看精子成熟和获能的全过程

看精子成熟和获能的全过程

精子在睾丸的曲细精管内生成以后，从形态上来看，已形成蝌蚪状精子，但经实验证明，睾丸内的精子并不具备受精能力。睾丸精子还需在附睾内经历精子成熟过程，以及在女性生殖道内经历获能过程。

精子在4-6米长的附睾内运行过程中经历了一系列复杂的变化。精子在成熟过程中，体积略变小，含水量减少。最明显的改变是未成熟精子体部的胞浆小滴向后移动，并最终脱下。在一些不育病人的精液中，可看见大量未脱下胞浆小滴的未成熟精子。

睾丸内出来的精子可活动，但进入附睾头段后，即失去活动能力。精子在附睾内运行的过程中，又逐步获得了活动能力。先出现原地摆动，然后有转圈式运动，最后才有成熟精子特有的摆动式前向运动。因此，观察精子的运动方式，也是衡量精子是否成熟的一个指标。

另外，在精子成熟过程中，精子膜的通透性发生改变，如对钾离子的通透性增加，出现了排钠的功能，这对酶活力及代谢有重要的影响。精子在附睾运动过程中表面负电荷增加，这可使精子在附睾内贮存时，由于电荷同性相斥的作用，而不至于凝集成团。

还应指出，附睾的一些分泌物覆盖于精子表面，其中有一种含唾液酸的糖蛋白。种种迹象表明，转移到精子表面的唾液酸有着重要的生理机能：

（1）唾液酸是一种含有羧基的糖，带有负电荷，故精子成熟过程中表面负荷增加的主要原因，即为唾液酸的增加。

（2）从免疫学角度来看，唾液酸有掩盖精子特异抗原的机能，这就使精子在漫长的成熟及运行过程中，不致于被免疫活性细胞识别而引起自身免疫反应。先天性唾液酸转移酶缺乏或由于细菌唾液酸酶作用，均可导致免疫不育。

（3）含唾液酸糖蛋白可稳定顶体前区的细胞膜，从而抑制精子的顶体反应。从这个意义上讲，此糖蛋白也应属于去能因子。

射出的精子表面附着有附睾和精囊腺分泌的一种去能因子。所谓获得过程即为去除精子表面这种因子并获得受精能力的过程，这将使精子膜的结构与机能发生剧烈的改变。去能因子的清除主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高。所以，直接取自附睾尾的精子不具有受精能力，而把这些精子放在雌性生殖道内若干时间后，再取出作体外受精试验，才具有受精能力。

精子获能以后，精子膜的不稳定性增加，并去除了抑制顶体反应的因子，精子才可能发生顶体反应。

顶体系在精子细胞核头端的一个特殊的结构，它包绕在细胞核头端的三分之二处。顶体是一特异的溶酶体，外包单层膜，呈扁平囊状。其近细胞膜的部分称顶体外膜，贴近核膜的部分称顶体内膜。内、外膜之间的狭窄腔隙中存有均质性的顶体内容物，内含糖蛋白和多种水解酶，如透明质酸酶、唾液酸苷酶、酸性磷酸酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶和类胰蛋白酶等。精子开始发生顶体反应时，精子顶体外膜与其相贴的细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。顶体酶就是通过这些小孔释放出去，直至顶体内膜完全暴露。顶体反应完成的标志是顶体内膜与精子细胞膜的完全融合。对于哺乳动物精子来说，钙离子是激发顶体反应的必要条件。在发生顶体反应时，可见大量钙离子内流。在生理条件下，附睾液中钙离子浓度低，输卵管液中钙离子浓度高，显然后者有利于顶体反应。

在输卵管内许多精子经历顶体反应后释放大量水解酶，使卵子周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，这样使一些尚未发生顶体反应的精子得以与透明带接近，相互识别。这里需要补充一句，在精子获能过程中，由于去除了糖链末端的唾液酸，可使精子的膜结构发生显著改变，表现为膜内蛋白重排成簇现象，这可能与精子与卵子识别有密切关系。精子与卵子透明带结合后也发生顶体反应，释放顶体蛋白酶，分解透明带，逐步穿入。其中一个精子与卵细胞膜靠近，精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成了受精过程。

