Nature发布癌症研究重要成果

Nature发布癌症研究重要成果

2016年09月06日讯 肾癌起源于肾小管上皮细胞，是泌尿系统常见恶性肿瘤之一，发病率占全身恶性肿瘤的3%。肾癌的化疗效果并不理想，肾切除手术被认为是最有效果的治疗途径。近50年来肾癌的发病率和死亡率在持续上升。

Nature杂志发表的一项最新研究表明，一类被称为HIF-2抑制剂的新药比肾癌标准药物舒尼替尼（sunitinib）更安全更有效。这种药物脱胎于德州大学西南医学中心二十多年前的研究，旨在干扰为细胞提供能量的过程。

研究人员用小鼠模型对HIF-2抑制剂进行了临床前试验，这些小鼠移植了二十多名患者的肾癌细胞。研究显示，HIF-2抑制剂PT2399能够在一半的肿瘤中有效控制癌症。“这是全新的肾癌疗法。我们正在进行相应的临床试验，希望HIF-2抑制剂可以早日造福肾癌患者，”文章的资深作者，德州大学西南医学中心的Dr. James Brugarolas说。

这项研究的共同作者Dr. Kevin Courtney之前在美国临床肿瘤协会的年会上展示过他们的临床数据。数据显示，HIF-2抑制剂能够安全用于肾癌患者，对经过多次预先治疗的患者依然有效。而Nature发表的这项研究表明，HIF-2抑制剂能够控制经过多次治疗的转移性肾癌。由此可见，HIF-2是对抗肾癌的理想靶标。

低氧诱导因子（比如HIF-2）可以帮助机体细胞适应低氧环境。HIF激活的程序能促进血管发育、帮助氧输送和提升营养利用效率。这个机制会被肾癌细胞利用，为癌细胞生长提供能量。HIF-2被认为是肾癌最重要的推动者，这种蛋白在其它类型的癌症中也很重要，包括胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌。

HIF-2抑制子可以抑制HIF-2的影响，下调一种重要的蛋白VEGF，VEGF对肿瘤血管生成有促进作用。“与现有VEGF抑制子不同的是，HIF-2抑制剂只阻断癌症中的VEGF，不会造成心脏毒性或者高血压，”Dr. Brugarolas解释道。

研究人员对HIF-2抑制子与舒尼替尼进行比较，发现HIF-2抑制子的抗癌活性更强。此外，HIF-2抑制子的安全性也更高。接受舒尼替尼治疗的小鼠会像有些患者那样变得更加瘦弱，使用HIF-2抑制子的小鼠不但没有变瘦，体重反而还有所增加。不过，有一组肿瘤对HIF-2抑制子没有反应。研究人员已经鉴定了这些肿瘤的生物指标，以便判断哪些患者更适合接受HIF-2治疗。

贝勒医学院的副教授Dr. Chad Creighton领导研究团队深入分析了近900个肾癌样本。过去人们根据肾癌细胞在显微镜下的特征将肾癌分为三个大类。而这项研究表明，在分子水平上肾癌还可以进一步分为九个亚类。这些肾癌亚类各具特征，受到影响的分子通路和患者的生存情况也大相径庭。这项研究为肾癌的个性化医疗奠定了坚实的基础。

肾细胞癌（renal cell carcinoma ） 是成年人原发性肾肿瘤中最常见的类型，包括一系列肾脏器官的病理和分子变化。Cell杂志的“SnapShot: Renal Cell Carcinoma”总结了目前肾细胞癌基因全景图中的一些关键特征和主要通路，包括肿瘤演变、异质性等多方面的内容，还介绍了肾细胞癌的相关治疗进展。

当局部供血无法满足肾癌细胞需求的时候会导致缺氧，结果是核蛋白SPOP离开细胞核进入到细胞质中。SPOP一般是抑制肿瘤生长的，但它在细胞质中发挥相反的作用，促进肿瘤的快速增殖。在《癌细胞》（Cancer Cell）杂志发表的一篇新研究论文中，来自中科院北京基因组研究所和芝加哥大学的研究人员描述了缺氧引起SPOP过表达的新机制。他们还证实，缺氧刺激SPOP离开细胞核进入到细胞质中，关闭了抑制肿瘤生长的保护信号通路。

