叶片离体培养有望实现药用紫锥菊规模化培植

叶片离体培养有望实现药用紫锥菊规模化培植

本报重庆讯 重庆邮电大学生物信息学院和重庆大学生物工程学院共同开展的重庆市科委自然科学基金项目“药用紫锥菊(Echiancea purpurea)叶片离体培养技术”研究为实现药用紫锥菊种苗工厂化快速繁殖提供了新途径。科研人员以药用紫锥菊叶片为外植体，利用组织培养的方法诱导愈伤组织，成功地使其再分化形成完整植株。该研究建立的紫锥菊离体叶片的最佳培养条件可实现种苗快速生根，且生根率很高。此前利用药用紫锥菊叶片进行组培技术的研究尚未见报道。

紫锥菊为多年生草本植物，其含有羟基酰胺、多糖、倍半萜、多炔类、咖啡酸衍生物、黄酮等多种活性成分。药理研究显示，原产于美洲的药用紫锥菊对免疫功能有促进作用，可用于感染、感冒、关节炎、肺结核、气管炎、扁桃体炎、湿疹等的治疗。近年来，该植物受到国际上的普遍重视，成为国际市场需求量最大的植物药之一。我国北京、沈阳、山东等地近两年从欧洲和美洲成功引种该植物。但是，由于传统的种子育苗繁殖方法存在种子采集困难、发芽率低、需要低温春化处理工艺等问题，生产有较大难度，难以实现规模化，不能满足日益增长的市场需求。因此，进行药用紫锥菊的组培快繁再生技术研究非常必要。

在研究中，科研人员在药用紫锥菊的种苗上采取较嫩的叶片，对其进行消毒处理后，将其接种到附加不同生长物质的培养基中，诱导其生长。研究中选用的诱导培养基为MS+吲哚-3-丁酸（0.5~3.0毫克/升）+萘乙酸（0.5~2.0毫克/升）+蔗糖（30克/升）+琼脂（7克/升）。增殖培养基为MS+吲哚-3-丁酸(0.2毫克/升)+6-苄基腺嘌呤（0.3~0.9毫克/升）+赤霉素(0.1~0.7毫克/升)+蔗糖（30克/升）+琼脂（7克/升）。生根培养基为1/2MS+吲哚-3-丁酸(0.5毫克/升)+萘乙酸(0.1毫克/升)+蔗糖（30克/升）+琼脂（7克/升）。培养温度（24±2）℃，光照强度2500勒克斯左右，光照时间12~14小时/天。

在接种8天后，叶片切口周围出现膨大致密的翠绿色愈伤组织。两周后，愈伤组织不断增殖，逐渐形成圆形颗粒状突起。3周后，圆形突起形成绿色不定芽，继而伸长形成小芽苗。平均每块外植体可诱导5～11芽苗，且都在切块的边缘排列。培养25天后可形成具有肥绿叶片的小芽苗。

研究表明，不同激素浓度对植物愈伤组织的诱导分化和植株再生有重要影响。研究人员通过对培养基中施加不同浓度的萘乙酸和吲哚-3-丁酸检验对叶片愈伤组织的影响。结果发现，药用紫锥菊的叶片适宜在MS+吲哚-3-丁酸(2毫克/升)+萘乙酸(1毫克/升)+蔗糖(30克/升)+琼脂(7克/升)培养基上分化成苗。

在增殖培养中，待芽伸长并长出绿色叶片时，科研人员将苗分割成单株，将其转接到增殖培养基上。20～25天后，小芽基部膨大，或增殖形成具有3～4个小芽的丛生芽，芽苗可长成3～5厘米的无根苗。一般30～35天继代培养1次。在继代培养中，需将大芽丛分割成小芽丛，剪去过长的叶片，或将其接种在新的增殖培养基上进行扩大繁殖，并适当增强光照强度，使苗生长健壮。不同的激素配比对丛生芽的出芽率有明显的影响。要保持芽苗长势良好，且分化出芽时不长愈伤组织，培养基应为MS+6-苄基腺嘌呤(0.7毫克/升)+赤霉素(0.5毫克/升)+吲哚-3-丁酸(0.2毫克/升)+蔗糖(30克/升)+琼脂(7克/升)。

