体的男性dna位点组成。

专家称，他们近期计划把分离出来的dna与一九九一年在叶卡捷琳堡发现的尼古拉二世遗骨中提取的dna样本进行比对。

据悉，这件衬衣正是尼古拉二世一八九一年遭遇“大津刺杀事件”时穿的。当时身为皇储的尼古拉二世在日本访问时，被一名日本警察用军刀刺伤头部，虽无性命危险，但是尼古拉二世却也血溅衬衣。正是这件日后封存在博物馆的“血衣”成为又一关键证物。

沙皇尼古拉二世是罗曼洛夫王朝最后一任统治者。“十月革命”爆发后，尼古拉二世被迫退位，此后沙皇全家被苏维埃政府转辗囚禁在叶卡捷琳堡。一九一八年沙皇全家被当地政府秘密处决，遗体被行刑人员运到郊外密林中焚烧掩埋。

上世纪九十年代初，沙皇一家的遗体被重新找到，并经dna检测确认。只有皇储阿列克谢和公主玛丽娅的遗骸未被发现。一九九八年，根据叶利钦的命令，沙皇一家的遗体被隆重安葬在圣彼得堡的彼得-保罗要塞教堂中。

今年七月，在尼古拉二世全家遭处决九十周年之际，俄罗斯政府宣布，经三家独立的试验室dna检测证实，去年在叶卡捷琳堡新发现的两具遗骸属于尼古拉二世的子女。

至此，这桩上世纪俄国最大的迷案有望逐步撩开面纱。

基因工程史上的伟人？？！

K.Mullis 和 PCR的故事
前言：在某个年代的美国，实验室里可以狎妓，嬉皮士可以拿学位，《自然》杂质也很水，凡错误越多，成功也就越近，当然假设是正确率一定，而错误多说明尝试次数也很多。
天晓得这家伙是不是找到了自己的内心……

末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影《侏罗纪公园》，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？答案是没有。只不过近十几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR）。

PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

PCR的原理及做法其实不难，它利用DNA双链复制的原理，将一条DNA序列不断加以复制，使其数量以几何级数方式增加，就可用来做定性的分析及各式各样的应用。DNA双螺旋结构于1953年发现，自此确立了它就是细胞里携带遗传信息的分子。第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶（polymerase，即PCR之P），也早在1956年分离成功。几十年来，在试管内复制DNA已是许多实验室的例行工作，但就是没有人想到以PCR 方法大量复制DNA，就算想到也不认为可行，直到1983年。

DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成单股，等温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白质，在高温下会失去活性。这也是之前的研究人员不认为这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中，以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进行复制，也跟大海捞针差不多，这是另一个让人却步的理由。

PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯在好些写作中，包括1990年在《科学美国人》上的一篇文章，及1998年的自传《心灵裸舞》（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR这个构想的起源。然而，PCR从构想到实现，真的就是穆里斯一人之功吗？PCR究竟是在什么样的环境下诞生的呢？

穆里斯的出身是生物化学家，1972在加州大学伯克利分校取得博士学位，专长有机合成。一早他就表现出桀骜不驯的性格，在那嬉皮的年代，吸食自制的迷幻药不算太稀奇，穆里斯也乐于此道。更让人难以想象的是，他在经历迷幻药之旅的过程中，居然想出了某个解释大爆炸宇宙学的理论，写了出来投稿到《自然》周刊，居然登了出来。他也因此通过了博士资格考试，因为有文章发表在《自然》周刊的教授已然不多，学生更是少见。至于他的博士论文，也是用“带点幽默的口语化写成”（穆里斯自己的说法），要不是宽容的指导老师帮他讲话，只怕要重写。

穆里斯另一个毫不掩饰的爱好是女人，这也给他的生涯带来许多转折。博士学位到手后，他随着新婚的第二任妻子来到堪萨斯州，因妻子的关系进了该州的医学院就读，他也在那儿的心脏科找到与其学位并不相称的工作。不久他就感到厌恶，因为实验需要宰杀许多老鼠。1975年，他与妻子仳离，又与后来的第三任妻子回到加州湾区，在第一任妻子所有的一家糕饼店当了近两年的经理。1977年，才又回到旧金山加州大学医学院的药物化学实验室，走的仍然不是学术的正途，也同样在不久以后，对新工作感到厌烦。

1979年，穆里斯进了湾区一家名叫“西特斯”（Cetus）的私人生物技术公司任职。当年，生物技术公司还处于萌芽阶段，很少学术界人士愿意离开象牙塔的庇荫到私人企业工作。就算是到有规模的大药厂，同样也得不到多数同行的认可与祝福，认为是学术生涯的终点。然而西特斯却是一个极为特殊的所在，这家公司集结了一批有能力、有梦想的科学家，在自由开放的风气下，共同朝既定的目标前进。这和一般学院里各大教授及实验室的主持人关起门来各行其是的做法，相当不同。西特斯聘用穆里斯，是想借重他有机化学合成的专长，负责合成寡核苷酸（短链的DNA分子），以供实验所需。

