华人学子PNAS：癌症免疫疗法新策略

华人学子PNAS：癌症免疫疗法新策略

2016年08月25日讯 癌已被证明是个狡猾的敌人，在某种程度上是因为，癌细胞能够如此有效地“蛊惑”免疫系统，以至于能够消灭它们。

近年来，通过激活人体自身免疫系统来消灭肿瘤的癌症疗法，已经提高了对抗某些癌症的几率，包括以前无法治愈的皮肤癌。但是免疫疗法目前只能激活免疫系统的一支部队--适应性免疫系统的，而且并不是那么有效。

斯坦福大学的化学教授Carolyn Bertozzi表明，除去乳腺癌细胞周围的某些糖，可以召集免疫系统的另一支部队--先天免疫系统。该方法发表于8月22日的《PNAS》，大大提高了乳腺癌药物在实验室培养皿中的有效性，从而为对抗癌症开辟了一条新的途径。

Bertozzi说：“这是免疫疗法的一个新思路。”她认为这是第一次有治疗方法涉及癌细胞周围的糖，称为多糖-蛋白质复合物（glycocalyx）。

她说：“这个领域的研究人员开始明白，你需要影响许多不同的节点，才能得到一个更强大的抗肿瘤免疫反应，多糖-蛋白质复合物似乎是其中的一个节点。”

科学家们早就知道，如果某些糖是存在于一个肿瘤上，肿瘤就不能很好地响应治疗。但是没人知道这个糖做了什么，从某种程度上是因为，只有少数的实验室研究这种多糖-蛋白质复合物。

在这些实验室已有越来越多的证据表明，一小部分糖--称为唾液酸，可作为先天免疫系统的一个信号，忽略形迹可疑的肿瘤。Bertozzi认为，去除这些糖，也许先天免疫细胞会更容易识别和攻击癌细胞。

Bertozzi和她的团队，在实验室里培养的乳腺癌细胞，在其表面上有不同量的HER2蛋白。这是一个众所周知的蛋白质，目前存在于大约四分之三的乳腺癌上。如何乳腺癌患者的肿瘤上有着高水平的该蛋白质，一般接受称为Herceptin的治疗，这是一种抗体可结合HER2，并标记肿瘤细胞，以通过先天免疫细胞杀伤肿瘤细胞，如自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞。

但Herceptin并不总是起作用，尤其是在具有较少HER2的肿瘤中，如果唾液酸存在于癌细胞的表面，那就可能不那么有效。Bertozzi和她的团队使用他们在以前工作中研发的化学工具，将本质上是化学“割草机”的东西依附到赫赛汀抗体上。一旦药物结合癌细胞上的HER2分子，这个化学“割草机”就切下邻近的唾液酸。

随着这些糖不见了，Herceptin变得更容易激活NK细胞来杀死癌细胞，尤其是当细胞有较低水平的HER2和更高水平的糖时。这一切都发生在实验室培养皿里，但是Bertozzi希望，这种策略的一个版本可能对人类起效。

Bertozzi说，癌症免疫疗法的关键问题是，存在于肿瘤上的信号的规模变化，其中一些告诉免疫细胞攻击，而其他的则告诉免疫细胞视而不见。

Bertozzi说：“现在世界上所有的免疫治疗，是把免疫系统作为计算的加减号。如果你想倾斜的规模向着免疫激活，你可以增加或移除抑制剂，或两者兼有。”当前市场上的免疫疗法是通过阻断一个由适应性免疫系统识别的抑制信号，而发挥作用。

Bertozzi的方法提供了另一种有利于攻击的方法，这一次是针对先天免疫系统。她说，这项研究只是显示了它是如何工作的，但她的除糖“剪草机”可以用于各种类型的细胞，不只是那些表达HER2的细胞。

Bertozzi说：“绝大多数情况下，你需要得到适应性免疫力和先天免疫力的一个组分，以获得更强劲的反应来对抗传染病病原体，如在接种疫苗。”Bertozzi说，该方法还强调，关注不被人重视的多糖复合物，是很重要的。