据介绍，紫锥菊的试管苗生根较为容易，即将高3厘米以上的无根苗切下，将其转到生根培养基上培养。12天时开始发根，25天后全部生根率达99％。根的数量为8～12条，最长约3厘米，平均长1.2厘米。激素对紫锥菊生根也有一定影响。当培养基为1/2MS+萘乙酸（0.1毫克/升）+吲哚-3-丁酸（0.5毫克/升）+蔗糖(30克/升)+琼脂(7克/升)时，生根效果好，根系较发达。培养4周后，根数达8~12条，根长达3厘米左右。此时即可移栽。移栽前必须炼苗5~7天，即将苗取出，洗去附着在苗上的培养基，将其移栽到泥炭土及腐质土混合的基质中，并注意保温、保湿。该方法的成活率可达90％。试管苗移栽3～4周后就可长出新根、新叶。成活后，可按常规进行栽培管理。

另外，研究人员还对叶片和叶柄不同部位的诱导分化和增殖能力进行了对比，结果发现叶片和叶柄越幼嫩，分化增殖能力越强；叶柄的分化主要出现在基部，数目较少，成苗速度快，芽苗健壮；叶片分化一般取中下部为宜，所诱导的不定芽数目多，成苗较慢，芽苗较弱。

（李标 唐坤 王伯初）

现代生物技术在药用植物产业的应用前景有哪些

药用植物以其独特的疗效、较小的毒副作用等特点，引起世界各国的普遍关注，其需求量日渐增多。中药有效成分是其具有确切临床疗效的物质基础。药效物质的有无（真伪）、多寡（优劣）是其品质的核心部分。但是由于植物药成分复杂、药效物质不明确、来源不一，且不同制剂工艺各异，造成质量难以控制，加之植物药材的造假问题也很突出，这些都阻碍了药用植物产业的发展。同时由于自然环境的破坏以及人们长期的过度采挖和滥用，使很多的原料性药用植物资源已面临枯竭的威胁，野生资源远远不能满足人们的需要。

因此，应对保障与提升重要药用植物品质的国家需求，以及中药野生资源短缺、品质严重退化的严峻形势，就需要更好地开发利用药用植物资源，改良和提升其品质，加大工业化生产力度，提高药效物质产量以满足市场需求，同时加大对野生资源的保护力度，使其更好地、可持续地为人类所用。

药用植物开发利用过程中存在种类和数量不清、种质资源保存困难、野生资源遭受严重破坏、人工栽培品种品质退化等诸多问题，严重制约了产业发展。如何有效对药用植物资源进行分类鉴定，保护濒危和紧缺资源修复和再生，防止退化和灭绝，以实现保障药材可持续供应，提升药材质量，是现代药用植物开发领域最亟需解决的课题，也是中医药产业实现现代化、国际化的关键措施。

药用植物传统分类和鉴别方法主要依据药材颜色、形状、气味、味道和质地等感观特征，其不足之处在于对这些特征的把握因人而异，具有很强的主观性，且强调经验积累，准确性不强，得不到国际同行的广泛认可。因此如何从分子水平揭示种质间差异成为研究者十分关心的问题。现代生物技术为药用植物种质鉴定开辟了一条新道路。

DNA分子标记（DNA molecular markers）是以脱氧核糖核酸分子差异为基础的一种标记，一般具有快速、微量、特异性强、稳定性好、结果直观可靠且不受生育阶段、供试部位、环境条件、贮藏等因素的影响等诸多优点[1]。