自1970年代起，由于发现选择性切割及接合DNA分子的限制性内切酶，可将DNA分子加以重组，因此引发了基因工程的开展，才出现生物技术这个产业。于是，西特斯公司从1970年代以制造维生素及抗生素为主的公司转型，进入1980年代以基因产品为主的研发。生长激素、胰岛素、凝血因子、干扰素、白介素等，都是西特斯的研发对象。1981年，西特斯正式成为上市公司，筹措到大笔资金。

穆里斯就是在这股氛围下进入西特斯的。其实他做的工作，不算什么研究，只是设法改进寡核苷酸合成的效率而已。穆里斯花了很多时间玩当时刚流行的个人电脑（还不是IBM的），也经常提出古怪的想法，其中大部分都是错的。他争强好斗、不接受批评的个性，也令他到处结怨。他在工作单位与异性的关系，更惹出许多麻烦，甚至要劳动主管出面解决。1981年，他升任寡核苷酸合成部门的主管。为了提高产量及节省时间，他省略了品质管理的步骤，引起使用单位的不满，声称品质不佳的寡核苷酸使得他们的研究出现问题，穆里斯则反击说是使用单位本身的能力不足所致。

PCR的点子，也就是在这样的情况下诞生的。根据穆里斯自己的说法，那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。在“顿悟” 之后的三到五个月间，穆里斯并没有任何行动，原因如今也不清楚。该年8月，穆里斯首次在公司里正式作了有关PCR原理的报告，听者反应冷淡。一来，大家已经习惯了他的胡思乱想；再者，多数人的想法是，这个原理太简单了，如果可行的话，一定早有人做过，否则，里头一定有它不可行之处，但也没有人明确说得出来，为什么不可行。

于是，穆里斯得着手证明这个构想的可行性。从1983年9月起，穆里斯陆续进行了一些实验，换过几个DNA模板，也尝试不同的加热、降温周期，结果都不够肯定，顶多只在电泳凝胶上形成一条若有若无的线条，未能说服旁人PCR发挥了增幅的功效。1984年6月，穆里斯在公司又因男女关系惹出事端，引起众怒，濒临被开除的命运。结果是引荐他进入公司的上司为他说情，只免除了他的主管职务，并予转组，同时限定他在一年内把PCR建立起来。

任何研究方法从概念提出到实际应用之间，所需投入的精力与时间，大多为一般人所低估。由于穆里斯本身没有分子生物学的训练，公司派了技术员协助，前后一共有三位。这些人在PCR的发展上，发挥了重要的作用。1984年11月，穆里斯的技术员首次取得可信的结果，证明了PCR的可行。于是在1985年初，公司决定让技术精湛的日裔技术员才木（Randall Saiki）加入工作，这是一项正确的决定。在自动化的仪器出现之前，PCR是个劳动密集型的实验方法，需要长时间的反复操作，手脚不利落的人是做不来的。才木的结果则干净漂亮，让人无从置疑。

到了1985年春天，西特斯的高级主管已经对PCR的潜力信服，也开始担心消息外泄（穆里斯自己是个大嘴巴），而让旁人取得先机。3月里，他们送出了第一个专利申请，也准备在10月举行的美国遗传学会年会上报告成果，但之前必须将正式的论文写好投送才保险。他们决定写两篇文章，一篇关于PCR的理论，由穆里斯执笔先行发表，第二篇则集中在PCR的应用上，以才木的实验结果为主，随后推出。结果整个夏天，穆里斯都在玩电脑，一再拖延论文的写作。到9月下旬另一篇应用文章写好投送时，穆里斯还没有动静。因此，第一篇提到PCR这个方法的论文，于1985年12月20日发表在《科学》周刊上，共有七位作者，才木排头名，穆里斯则排第四。

到了该年12月，穆里斯才将论文写好，并投给《自然》周刊。但穆里斯忘了附上一封给编辑的信，当然也就没有说明该文与《科学》周刊上的那篇有何不同，结果遭到退稿。震惊之余，他转投《科学》周刊，并由西特斯的主管帮助写了封信给编辑，结果仍然遭到退稿。这时，穆里斯把怒气转向公司，认为那是公司的阴谋，想要窃取他发明PCR的功劳。科学发明的优先权及功劳之争，科学史上可谓不绝于书，也常是公婆都有些道理，不细察背景与经过，只凭后人记载的片言只语，是很难了解真相的。至于PCR的概念是穆里斯的结晶，没有什么人有异议，只不过将概念实现的过程，就复杂得多了。

穆里斯的文章两度遭退稿后，公司里有人建议投给《酶学方法》（Methods of Enzymology），主要是因为有人与该刊主编吴瑞相熟，较好沟通，同时PCR的性质也适合该强调方法学的刊物。于是，穆里斯的文章终于得到发表，只不过整整晚了一年，到1987年初才问世。这篇文章只有穆里斯及另一位技术员两人挂名。