Bertozzi说：“事实上，人们不了解多糖-蛋白质复合物对这种相互作用的贡献，就意味着错失良机。我认为这项工作可能会扭转这种局面。”

耶鲁大学发布新型免疫疗法结果，有望为癌症治疗带来新突破

近年来，通过人体自身免疫系统抵抗肿瘤的免疫疗法为肿瘤治疗的发展拓展了更多可能性。相对于手术、放疗、化疗等治疗方式，免疫疗法的副作用相对较小，也对一些其他疗法不起作用的情况有不错的疗效。但由于目前的免疫疗法主要包括 免疫检查点单克隆抗体治疗、过继性免疫细胞治疗、人重组细胞因子（非特异性免疫疗法）、溶瘤病毒疗法和肿瘤疫苗治疗 几个方面，然而这些疗法在临床应用上仍然面临各种限制，并非万无一失，肿瘤细胞仍然有逃脱免疫细胞“检查”的可能性，因此急需开发新类型的肿瘤免疫疗法。

近期，耶鲁大学研究团队将其关于治疗肿瘤的一项新的免疫疗法结果发布于《Nature Immunology》期刊上。这篇名为“Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity”的文章中所展现的结果表明，基于CRISPR激活（CRISPRa）平台的多重激活内源基因免疫疗法（MAEGI，Multiplex Activation of Endogenous Genes as Immunotherapy）可靶向特定类型的癌细胞并激活相关基因表达，通过精确定位、标记并放大信号，使免疫系统攻击标记的癌细胞，可有效杀伤或消除小鼠体内多种类型的肿瘤。这种治疗方式通过改变肿瘤微环境，并以增强T细胞浸润和抗肿瘤免疫为特征。多路内源性基因激活是一种多用途的、高度可伸缩的策略，以引发针对肿瘤的有效免疫反应，有别于所有的肿瘤疗法。这项研究有望帮助人类的免疫系统识别、攻击并杀死癌细胞。

首先，研究人员用腺相关病毒来递送CRISPRa文库到肿瘤内部并精准靶向肿瘤的突变基因。研究表明通过CRISPRa慢病毒载体转染三阴性乳腺癌（TNBC）细胞E0771?，使得细胞同时表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1，并进而利用磷酸甘油酸脂激酶PGK基因的启动子激活OVA蛋白的表达从而得到E0071-OVA稳转细胞系，并与分离出来的经OVA体内活化的CD8+?T细胞进行共培养，来评估此肿瘤免疫疗法的有效性。TAAs(肿瘤相关抗原)低表达的肿瘤细胞经CRISPRa激活后可在细胞膜表面高表达TAAs，并被免疫系统的CD8+?T细胞识别和杀伤。

在上述的模式研究模型的基础上，研究人员将MAEGI疗法拓展到了小鼠身上，并借助AAV-CRISPR体系递送sgRNA文库到C57BL/6J小鼠的TNBC肿瘤内部，结果发现相比PBS处理组和空载质粒组，导入AAV-g-MAEGI小鼠的肿瘤生长受到了显著的抑制，于此同时ELISA实验也证明AAV-g-MAEGI组小鼠有着更多IFNγ的产生和更多数目的活性CD8+?T细胞。以上结果也表明，通过MAEGI疗法，小鼠体内的抗肿瘤免疫活性得到了显著增强。

最后，研究者借助单细胞测序技术，在细胞水平进一步验证了活化的免疫细胞群的组成，发现C57BL/6J乳腺癌小鼠在经过不同剂量的AAV-MAEGI治疗后，高剂量组的小鼠体内有着更高比例的CD4+和CD8+活性细胞，显示了MAEGI疗法可通过增强免疫反应来达到消除肿瘤的目的。