DNA分子标记在药用植物研究中的应用最先开始于日本。应用最早且最多的是药材的真伪鉴定及品种分类。较早的DNA分子标记技术有限制性内切酶片段长度多态性标记（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）。随着生物技术的发展，更加高效、快捷的DNA分子标记如扩增片段长度多态性标记（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）、简单序列重复标记（simple sequence repeat，SSR）、序列特征化扩增区域（sequence charactered amplified region，SCAR）、简单重复序列间长度多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）、相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）、单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）等相继出现，并且被应用于药用植物种质资源研究中的各个方面。

台湾中兴大学应用RFLP技术精确鉴定出了苦参与其伪品[2]，纪宝玉等[3]对野葛的研究表明，RAPD可作为种质资源筛选鉴定的关键技术；郝岗平等[4]将AFLP技术成功应用于丹参的道地性鉴别；潘清平等[5]采用ISSR技术为玉竹商品药材的鉴定提供了分子依据等。由此可见，DNA分子标记技术是一种有效鉴定药用植物的方法。

表 1对几种常用DNA分子标记技术进行了比较，每种方法各有优点及局限性，实际应用过程中可根据实验目的、材料和实验条件综合考虑进行选择。

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DNA条形码（DNA barcoding）是以一段或几段标准DNA序列作为标记来实现物种鉴定，类似于超市利用条形码扫描区分不同的商品，具有快速简便、准确可靠和自动化等优点。

Chen等[6]对药用植物及近缘种的4 800个物种6 600个样本进行研究，证明ITS2在药用植物鉴定中能发挥关键作用；刘美子等[7]发现ITS2序列对9种采自不同地域的常见蒿属物种水平鉴定成功率最高，可以作为鉴定蒿属植物的潜在条形码；崔志伟等[8]利用ITS2和psbA-tmH有效区分不同品种金银花，说明ITS2和psbA-tmH可以作为鉴定金银花不同品种的优势条形码组合；李栎等[9]对茜草科黎药植物的鉴定研究表明，ITS2序列可以对海南茜草科黎药植物进行快速鉴定。

近些年来，新发展起来的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记技术可对不同等位基因之间仅有的个别碱基差异或只有小的插入、缺失等核苷酸差异进行检测，用以区分2个个体遗传物质的差异[10]。Chen等[11]采用SNP标记技术结合ITS2、matK和psbA-trnH标准条形码序列，成功鉴定出了高丽参和西洋参。证明基于DNA条形码的SNP标记技术可以作为识别人参属的有效手段。SNP可直接以序列变异作为标记，其检测分析方法用高精尖的DNA芯片技术代替了传统的凝胶电泳，被认为是应用前景最好的遗传标记。

DNA条形码技术可以实现物种的快速有效鉴定，已成为现今药用植物种质资源分类与鉴定的主流方法。

传统药用植物种质资源保存一般采用种子库的方法，存在占用空间大、保存物种数量有限、管理麻烦、容易染菌发霉及保存时间短等不足。利用生物技术方法进行离体保存，可以很好解决上述问题。保存材料经复苏后，可短时间快速繁殖大量种苗，不受自然环境影响，省时省力，同时降低劣变发生频率，达到随时使用和长期保存优质种质资源的目的[12]。

依靠植物细胞全能性，将外植体接种在MS半固体培养基上或液体培养基的滤纸上，然后放在常温或低温条件下进行培养，并适时进行继代培养[13]，组织培养保存法分常温继代保存法和缓慢生长保存法。组织培养保存法能有效扩大繁殖药用植物，缓解野生资源不能满足市场需求的境况，同时也是保护濒危珍稀药用植物的有效手段。

（1）常温继代保存法：在常温条件下，每隔一段时间，将外植体进行新一轮的继代培养，以达到保存种质的目的，需要时还可以随时进行扩繁[14]。对铁皮石斛种质资源采用该方法保存取得了一定效果，并成功建立铁皮石斛快速繁殖体系[13]。该方法间隔时间短，需要不断继代培养。