为了表示他们并无意争功，西特斯的主管向冷泉港实验室的沃森（DNA双螺旋结构的发现人之一）推荐穆里斯在1986年5月举行的“人类分子生物学”专题研讨会中，报告PCR的原理及实际应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，分子生物学界有头有脸的人也都在场。结果他表现不错，建立了往后人们的印象： PCR是穆里斯一手发明的。冷泉港专题研讨会的专刊于1986年底出版，还在《酶学方法》的文章之前，穆里斯挂头名。

自此，PCR之名及其强大的应用性就广为人知了。然而，将PCR变成真正成熟技术的临门一脚，则是耐高温DNA聚合酶的引进。

先前提到，PCR的操作过程中，需要反复加热与降温的步骤，而前一次循环所使用的大肠杆菌DNA聚合酶在高温下就变性了，因此在每一次冷热循环之后，都要加入新鲜的聚合酶。这个做法不但烦琐，并且昂贵。按当时的价格，一次循环所需的聚合酶值1美元，30个循环下来就是30美元，循环更多次就更不得了。因此，1986年春，穆里斯首度提出使用耐高温酶的想法。经过文献搜寻，果然找到了两篇有关文献，较早的一篇是在美国做的，另一篇则是俄国科学家的成果，以俄文发表。

第一篇报道分离耐高温DNA聚合酶的工作，是一位来自台湾的年轻科学家初试啼声之作。1973年，钱嘉韵随着留学热潮到俄亥俄州的辛辛那提大学生物系就读。她的指导老师崔拉（J. Trela)对一种黄石公园的热泉里发现的嗜热菌（Thermus aquaticus）感到好奇，就让钱及另一位美国学生以该细菌为论文研究的主题。在另一位老师的指导下，钱学会了从细胞中分离蛋白质，成功分离出该细菌耐高温的Taq DNA聚合酶。

1975年获硕士学位后，钱转往衣阿华州立大学取得神经生物学博士学位，1982年回到阳明医学院神经科学研究所任教，至今已满20年。那篇历史性作品，发表于1976年的《细菌学杂志》（Journal of Bacteriology），她是第一作者，只不过用了英文名字Alice，再加上她后来挂了夫姓（Chang），以至没有太多人知道，该篇被广为引用的文章的作者A. Chien就是钱嘉韵。

穆里斯虽然提出将Taq DNA聚合酶应用到PCR的建议，但当时并没有现成的可用，他得想办法自己分离。西特斯有全套分离蛋白质的装备，也有人愿意指导，但穆里斯是个拖延成性的人。等了几个月后，公司其他人只有自己动手，按着先前钱等人发表的步骤，三个星期就分离出纯化的Taq DNA聚合酶。1986年6月，才木首度将其应用于PCR，效果就好得惊人，可说是一战成功。Taq DNA聚合酶不但大大简化了PCR工作，同时专一性及活性都比之前使用的酶更强，背景杂讯也几乎都消除了。自此，PCR取得了完全的成功。

穆里斯与西特斯的关系此后更加恶化，他完全不认为自己在发表文章的过程中有任何疏失，并要求未来五年内有关PCR发表的文章，都由他挂头名。他还在公开场合批评公司其他人士。终于，穆里斯于1986年9月离开了西特斯。西特斯给了他五个月的薪水及一万美元奖金，但按产业惯例，PCR的专利权属于西特斯公司。

离开西特斯后，穆里斯继续担任过一些生物技术公司的顾问，但再没有发表过一篇正式论文。以他的说法，PCR就是他一人发明的，得了诺贝尔奖的肯定后，也更听不到太多其他的声音。1991年12月，霍夫曼罗氏药厂据称以三亿美元购得了西特斯的PCR技术专利，西特斯公司也走进了历史。直到最近几年，由于之前钱嘉韵等人已经发表的工作，Taq DNA聚合酶的专利权遭到挑战，连带使PCR的专利也受到影响，不过那又是另外一个故事了。

DNA指纹技术应用了什么原理？

DNA指纹技术原理：

一般要通过以下几点来完成：

1、将送检的各种生物学检样，如毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等，把其中所含的DNA 提取出来。

2、选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNA 位置上加以切割，使分子量很大的DNA 长链切短成许多长度不同的小片段。

3、在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNA 片段进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。

4、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNA 片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，使这些单链DNA

片段印溃(blot-ting)，转移并永久性地固定在尼龙膜上。

5、让放射性DNA探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行分子杂交。

6、用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会发出X 射线使胶片曝光，从而使杂交有探针的长度不同的DNA片段位置显影在胶片上。这样的特征

DNA片段条状图谱，便是所谓的DNA指纹。

1 DNA指纹图的建立及发展

近百年来的研究认为，任何遗传分析都是以遗传标志为基础的，而任何一个遗传标志的价值又在于其变异 性(即多态性)的大小。有关遗传多态性的研究对促进人类学、遗传学、免疫学以及法医学的发展， 以及对阐明某些疾病的发病机理乃至协助诊断等方面都起了十分重要的作用。但以往的研究都是利用各种外部表现型、生理缺陷型、同工酶、多态蛋白等作为遗传标志，用间接分析来推论相应的遗传基因。