耶鲁大学发布新型免疫疗法结果，有望为癌症治疗带来新突破

近年来，通过人体自身免疫系统抵抗肿瘤的免疫疗法为肿瘤治疗的发展拓展了更多可能性。相对于手术、放疗、化疗等治疗方式，免疫疗法的副作用相对较小，也对一些其他疗法不起作用的情况有不错的疗效。但由于目前的免疫疗法主要包括 免疫检查点单克隆抗体治疗、过继性免疫细胞治疗、人重组细胞因子（非特异性免疫疗法）、溶瘤病毒疗法和肿瘤疫苗治疗 几个方面，然而这些疗法在临床应用上仍然面临各种限制，并非万无一失，肿瘤细胞仍然有逃脱免疫细胞“检查”的可能性，因此急需开发新类型的肿瘤免疫疗法。

近期，耶鲁大学研究团队将其关于治疗肿瘤的一项新的免疫疗法结果发布于《Nature Immunology》期刊上。这篇名为“Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity”的文章中所展现的结果表明，基于CRISPR激活（CRISPRa）平台的多重激活内源基因免疫疗法（MAEGI，Multiplex Activation of Endogenous Genes as Immunotherapy）可靶向特定类型的癌细胞并激活相关基因表达，通过精确定位、标记并放大信号，使免疫系统攻击标记的癌细胞，可有效杀伤或消除小鼠体内多种类型的肿瘤。这种治疗方式通过改变肿瘤微环境，并以增强T细胞浸润和抗肿瘤免疫为特征。多路内源性基因激活是一种多用途的、高度可伸缩的策略，以引发针对肿瘤的有效免疫反应，有别于所有的肿瘤疗法。这项研究有望帮助人类的免疫系统识别、攻击并杀死癌细胞。

首先，研究人员用腺相关病毒来递送CRISPRa文库到肿瘤内部并精准靶向肿瘤的突变基因。研究表明通过CRISPRa慢病毒载体转染三阴性乳腺癌（TNBC）细胞E0771?，使得细胞同时表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1，并进而利用磷酸甘油酸脂激酶PGK基因的启动子激活OVA蛋白的表达从而得到E0071-OVA稳转细胞系，并与分离出来的经OVA体内活化的CD8+?T细胞进行共培养，来评估此肿瘤免疫疗法的有效性。TAAs(肿瘤相关抗原)低表达的肿瘤细胞经CRISPRa激活后可在细胞膜表面高表达TAAs，并被免疫系统的CD8+?T细胞识别和杀伤。

在上述的模式研究模型的基础上，研究人员将MAEGI疗法拓展到了小鼠身上，并借助AAV-CRISPR体系递送sgRNA文库到C57BL/6J小鼠的TNBC肿瘤内部，结果发现相比PBS处理组和空载质粒组，导入AAV-g-MAEGI小鼠的肿瘤生长受到了显著的抑制，于此同时ELISA实验也证明AAV-g-MAEGI组小鼠有着更多IFNγ的产生和更多数目的活性CD8+?T细胞。以上结果也表明，通过MAEGI疗法，小鼠体内的抗肿瘤免疫活性得到了显著增强。

最后，研究者借助单细胞测序技术，在细胞水平进一步验证了活化的免疫细胞群的组成，发现C57BL/6J乳腺癌小鼠在经过不同剂量的AAV-MAEGI治疗后，高剂量组的小鼠体内有着更高比例的CD4+和CD8+活性细胞，显示了MAEGI疗法可通过增强免疫反应来达到消除肿瘤的目的。

综上所述，研究者证明了通过CRISPRa直接激活内源性突变基因可以放大肿瘤细胞的“非自身”信号，从而诱导强大的抗肿瘤适应性免疫。各种形式的MAEGI，包括AAV-g-MAEGI和AAV-p-MAEGI，以及任何内源性基因激活治疗的未来衍生物，提供了一种正交模态的肿瘤免疫治疗模式，即作为单一药物或与其他治疗模式协同使用。在进入I期临床试验之前，MAEGI的未来临床转化还需要排除过表达的潜在有害基因，优化成分和设计，在动物模型中评估毒性，以及开发成药的探究性研究。

抗癌英雄免疫细胞

美国生物学家乔治戴利曾说：如果20世纪是药物治疗时代，那么21世纪就是细胞治疗的时代。在精准定位和识别癌细胞相关抗原的基础上，人体的免疫系统会开始攻击标记的癌细胞，其中杀伤性的免疫细胞作为尖兵构成了抗肿瘤免疫系统的核心力量，因此免疫细胞是抗癌战役中真正的英雄。正常人体每天都将产生上百个癌变细胞，但它们在形成肿瘤病灶前就基本被免疫细胞消灭了。所以优质的免疫系统是人体自身最好的医生。过继性免疫治疗（Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT），是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫细胞治疗主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T、CAR-T等几大类。其中CIK（cytokine-induced killer），又称为多种细胞因子诱导的杀伤细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此， 应用 CIK细胞被认 为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案 。

CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%～5%，在体外经多因子培养28～30天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上，进而再回输到体内，发挥响应的功能活性，CIK的活性主要有以下几方面：

(1) CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强。(2) CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。(3) 杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。(4) 是典型的个性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。(5) 由于CIK细胞是活化的自体细胞，用起来非常安全。

然而免疫细胞也有质量之分，随着年龄的增长，人体的免疫细胞也会发生相应的变化，其细胞活力及数量会随着年龄的增加而减弱。例如，人在40-50岁时，免疫细胞的功能（活力和数量）就仅为身体巅峰时期的1/2。这在一定概率上增加了人体的患病（如肿瘤等疾病）风险。为避免这一问题，尖端生物科技的细胞存储技术应运而生，这种技术可以将细胞存储一定的时期，保证其功能和活性不受因时间推移产生明显的影响。如果能将人体年轻时的优质免疫细胞进行存储，在需要时提取使用，无疑对于抗感染、抗肿瘤及提高自身免疫力等方面都有很大的帮助。

免疫细胞存储—您的“健康种子”

免疫细胞存储是指利用先进的生物技术，从人体血液中分离并富集一定数量的免疫细胞，结合细胞的生物物理因素，将免疫细胞保存在-196℃的低温条件下，从而维持免疫细胞的多样性与高活性潜能，使细胞处于休眠状态，待需要时再进行复苏和扩增，用于精准细胞治疗和美容抗衰老等领域。具体来说就是利用特定的细胞冻存基质，这些基质通常含有冷冻保护剂DMSO或者甘油以及血清组分，并通过缓慢的梯度降温历经4℃、-20℃、-80℃并最终达到-196℃，也可通过商业化的细胞冻存盒将细胞直接放入-80℃并进而放入液氮中。细胞复苏则强调的是快速，即将液氮中的细胞直接放入37℃进行水浴，快速升温减少细胞复苏过程中冰晶等融化带来的伤害，通过慢冻存快复苏可以最大程度的减少细胞的受损程度，维持细胞的高活性。

细胞存储的目的是为了将来使用，无论是防病、治病还是抗衰老，都对存储细胞的机构的科研能力和存储能力有很高的要求。在国内相关的企业中，吉涛健康与中国科学院在近日签署了免疫细胞科研战略合作协议。雄厚的科研实力和专业的市场化管理，让双方的合作在细胞存储、制备及科研转化等方面形成了四位一体的细胞全流程服务链条。中国科学院种子库冻存细胞的服务更为吉涛生物的用户打造了多点备灾的保险柜，可为用户终身存储细胞。

研究进展 | 当乳腺癌遇上单细胞测序技术（上）

乳腺癌（Breast Cancer）是女性最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的主要原因。乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是一种高度异质性的肿瘤，深入了解其组织内在异质性及其生物学功能的是剖析肿瘤发生机制的重要一步。目前，单细胞测序技术已广泛应用于解析乳腺癌肿瘤异质性、肿瘤微环境、转移侵袭、治疗耐药等方面。本期，将通过展示单细胞测序研究乳腺癌的部分已发表研究成果，从乳腺癌单细胞图谱构建、肿瘤微环境解析及肿瘤多样化异质性探究等层面，帮助各位在单细胞层面理解该疾病的复杂细胞组成及肿瘤异质性~

1.样本选取

26例原发乳腺癌（11例ER+，5例HER2+和10例TNBC）进行sc RNA-seq；6例乳腺癌（2例ER+，4例TNBC）进行空间转录组测序；4例乳腺癌（1例luminal，1例HER2+和2例TNBC）进行CITE-seq。

2.肿瘤亚型

ER+，HER2+和TNBC。

3.研究思路

4.主要结论

本文结合单细胞RNA测序、空间转录组测序构建了迄今最全面乳腺癌单细胞和空间图谱，并开发了一种与sc RNA-seq 兼容的内在亚型分类方法（SCSubtype），揭示了复发性肿瘤细胞异质性。通过 CITE-seq 免疫表型分析提供了高分辨率的免疫特征，并发现与临床结果相关的新 PD-L1/PD-L2+巨噬细胞群。使用单细胞特征，对大型乳腺癌队列进行解卷积分析，并将它们分为九个 “生态型”，不同生态型显示出与肿瘤样本的临床亚型、SCSubtype亚型及细胞类型的多样化关联，且不同生态型之间的预后也存在明显差异。该项研究提供的乳腺癌细胞结构的综合单细胞和空间图谱，有助对肿瘤异质性的认识，促进乳腺癌的个体化治疗进展。