（2）缓慢生长保存法：通过调节培养条件，在保证不使外植体死亡的情况下抑制其生长，尽量减少营养物的消耗，从而尽可能延长继代培养时间。主要措施有降低温度、调整渗透压、控制养分水平、使用生长抑制剂或延缓剂、控制培养基营养物质配比以及调节光照等[13]。对山银花进行离体培养研究，探索出了最适于山银花种质离体保存的条件[15]。

该法不需要继代即可长期保存植物种质，因此引起遗传变异相对小。目前最成熟的超低温保存法是玻璃化法。利用高浓度复合保护剂处理植物培养物一定时间后用液氮速冻，使植物细胞内外溶液固化成无定形的玻璃化状态，避免了冰晶在形成和融化过程中对细胞产生的机械破坏作用。此状态下植物细胞内新陈代谢、生长活动几乎完全停止，同时又保持了生物材料的形态发生潜能[16]，是一种保存种质的有效方法。

对西洋参悬浮细胞的超低温保存的探索性研究证明了该方法的可行性[17]；包埋玻璃化法超低温保存技术可以实现山药种质离体保存[18]；采用玻璃化法保存濒危植物矢车菊，成功实现了其茎尖的冻存程序[19]。

在滴冻法和玻璃化法基础上发展起来的小滴玻璃化法具有高存活率、高再生率、广适性、处理量大、操作简易等优点[20]。小滴玻璃化法在药用植物种质保存应用方面的报道还较少，但在其他植物上的应用可以作为借鉴。

人工种子是用能提供养分的胶囊包裹组织培养产生的胚状体，再在胶囊外包上一层保护膜，形成一种类似于天然种子的结构。人工种子有不受季节限制、更好的营养供应和抗病能力、能保持优良品种的遗传特性、方便贮藏运输等优点。在濒危药用植物种质资源保存上大有用武之地。

长期以来，许多名贵珍稀的药用植物由于其独特的治病、保健、美容功效而供不应求，原药材价格持续走高，极大刺激了人们对野生珍稀药用植物资源的掠夺性采挖和收购，造成资源的毁灭性破坏。另外，全球气候变暖等自然环境的变化也使得很多地区不再适合原有药用植物的生长。多方面原因综合导致多种珍稀药用植物资源濒临灭绝。

人工种子技术对于濒危植物种质资源保存具有重大意义。但该技术依赖于植物组织培养，对于难以进行组培的植物则不适用。

运用器官培养、植物干细胞培养等[30]生物技术方法也能很好地实现药用植物资源的可持续利用。此外，DNA分子标记技术在种质资源的鉴定、保护对象和原地保护单元的确定、迁地保护的取样策略和效果评价、濒危原因的科学阐明等方面的应用，也可以为珍稀濒危药用植物资源保护策略制定及措施实施提供参考。

生物技术的运用既能使药用植物资源得到更好地开发利用，又可以最大限度地保护它们。生物技术将为中药这一中华文化瑰宝走向世界起到巨大的推动作用。

药用植物种植培养过程中存在病毒感染导致品质退化和质量评价体系缺乏科学性等问题。因此，培育脱毒的高品质药用植物植株，建立科学的质量评价体系，创制品质优于自然品种的药用植物新品种等，是目前药用植物研究开发领域的热门方向。

植物病毒因其干扰宿主体内新陈代谢，降低产量和品质，甚至导致死亡而有“植物癌症”之称。特别是无性繁殖作物，连年种植易积累多种病毒，从而造成品质退化[31]。植物病毒已成为降低农作物产量和质量的主要因素之一。

目前，人类发现的植物病毒已多达近千种。药用植物感染的病毒种类主要有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus）、芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus）、大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus）等[32]。全球每年因植物病毒造成的经济损失约600亿美元。因此，加大对药用植物脱病毒技术的研究力度，采取科学有效的防治措施，是当前及今后提升和改良药用植物品质的重点和难点[33]。表 2总结了近年来几种脱毒技术的应用进展。