70年代末，限制性内切酶和重组体DNA技术的出现以及分子生物学的飞速发展，使人们对遗传标志的研究转向DNA分子本身。由于各种遗传信息都蕴藏在DNA分子上，生物个体间的差异在本质上是DNA分子的差异，因此DNA被认为是最可靠的遗传标志。某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变来反映，此即限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP),其产生是由于点突变、DNA重排、插入或缺失引起的〔1〕。随着对RFLP研究的深入，人们发现了基因组中最有变异性的一类序列——高变异DNA序列，使DNA遗传标志的发展和应用得到了一次飞跃。
1980年，Wyman和White描述了第一个多等位性的具有高度多态性的人类DNA标志。不久，在胰岛素基因(Insulingene)的5′端区域、致癌基因(C-Haras I Oncogene)的3′端分别发现了相同的高度可变的标志(hypervariable marker)。在α-球蛋白(α-globin)基因群周围还发现了其它三个标志〔2〕。1982年，Bell等〔3〕证实：这些高度多态性区域串联着重复的短序列单位，重复单位数目的差异导致了这种高度的可变性，由于这些结构特征，人们称这些区域为小卫星(minisatellite)或高度可变区域(hypervariable)或可变数目的串联重复(variable number of tandem repeats)。
1985年，Jeffreys 等〔4〕用肌红蛋白基因第一内含子中的串联重复序列(重复单位含33bp)作探针，从人的基因文库中筛选出8个含有串联重复序列(小卫星)的重组克隆。序列分析表明，这8个小卫星重复单位的长度和序列不完全相同，但都有相同的核心序列(core sequence)即GGCCAGGA/GGG。他们先后用两个多核心小卫星(poly coreminisate
-llite)33.6和33.15探针进行southern杂交，在低严谨条件下杂交得到了包含10多条带的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置就象人的指纹一样千差万别，Jeffrey称之为DNA指纹(DNA fingerprint)〔5〕，又名遗传指纹(genetic fingerprint)。
RFLP DNA指纹分析技术由于方法繁杂、周期长、实验条件高等缺陷而无法大范围推广。1990年，Williams等〔6〕首次报道了AP-PCR技术，Welsh和McCelland〔7〕亦独立地进行了这方面的工作，从而使DNA指纹技术应用更加广泛。AP-PCR技术是采用随意设计的1个或2个引物，对模板DNA进行PCR扩增，一般先是在低严格条件，即在高Mg2+浓度(大于传统PCR Mg2+浓度1.5mmol/L)、较低退火温度(36℃～50℃)下进行1～6个循环的PCR扩增，随后在严格条件下进行PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳或6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可得到DNA指纹图谱。其基本原理是：在低严格复性条件下，引物与模板DNA非完全互补序列形成错配，错配引物在DNA聚合酶作用下沿模板链延伸，合成新链，当在一定距离内模板DNA另一单链也发生引物错配时，即可对两错配引物间的DNA进行扩增。但是此种错配并非随机发生，引物和模板间，特别是在引物3′端必须存在一定的互补序列，即可产生不同的扩增片段或组合，通过DNA指纹图谱，可得到配对DNA样品中的差异片段，用于克隆、测序、染色体定位和基因片段的生物学功能研究。
我国杨建厂等〔8〕利用PCR的原理成功地建立了一种全新的DNA指纹检测技术，称之为随机引物PCR人DNA指纹检测技术(arbitrarily primed PCR human DNA fingerprinting,APHDP)，此外还开发出处理DNA指纹数据应用软件，应用于个人识别、遗传素质与疾病的相关特征研究等。

2 DNA指纹技术所用的探针

自DNA指纹技术建立以来，这一技术迅速在动植物的进化关系、亲缘关系分析以及法医学方面得到广泛应用。也正是由于DNA指纹技术在核酸分析中显示出了强大的生命力，因而许多学者围绕此技术所用的探针作了大量的工作，除Jeffrey等〔5〕的探针外，用人工化学合成或从生物组织中提取后再扩增的办法生产出了一批高水平的探针。迄今，在DNA指纹技术中所用的探针大概有probe33.15、33.6〔5〕、bacteriophage MB〔9〕、pig repetitire clone p83、PGB 725、poly(GT) containing 18.1、(GTG)5/(CAC)5〔10，11〕、(CAC/TA)4及(GT)12等。同时，在探针的标志上也有了很大的发展，根据它们的结构可大致分为小卫星探针和简单重复序列探针，简单重复序列包括微卫星探针(microsatellite probe)和寡聚核苷酸探针。小卫星探针的核心序列为33bp，常定位在人常染色体前的末端(proterminal)区域，微卫星探针则在10～20bp之间，而寡聚核苷酸探针在10bp以下，普遍散布在人类整条染色体上，或者在基因间区域或者位于内含子内。
1988年，我国伍新尧等〔12〕根据DNA指纹是人基因组中重复序列的RFLP的原理和人与鼠的髓鞘碱性蛋白(MBP)基因cDNA同源序列性高于90%的事实，选用鼠MBP cDNA3′端的一段序列(非表达区高度重序列，与人基因组中该类重复序列几乎完全同源)，长度为0.81kb的片段作探针，检测用HaeⅢ酶解的人DNA限制性片段(RF)，在人群中可分出22条谱带，受检 的30例无血缘关系的个体之间没有两个人的谱带是完全相同的，显示这一方法的高度个体特异性，这是国内首次用自已的力量找到DNA指纹的探针。