1.样本选取

8例原发性乳腺癌女性患者的肿瘤样本及配对的正常血液、乳腺和淋巴结样本,通过流式细胞荧光分选技术（FACS）分选的CD45+细胞进行sc RNA-seq；3个额外乳腺癌组织（BC9-11）用于sc TCR-seq和5’ sc RNA-seq。

2.肿瘤亚型

包括表达雌激素受体（ER+）的肿瘤、表达孕激素受体（PR+）的肿瘤、表达人表皮生长因子受体2（Her2+）的肿瘤，以及三者都不表达的三阴肿瘤（TNBC）。

3.研究思路

4.主要结论

利用单细胞转录组对乳腺癌组织中免疫细胞的异质性进行了广泛表征，发现了各种免疫细胞类型，包括单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、 T 细胞、 B 细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞。通过亚群细分，共鉴定出83个不同的免疫细胞簇，包括38个T细胞簇、27个骨髓谱系细胞簇、9个B细胞簇和9个自然杀伤细胞簇。相对于正常乳腺组织，仅在肿瘤中出现的细胞簇包含14个髓细胞簇和17个T细胞簇（比正常组织观察到的细胞簇数增加约一倍）。通过T细胞分化轨迹研究发现T 细胞状态发生了连续性变化，颠覆了之前较少分化或激活离散状态形成的肿瘤微环境经典概念。该研究中sc RNA-seq和sc TCR-seq数据集的综合分析，将有助于更好地理解免疫细胞促进和抑制肿瘤进展潜在的功能机制。

1.样本选取

正常乳腺、癌前 BRCA1 +/–组织、主要乳腺癌亚型（ TNBC、ER+、HER2+、男性乳腺癌）、成对肿瘤和受累淋巴结（LN），共55例患者的69个不同的手术组织样本。

2.肿瘤亚型

ER+，HER2+和TNBC。

3.研究思路

4.主要结论

该研究提供了迄今为止关于人类乳腺组织的最全面的单细胞RNA图谱，提供了科学家们理解其中所包含的不同细胞类型的框架。此外，根据不同分组研究了多层面分组的生物学问题：如发现绝经前到绝经后的转变与显著的间质改变有关，成纤维细胞中的PDGFRb和基质相关基因减少；癌前病变到肿瘤的进展与 BRCA1 突变携带者中免疫浸润的增加有关；在不同的乳腺癌亚型中，肿瘤的上皮细胞显示出类似的多样性；组织常驻记忆T细胞（TRM）在TNBC和HER2+中明显，但在ER+肿瘤中不明显；TNBC包括最大的CD8+细胞群，而ER+肿瘤CD8+T细胞减少，提示不同的免疫调节模式；与TNBC和HER2+肿瘤相比，ER+肿瘤具有活跃的循环肿瘤相关巨噬细胞（TAM）；在ER+肿瘤患者中，克隆选择和大量迁移都是淋巴结转移的原因等。本文研究结果对于理解乳腺癌的产生机制，以及对于理解周围环境中的细胞如何促进乳腺癌进展、扩散和对治疗的反应具有非常重要的意义。

针对肿瘤组织等异质性高的样本，传统的高通量测序技术仅能提供样本中所有细胞转录水平的平均值，而单细胞转录组突破了传统Bulk测序技术的限制，实现了在单个细胞层面解析其基因表达状态和功能的研究目的，特别适用于解析多种细胞组成、研究复杂细胞功能、追溯细胞发育和探究细胞间相互作用等研究。上述文章采用单细胞测序技术，解析了高度异质性乳腺癌的复杂细胞组成，并深入探究了肿瘤微环境和不同组织学意义的异质性，从而解决了肿瘤异质性的难题，为进一步阐明肿瘤的起源发生、转移播散、治疗耐药等问题奠定了基础。

参考文献

1. Wu SZ, Al-Eryani G, Roden DL, et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers[J]. Nature Genetics , 2021, 53(9):1334-1347.

2. Azizi E, Carr AJ, Plitas G, et al. Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment[J]. Cell , 2018, 174(5):1293-1308.

3. Pal B, Chen Y, Vaillant F, et al. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast[J].? The EMBO Journal , 2021, 40(11):e107333.

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