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除表 2中所列的常见脱毒法外，还有花药或花粉培养、珠心胚培养技术等，也可一定程度上起到脱病毒效果。

植物新品种指经过人工培育的、对发现的野生植物加以引种驯化开发的或者通过生物技术改造的植物品种，具有新颖性、特异性、一致性和稳定性以及名称确定性的植物品种[45]。

传统药用植物新品种创制一般采用杂交育种等方法，如桔梗[46]、丹参[47]等药材已开展杂交育种或杂种优势利用研究，并创制了新品种。但该方法存在不能产生新基因，且杂交后代会出现性状分离，育种过程缓慢，过程复杂等不足。现代生物技术方法则开辟了新品种创制的新途径。

诱变育种指利用各种物理、化学及生物等因素诱导植物发生基因突变，促进基因重组，扩大遗传变异，然后根据育种目标选择新品种的育种技术[48]。

离子束注入诱变技术是利用注入射程具有可控性、集束性和方向性的荷能离子束，在较轻程度损伤细胞的情况下，获得比较高的突变率和比较宽的突变谱，从而选育出新品种的技术。用不同剂量的12C6+离子束均匀辐照紫苏种子后，产生了一些染色体畸变，为筛选优良变异品种提供了更多可能[49]。说明低剂量的12C6+重离子束在辐照诱变新的突变类型、培育新的优良品种方面具有较大潜力。

太空育种是利用太空特殊环境使生物基因产生变异，选育新品种、新材料的育种新技术。其最大优势在于有可能在较短时间内获得常规育种和常规诱变育种方法难以获得的罕见基因资源，使植物获得新基因、新类型、新性状[50]。据报道，“天丹一号”太空丹参由天士力集团培育成功。2008年，该集团将丹参种子搭载“神七”进入太空，返地后经株系培养繁育，选育出了“天丹一号”太空丹参，其有效成分量显著高于对照。

诱变育种虽能够提高突变率，短时间内获得更多变异类型，但诱发突变的方向难以控制，突变多为有害突变，要获得更多优良性状，就必须增大突变量。因此，筛选的工作量是相当大的。

倍性育种包括单倍体育种和多倍体育种。单倍体育种是单倍体培养技术与育种实践相结合形成的一种新的育种方法，具有克服远缘杂种不育、提高育种效率及选择效率、迅速获得纯系等优点[48]。以发育时期的菘蓝花药为外植体，进行培养及单倍体诱导，获得了单倍体小绿苗。经染色体加倍后，一个世代即可出现纯合二倍体，其性状不分离，表型整齐一致，可显著缩短育种年限[51]。

多倍体是指染色体数目在3n或3n以上的个体、居群和种。多倍体植物有更强的适应性和可塑性。药用植物多倍体具有强抗逆性、高生物产量、低可孕性以及增加某些药用成分量等特点。最常用的多倍体诱导剂是秋水仙素。秋水仙素诱导法分活体和离体处理加倍法2种[52]。活体加倍法包括滴液法、浸泡法、琼脂法、喷雾法、注射法等。离体加倍法即组织培养诱变法，是用秋水仙素对植株某一离体部分进行处理，再进行组培，或在组培过程中进行染色体加倍处理的方法。将秋水仙素和琼脂混合，制成半固体，然后将其涂抹在植物顶芽或腋芽上诱导多倍体，该方法已在桔梗[53]、金银花[54]等药用植物上获得成功。用适当浓度的秋水仙素溶液浸泡怀地黄带芽茎段，也诱导出了四倍体植株，但是诱导率不高[55]。将石斛的类原球茎接种在0.075%秋水仙素的培养基上，获得了较高的诱导率[56]。通过离体培养的方法，在诱导紫锥菊染色体加倍上也取得了成功[57]。此外，也可用温度骤变、机械创伤、电离射线、非电离射线、离心力等物理因素和有性杂交培育、胚乳培养法、体细胞杂交法、体细胞无性系变异等生物学方法诱导染色体加倍。