3 DNA指纹的应用3.1 法医学方面 同以往的血型测定法相比，DNA指纹技术在法医学领域上具有无可比拟的优越性。已成为鉴定犯罪、亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的工具〔5，13〕。随后，国内学者李伯龄〔14〕、姜先华〔15〕、伍新尧等〔12〕也先后对此项技术进行了研究，并应用于实际案件的鉴定中，解决了过去无法解决的疑难案例，如微量血痕、部分腐败的碎尸块的个人认定等。
3.2 在动植物科学中的应用
3.2.1 生物种群学研究 利用DNA指纹图可以估算连锁不平衡，比较等位基因的频率，还能估计不同个体之间的重组率，在种群学研究上有助于建立某一个体在种群中的地位和关系，特别是对真菌的种群研究，有很多真菌可以通过有性和无性的方式繁殖，但是何时以何种方式繁殖，程度如何，并不清楚，而利用DNA指纹图就能区分以有性和无性方式产生的后代，并能确定某一区域真菌的自然分布〔1，16〕。
3.2.2 测定物种之间的遗传距离、物种分类鉴定 Jeffreys等〔5〕认为在一个群体的不同成员间拷贝数的串联重复序列(VNTR)由于多态性程度高，在遗传分析中尤其适合作为多态性标志，简单重复的不稳定性可导致VNTR长度的迅速变化，根据家族中或育种群体中VNTR的分离重组频率，可以测定出遗传距离，可用统计学公式确定个体间的亲缘关系：D=2Nab/(Na+Nb),，D值越大，亲缘关系越近，遗传距离就越小；D值越小，亲缘关系越远，遗传距离就越大。为此，运用DNA指纹技术可检测不同物种、同种及同种不同个体的亲缘关系，用于物种分类鉴定，也可用于杂交后代亲本决定，杂交后代群体分开，检测近等基因系(或同类系)种的多态性，并对检测基因进行定位。Welsh等〔7〕对布氏疏螺旋体菌株的DNA指纹进行分析，发现这种lyme病的病原菌实际上是由三个不同的种群组成。罗超权等〔12〕运用AP-PCR鉴定弓形虫虫株，在国内开创了运用DNA指纹技术作生物分类的先例。
3.3 在流行病学方面的运用 由于DNA指纹具有以下几个特点：①能反映基因组的变异性；②具有高度的变异性；③具有简单的稳定的遗传性；④DNA指纹谱具有体细胞稳定性。所以，它同一般的流行病学方法相比较而言，具有无比的优越性，使其成为流行病调查的一种有效工具。Jan DA等〔17〕，Denise Chevrel-Dellagi等〔18〕运用IS6110序列作探针对结核病分支杆菌株进行DNA指纹分析，调查国际间结核病的种型、分析流行情况，改进了控制结核病的方法。而ZhenHua Yang等〔19〕从67个病人中分离出结核病分支杆菌株进行DNA指纹分析，发现分离到PTBN12型时易查明流行环节，从而为快速进行疾病控制提供了一个有力证据。在我国，童笑梅等〔20〕采用随机扩增多态DNA指纹图技术对医院内感染的14例新生儿进行病原流行病学分析，发现患儿体内携带的与医务人员鼻中携带的华纳葡萄球菌菌株的DNA指纹图完全一致，从而证明此次感染的病原菌为华纳葡萄球菌，传染源是携带病菌的医务人员。郭永建等〔21〕在6个月内对121名产科新生儿中的30名检出的31株铜绿假单胞菌进行RAPD指纹图谱分析和血清学分型，结果表明，铜绿假单胞菌在产科新生儿中暴发流行，0∶6/R∶1型为暴发流行性菌株，对医院感染病原菌分型、精确确定传染源、阻断传播途径、控制和预防医院感染具有重要的指导意义。
3.4 疾病诊断及治疗 鉴于DNA指纹所具有的上述特点，故DNA指纹广泛应用于一些疾病的诊断及治疗。Morral〔22〕等发现CF基因9号外显子侧翼含有一小卫星区，且此等位基因2.6带常与△F508连锁，相伴率为50.6%、41.6%，△F508是最主要的致病突变，可疑患者电泳图只要发现2.6等位基因，就可对此病进行初步诊断。现已在Wilson病、外周神经纤维瘤、成人多束肾、多巴性肌紧张、Frecbreich共济失调、Kallmunm综合征性连锁、视网膜病等基因内或旁侧发现有高度的小卫星区域，从而可进行基因诊断。Okamoto R〔23〕用DNA指纹法预测慢性粒cell性白血病骨髓移植术后复发，取得了成功。
3.5 肿瘤的研究 肿瘤是多因素、多阶段的变化过程，病因复杂、变化多样，但归根到底还是在DNA的变化上。一般说来，癌组织、转移灶与正常组织或外周血细胞DNA指纹有差别，常见的是某条带或几条带的缺失，某一条或某几条带密度降低，或者癌组织中出现新的带。Thein等〔24〕用33.6和33.15为探针研究患者DNA指纹谱变化，发现胃肠肿瘤患者癌组织DNA指纹谱全有改变，并认为体细胞突 变还有种属特异性。刘霜等〔25〕应用RAPD(随机扩增多态性DNA)分析技术对6例肝癌患者的癌组织与非癌组织进行分析，发现所有肝癌组织基因组DNA的RAPD指纹图谱均存在差异，其中3例配对肝癌基因组中均存在一相同的0.9Kb的随机扩增片段。杨建厂等〔8〕用APHDFF技术对28例确诊为鼻咽癌病人血DNA指纹图的检测，发现有3条DNA片段出现的频率明显低于健康人群。王黛等〔26〕用LE11.8、MYO和Mb探针，经Southern杂交法检测12例儿童急性粒cell白血病患者的外周血或骨髓细胞的基因重排，结果发现初始或复发与完全缓解时的DNA指纹图相比，谱带有增加或减少，从而认为急性粒细胞白血病患儿的白血病细胞存在基因重排。