受精过程！

精子和卵子结合的过程叫做受精或受孕，受孕就是怀孕的开始。
　　性交时，男子每次排出约2—4亿个精子，其中大部分精子随精液从阴道内排出，小部分精子依靠尾部的摆动前进，先后通过子宫颈管、子宫腔，最后到达终点站——输卵管壶腹部，在那里等待和卵子结合。精子从阴道到达输卵管最快时间仅需数分钟，最迟4—6小时，一般1—1.5小时。精子在前进过程中，沿途要受到子宫颈粘液的阻挡和子宫腔内白细胞的吞噬，最后到达输卵管的仅有数十条至一二百条。精子在和卵子受精前还要在女性生殖腔内经过一段时间的孵育后，才具有受精能力，这个过程称为精子获能。
　　女子在育龄期，卵巢每月排出一个成熟的卵子，排卵日期在下次月经来潮前14天左右。卵子从卵巢排出后立即被输卵管伞部吸到输卵管内，并在输卵管壶腹部以等待精子的到来。
　　精子在女性输卵管内能生存1—3天，卵子能生存1天左右，如在女子排卵日前后数天内性交，精子和卵子可能在输卵管壶腹部相遇，这时一群精子包围卵子，获能后的精子其头部分泌顶体酶，以溶解卵子周围的放射冠和透明带，为精子进入卵子开通道路，最终只有一条精子进入卵子，然后形成一个新的细胞，这个细胞称为受精卵或孕卵，这个过程称为受精。
　　受精卵从输卵管分泌的液体中吸取营养和氧气，不断进行细胞分裂。与此同时，受精卵逐渐向宫腔方向移动，3—4天后到达宫腔时已发育成为一个具有多个细胞的实体，形状象桑椹，所以称为桑椹胚。桑椹胚在子宫腔内继续细胞分裂形成胚泡，大约在受精后6—8天进入子宫内膜，这个过程叫做着床或种植。

体外受精过程

哺乳动物体外受精的基本操作程序，主要环节包括以下几个方面:
(一)卵母细胞的采集和成熟培养
1．卵母细胞的采集：卵母细胞的采集方法通常有三种。
(1)超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。
(2)从活体卵巢中采集卵母细胞 ：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。
在家畜中， 牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直肠把握卵巢，经阴道壁穿刺插入吸卵针，借助B型超声波图像引导，吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目前的技术水平，一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。在家畜中，活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义，在有些国家已用于商业化生产。
(3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30℃~37℃)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期(GV期)，需要在体外培养成熟后才能与精子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。因此卵巢从畜体摘取后须放入含有生理盐水或磷酸缓冲液（PBS）的保温瓶中；吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤；所用溶液都要添加抗生素。
这种方法的最大优点是材料来源丰富，成本低廉，但确定母畜的系谱困难。
2．母细胞的选择：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complesx COC）。无论采用何种方法，采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精实践中，一般只培养A级和B级卵母细胞。
3．卵母细胞的成熟培养：由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时，先将采集的卵母细胞在实体显微镜经过挑选和洗涤后，然后放入成熟培养液中培养。家畜卵母细胞的成熟培养液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培养法，微滴体积为50-200微升，每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移入小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39℃、100%湿度和5%二氧化碳的空气。牛的培养时间为20-24小时，卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后，卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。
(二)体外受精
1．精子的获能处理：哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。
2．受精：即获能精子与成熟卵子的共培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。受精培养时间与获能方法有关。在B2液中一般为6-8小时而用TALP或S.F液作受精液时可培养18~24h。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1~9×10 6/ml，每10微升精液中放人1~2枚卵子，小滴体积一般为50~200微升。
(三)胚胎培养
精子和卵子受精后，受精卵需移入发育培养液中继续培养以检查受精状况和受精卵的发育潜力，质量较好的胚胎可移入受体母畜的生殖道内继续发育成熟或进行冷冻保存。
提高受精卵发育率的关键因素是选择理想的培养体系。在家畜中，胚胎培养液分为复杂的和化学成分明确的培养液两大类。复杂培养液中的成分很多，除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它们培养胚胎时，可以采用体细胞共培养体系，即体细胞与胚胎在微滴中共同培养，利用体细胞生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。
受精卵的培养广泛采用微滴法，胚胎与培养液的比例为一枚胚胎用3~10微升培养液；一般5~10枚胚胎放在一个小滴中培养以利用胚胎在生长过程中分泌的活性因子，相互促进发育。胚胎培养条件与卵母细胞成熟培养条件相同。有的实验室采用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合气体培养，以降低培养液中氧自由基浓度，提高胚胎发育率。胚胎在培养过程中要求每48-72小时更换一次培养液，同时观察胚胎的发育状况。当胚胎发育到一定阶段时可进行胚胎移植或冷冻保存，牛、羊受精卵通常培养到致密桑椹胚或囊胚时进行移植或冷冻保存。

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