虽然人工诱导多倍体的频率高、见效快、方法较简单，在生产和育种实践中可产生巨大经济效益。但同时也存在毒害、嵌合体现象比较严重、孕性降低、稳定耗时较长、育种成本高等问题[58]。因此，还需在药用植物多倍体育种上开展更多、更广泛的研究。

转基因育种也称为基因工程育种，可按照人们的意愿将外源基因重组到受体细胞基因组中使之特异性表达，经筛选获得稳定表达的遗传工程新品种。其主要优势是能克服植物远缘杂交不亲和障碍，扩大物种杂交范围，并加快变异速度等，提供了定向创造生物的可能性[59]。在创制新品种，开发优质、高产、高效兼各种抗性作物上可大显身手。目前，植物转基因主要方法有农杆菌介导法、聚乙二醇介导法、基因枪法、花粉管通道法、电激穿孔法、显微注射法及超声波导入法等。

农杆菌介导法是应用最多，技术较为成熟且结果比较理想的基因转化方法。先往根癌农杆菌中转入连接有目的基因的植物表达载体，然后用该农杆菌侵染植物，将载体上的目的基因导入并整合到植物基因组中，从而完成目的基因的转化，获得转基因植株。可用于转化较大的DNA片段，能稳定遗传，重复性好，且不易产生基因沉默，但存在只对双子叶植物敏感的缺陷。该方法已成功在丹参[60]、诸葛菜和菘蓝[61]、黄芪[62]、蒿属植物[63]等材料上取得成功。

基因枪法是继农杆菌介导转化法之后又一个广泛应用的遗传转化技术。利用火药爆炸或其他驱动力，将载有外源DNA的金属颗粒射击进入真空室中的靶细胞或组织中，从而导入外源基因。该法无宿主限制、操作简单、转化时间短，但转化率相对低，外源DNA整合机制不清楚。近年在大蒜[64]、白三叶[65]等药用植物上取得了新的成果。

花粉管通道法是在植物授粉后，利用植物开花过程中萌发的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵，进而使目的基因整合到受体植物基因组中，使其自然发育成种子并形成转基因植株，该方法简便、育种时间短。铁皮石斛[66]、蓖麻[67]等用该法转化获得了转基因新品种。表 3对几种主要的植物基因转化法特点进行了比较。

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转基因在药用植物上的应用虽然已取得相当不错的成果，但其安全问题一直是争论的热点。因此，对转基因药用植物还是应持有谨慎的态度，必须进行更加系统深入的研究。

次生代谢工程就是用DNA重组技术修饰生成次生代谢物的生化反应途径或引进新的生化反应，从而直接提高或抑制某个或某些特定次生代谢物的合成，改善细胞性能。随着药用植物次生代谢物生物合成途径的日渐探明，应用代谢工程技术对植物次生代谢途径进行遗传改良，以大幅度提高目标产物的量已成为研究的热点。

自1991年美国学者Bailey提出次生代谢工程概念以来，次生代谢工程技术的应用已有大量报道。早期最为经典的研究要属用该技术实现了水稻胚乳中维生素A原（β-胡萝卜素）的从无到有[68]。近年来，该技术在药用植物上应用的报道更是层出不穷。药用植物中各类药效物质的量往往很低，无法满足人们的需求。通过次生代谢工程的手段可稳定地提高它们在植物体内的量。本文简要介绍药用植物中几类重要药效物质通过次生代谢工程方法提高量的应用进展。

苯丙素类化合物是植物在长期自然选择过程中产生的一类重要的天然有机化合物，一般具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗自由基、抗炎镇痛、保肝、保护心血管系统等多种生物活性，因此是非常重要的一类天然药效物质。

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