请教DNA指纹鉴定的实验怎么做，急

一般要通过以下几点来完成：

1、将送检的各种生物学检样，如毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等，把其中所含的DNA 提取出来。

2、选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNA 位置上加以切割，使分子量很大的DNA 长链切短成许多长度不同的小片段。

3、在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNA 片段进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。

4、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNA 片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，使这些单链DNA

片段印溃(blot-ting)，转移并永久性地固定在尼龙膜上。

5、让放射性DNA探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行分子杂交。

6、用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会发出X 射线使胶片曝光，从而使杂交有探针的长度不同的DNA片段位置显影在胶片上。这样的特征DNA片段条状图谱，便是所谓的DNA指纹。

再附送一点DNA的科普知识：

1 DNA指纹图的建立及发展

近百年来的研究认为，任何遗传分析都是以遗传标志为基础的，而任何一个遗传标志的价值又在于其变异 性(即多态性)的大小。有关遗传多态性的研究对促进人类学、遗传学、免疫学以及法医学的发展， 以及对阐明某些疾病的发病机理乃至协助诊断等方面都起了十分重要的作用。但以往的研究都是利用各种外部表现型、生理缺陷型、同工酶、多态蛋白等作为遗传标志，用间接分析来推论相应的遗传基因。

70年代末，限制性内切酶和重组体DNA技术的出现以及分子生物学的飞速发展，使人们对遗传标志的研究转向DNA分子本身。由于各种遗传信息都蕴藏在DNA分子上，生物个体间的差异在本质上是DNA分子的差异，因此DNA被认为是最可靠的遗传标志。某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变来反映，此即限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP),其产生是由于点突变、DNA重排、插入或缺失引起的〔1〕。随着对RFLP研究的深入，人们发现了基因组中最有变异性的一类序列——高变异DNA序列，使DNA遗传标志的发展和应用得到了一次飞跃。
1980年，Wyman和White描述了第一个多等位性的具有高度多态性的人类DNA标志。不久，在胰岛素基因(Insulingene)的5′端区域、致癌基因(C-Haras I Oncogene)的3′端分别发现了相同的高度可变的标志(hypervariable marker)。在α-球蛋白(α-globin)基因群周围还发现了其它三个标志〔2〕。1982年，Bell等〔3〕证实：这些高度多态性区域串联着重复的短序列单位，重复单位数目的差异导致了这种高度的可变性，由于这些结构特征，人们称这些区域为小卫星(minisatellite)或高度可变区域(hypervariable)或可变数目的串联重复(variable number of tandem repeats)。
1985年，Jeffreys 等〔4〕用肌红蛋白基因第一内含子中的串联重复序列(重复单位含33bp)作探针，从人的基因文库中筛选出8个含有串联重复序列(小卫星)的重组克隆。序列分析表明，这8个小卫星重复单位的长度和序列不完全相同，但都有相同的核心序列(core sequence)即GGCCAGGA/GGG。他们先后用两个多核心小卫星(poly coreminisate
-llite)33.6和33.15探针进行southern杂交，在低严谨条件下杂交得到了包含10多条带的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置就象人的指纹一样千差万别，Jeffrey称之为DNA指纹(DNA fingerprint)〔5〕，又名遗传指纹(genetic fingerprint)。
RFLP DNA指纹分析技术由于方法繁杂、周期长、实验条件高等缺陷而无法大范围推广。1990年，Williams等〔6〕首次报道了AP-PCR技术，Welsh和McCelland〔7〕亦独立地进行了这方面的工作，从而使DNA指纹技术应用更加广泛。AP-PCR技术是采用随意设计的1个或2个引物，对模板DNA进行PCR扩增，一般先是在低严格条件，即在高Mg2+浓度(大于传统PCR Mg2+浓度1.5mmol/L)、较低退火温度(36℃～50℃)下进行1～6个循环的PCR扩增，随后在严格条件下进行PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳或6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可得到DNA指纹图谱。其基本原理是：在低严格复性条件下，引物与模板DNA非完全互补序列形成错配，错配引物在DNA聚合酶作用下沿模板链延伸，合成新链，当在一定距离内模板DNA另一单链也发生引物错配时，即可对两错配引物间的DNA进行扩增。但是此种错配并非随机发生，引物和模板间，特别是在引物3′端必须存在一定的互补序列，即可产生不同的扩增片段或组合，通过DNA指纹图谱，可得到配对DNA样品中的差异片段，用于克隆、测序、染色体定位和基因片段的生物学功能研究。
我国杨建厂等〔8〕利用PCR的原理成功地建立了一种全新的DNA指纹检测技术，称之为随机引物PCR人DNA指纹检测技术(arbitrarily primed PCR human DNA fingerprinting,APHDP)，此外还开发出处理DNA指纹数据应用软件，应用于个人识别、遗传素质与疾病的相关特征研究等。