综上所述，研究者证明了通过CRISPRa直接激活内源性突变基因可以放大肿瘤细胞的“非自身”信号，从而诱导强大的抗肿瘤适应性免疫。各种形式的MAEGI，包括AAV-g-MAEGI和AAV-p-MAEGI，以及任何内源性基因激活治疗的未来衍生物，提供了一种正交模态的肿瘤免疫治疗模式，即作为单一药物或与其他治疗模式协同使用。在进入I期临床试验之前，MAEGI的未来临床转化还需要排除过表达的潜在有害基因，优化成分和设计，在动物模型中评估毒性，以及开发成药的探究性研究。

抗癌英雄免疫细胞

美国生物学家乔治戴利曾说：如果20世纪是药物治疗时代，那么21世纪就是细胞治疗的时代。在精准定位和识别癌细胞相关抗原的基础上，人体的免疫系统会开始攻击标记的癌细胞，其中杀伤性的免疫细胞作为尖兵构成了抗肿瘤免疫系统的核心力量，因此免疫细胞是抗癌战役中真正的英雄。正常人体每天都将产生上百个癌变细胞，但它们在形成肿瘤病灶前就基本被免疫细胞消灭了。所以优质的免疫系统是人体自身最好的医生。过继性免疫治疗（Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT），是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫细胞治疗主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T、CAR-T等几大类。其中CIK（cytokine-induced killer），又称为多种细胞因子诱导的杀伤细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此， 应用 CIK细胞被认 为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案 。

CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%～5%，在体外经多因子培养28～30天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上，进而再回输到体内，发挥响应的功能活性，CIK的活性主要有以下几方面：

(1) CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强。(2) CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。(3) 杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。(4) 是典型的个性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。(5) 由于CIK细胞是活化的自体细胞，用起来非常安全。

然而免疫细胞也有质量之分，随着年龄的增长，人体的免疫细胞也会发生相应的变化，其细胞活力及数量会随着年龄的增加而减弱。例如，人在40-50岁时，免疫细胞的功能（活力和数量）就仅为身体巅峰时期的1/2。这在一定概率上增加了人体的患病（如肿瘤等疾病）风险。为避免这一问题，尖端生物科技的细胞存储技术应运而生，这种技术可以将细胞存储一定的时期，保证其功能和活性不受因时间推移产生明显的影响。如果能将人体年轻时的优质免疫细胞进行存储，在需要时提取使用，无疑对于抗感染、抗肿瘤及提高自身免疫力等方面都有很大的帮助。

免疫细胞存储—您的“健康种子”

免疫细胞存储是指利用先进的生物技术，从人体血液中分离并富集一定数量的免疫细胞，结合细胞的生物物理因素，将免疫细胞保存在-196℃的低温条件下，从而维持免疫细胞的多样性与高活性潜能，使细胞处于休眠状态，待需要时再进行复苏和扩增，用于精准细胞治疗和美容抗衰老等领域。具体来说就是利用特定的细胞冻存基质，这些基质通常含有冷冻保护剂DMSO或者甘油以及血清组分，并通过缓慢的梯度降温历经4℃、-20℃、-80℃并最终达到-196℃，也可通过商业化的细胞冻存盒将细胞直接放入-80℃并进而放入液氮中。细胞复苏则强调的是快速，即将液氮中的细胞直接放入37℃进行水浴，快速升温减少细胞复苏过程中冰晶等融化带来的伤害，通过慢冻存快复苏可以最大程度的减少细胞的受损程度，维持细胞的高活性。

细胞存储的目的是为了将来使用，无论是防病、治病还是抗衰老，都对存储细胞的机构的科研能力和存储能力有很高的要求。在国内相关的企业中，吉涛健康与中国科学院在近日签署了免疫细胞科研战略合作协议。雄厚的科研实力和专业的市场化管理，让双方的合作在细胞存储、制备及科研转化等方面形成了四位一体的细胞全流程服务链条。中国科学院种子库冻存细胞的服务更为吉涛生物的用户打造了多点备灾的保险柜，可为用户终身存储细胞。

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