2 DNA指纹技术所用的探针

自DNA指纹技术建立以来，这一技术迅速在动植物的进化关系、亲缘关系分析以及法医学方面得到广泛应用。也正是由于DNA指纹技术在核酸分析中显示出了强大的生命力，因而许多学者围绕此技术所用的探针作了大量的工作，除Jeffrey等〔5〕的探针外，用人工化学合成或从生物组织中提取后再扩增的办法生产出了一批高水平的探针。迄今，在DNA指纹技术中所用的探针大概有probe33.15、33.6〔5〕、bacteriophage MB〔9〕、pig repetitire clone p83、PGB 725、poly(GT) containing 18.1、(GTG)5/(CAC)5〔10，11〕、(CAC/TA)4及(GT)12等。同时，在探针的标志上也有了很大的发展，根据它们的结构可大致分为小卫星探针和简单重复序列探针，简单重复序列包括微卫星探针(microsatellite probe)和寡聚核苷酸探针。小卫星探针的核心序列为33bp，常定位在人常染色体前的末端(proterminal)区域，微卫星探针则在10～20bp之间，而寡聚核苷酸探针在10bp以下，普遍散布在人类整条染色体上，或者在基因间区域或者位于内含子内。
1988年，我国伍新尧等〔12〕根据DNA指纹是人基因组中重复序列的RFLP的原理和人与鼠的髓鞘碱性蛋白(MBP)基因cDNA同源序列性高于90%的事实，选用鼠MBP cDNA3′端的一段序列(非表达区高度重序列，与人基因组中该类重复序列几乎完全同源)，长度为0.81kb的片段作探针，检测用HaeⅢ酶解的人DNA限制性片段(RF)，在人群中可分出22条谱带，受检 的30例无血缘关系的个体之间没有两个人的谱带是完全相同的，显示这一方法的高度个体特异性，这是国内首次用自已的力量找到DNA指纹的探针。

3 DNA指纹的应用3.1 法医学方面 同以往的血型测定法相比，DNA指纹技术在法医学领域上具有无可比拟的优越性。已成为鉴定犯罪、亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的工具〔5，13〕。随后，国内学者李伯龄〔14〕、姜先华〔15〕、伍新尧等〔12〕也先后对此项技术进行了研究，并应用于实际案件的鉴定中，解决了过去无法解决的疑难案例，如微量血痕、部分腐败的碎尸块的个人认定等。
3.2 在动植物科学中的应用
3.2.1 生物种群学研究 利用DNA指纹图可以估算连锁不平衡，比较等位基因的频率，还能估计不同个体之间的重组率，在种群学研究上有助于建立某一个体在种群中的地位和关系，特别是对真菌的种群研究，有很多真菌可以通过有性和无性的方式繁殖，但是何时以何种方式繁殖，程度如何，并不清楚，而利用DNA指纹图就能区分以有性和无性方式产生的后代，并能确定某一区域真菌的自然分布〔1，16〕。
3.2.2 测定物种之间的遗传距离、物种分类鉴定 Jeffreys等〔5〕认为在一个群体的不同成员间拷贝数的串联重复序列(VNTR)由于多态性程度高，在遗传分析中尤其适合作为多态性标志，简单重复的不稳定性可导致VNTR长度的迅速变化，根据家族中或育种群体中VNTR的分离重组频率，可以测定出遗传距离，可用统计学公式确定个体间的亲缘关系：D=2Nab/(Na+Nb),，D值越大，亲缘关系越近，遗传距离就越小；D值越小，亲缘关系越远，遗传距离就越大。为此，运用DNA指纹技术可检测不同物种、同种及同种不同个体的亲缘关系，用于物种分类鉴定，也可用于杂交后代亲本决定，杂交后代群体分开，检测近等基因系(或同类系)种的多态性，并对检测基因进行定位。Welsh等〔7〕对布氏疏螺旋体菌株的DNA指纹进行分析，发现这种lyme病的病原菌实际上是由三个不同的种群组成。罗超权等〔12〕运用AP-PCR鉴定弓形虫虫株，在国内开创了运用DNA指纹技术作生物分类的先例。
3.3 在流行病学方面的运用 由于DNA指纹具有以下几个特点：①能反映基因组的变异性；②具有高度的变异性；③具有简单的稳定的遗传性；④DNA指纹谱具有体细胞稳定性。所以，它同一般的流行病学方法相比较而言，具有无比的优越性，使其成为流行病调查的一种有效工具。Jan DA等〔17〕，Denise Chevrel-Dellagi等〔18〕运用IS6110序列作探针对结核病分支杆菌株进行DNA指纹分析，调查国际间结核病的种型、分析流行情况，改进了控制结核病的方法。而ZhenHua Yang等〔19〕从67个病人中分离出结核病分支杆菌株进行DNA指纹分析，发现分离到PTBN12型时易查明流行环节，从而为快速进行疾病控制提供了一个有力证据。在我国，童笑梅等〔20〕采用随机扩增多态DNA指纹图技术对医院内感染的14例新生儿进行病原流行病学分析，发现患儿体内携带的与医务人员鼻中携带的华纳葡萄球菌菌株的DNA指纹图完全一致，从而证明此次感染的病原菌为华纳葡萄球菌，传染源是携带病菌的医务人员。郭永建等〔21〕在6个月内对121名产科新生儿中的30名检出的31株铜绿假单胞菌进行RAPD指纹图谱分析和血清学分型，结果表明，铜绿假单胞菌在产科新生儿中暴发流行，0∶6/R∶1型为暴发流行性菌株，对医院感染病原菌分型、精确确定传染源、阻断传播途径、控制和预防医院感染具有重要的指导意义。
3.4 疾病诊断及治疗 鉴于DNA指纹所具有的上述特点，故DNA指纹广泛应用于一些疾病的诊断及治疗。Morral〔22〕等发现CF基因9号外显子侧翼含有一小卫星区，且此等位基因2.6带常与△F508连锁，相伴率为50.6%、41.6%，△F508是最主要的致病突变，可疑患者电泳图只要发现2.6等位基因，就可对此病进行初步诊断。现已在Wilson病、外周神经纤维瘤、成人多束肾、多巴性肌紧张、Frecbreich共济失调、Kallmunm综合征性连锁、视网膜病等基因内或旁侧发现有高度的小卫星区域，从而可进行基因诊断。Okamoto R〔23〕用DNA指纹法预测慢性粒cell性白血病骨髓移植术后复发，取得了成功。
3.5 肿瘤的研究 肿瘤是多因素、多阶段的变化过程，病因复杂、变化多样，但归根到底还是在DNA的变化上。一般说来，癌组织、转移灶与正常组织或外周血细胞DNA指纹有差别，常见的是某条带或几条带的缺失，某一条或某几条带密度降低，或者癌组织中出现新的带。Thein等〔24〕用33.6和33.15为探针研究患者DNA指纹谱变化，发现胃肠肿瘤患者癌组织DNA指纹谱全有改变，并认为体细胞突 变还有种属特异性。刘霜等〔25〕应用RAPD(随机扩增多态性DNA)分析技术对6例肝癌患者的癌组织与非癌组织进行分析，发现所有肝癌组织基因组DNA的RAPD指纹图谱均存在差异，其中3例配对肝癌基因组中均存在一相同的0.9Kb的随机扩增片段。杨建厂等〔8〕用APHDFF技术对28例确诊为鼻咽癌病人血DNA指纹图的检测，发现有3条DNA片段出现的频率明显低于健康人群。王黛等〔26〕用LE11.8、MYO和Mb探针，经Southern杂交法检测12例儿童急性粒cell白血病患者的外周血或骨髓细胞的基因重排，结果发现初始或复发与完全缓解时的DNA指纹图相比，谱带有增加或减少，从而认为急性粒细胞白血病患儿的白血病细胞存在基因重排。
参考资料：http://zhidao.baidu.com/question/13180448.html
回答者： xy_vanilla - 举人 四级 8-11 13:31
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DNA指纹技术是分子生物学中的一种新技术.它是从分子水平区别不同种类生物之间以及同种生物之间差异的重要手段.它在法医学鉴定、物种起源进化研究、动植物及微生物DNA指纹资料库的建立、畜牧科学研究、癌症的研究、疾病的诊断、亲子鉴定等方面具有非常重要的应用.本文简要阐述DNA指纹技术的研究进展及其应用.
回答者： 水心雨君 - 见习魔法师 二级 8-11 13:33
dna指纹：指具有完全个体特异的dna多态性，其个体识别能力足以与手

指指纹相媲美，因而得名。可用来进行个人识别及亲权鉴定

DNA指纹的识别
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1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。
DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。
1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。
此外，它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。
DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。
琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中 回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

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