FEBS发布CRISPR技术特刊(CRISPRa基因过表达技术)

FEBS发布CRISPR技术特刊

2016年09月10日讯 《FEBS Journal》杂志近日发布了一份介绍如何使用CRISPR/Cas9的特刊，它包含9篇综述文章，由知名研究人员撰写，包括哈佛大学的George Church和Norbert Perrimon，西班牙阿利坎特大学的Francisco Mojica，以及Sloan Kettering纪念癌症中心的Ralph Garippa。

这份特刊覆盖了CRISPR的发现、CRISPR筛选、表观遗传编辑、模式生物和疾病模型中的CRISPR、向导RNA（gRNA）设计、脱靶效应，以及在治疗应用中与RNAi的比较。

“我们希望这些综述就像它们介绍的技术一样将是有用的，立足于科学事实，并为探索提供指导，”Broad研究院遗传扰动平台的主管John Doench在文中写道。

如今，科学界对CRISPR技术的热情日益高涨。论文的数量在呈系数增长。然而，许多研究人员仍在苦苦挣扎，不能很好地使用它。“即使是十分成熟的工具，如限制性内切酶、抗体和Sanger测序，日常应用中仍时有失败，需要进行故障排查，”Doench写道。“每篇综述头脑冷静地评估了如何最好地应用这项技术、它的优势以及它的局限性。”

CRISPR最早是在细菌中发现的，作为细菌的适应性免疫系统。20多年前，Francisco Mojica发现了细菌中的CRISPR结构。这一次，他与米格尔埃尔南德斯大学的Francisco Rodriguez-Valera一起介绍了这项技术的一些背景。

CRISPR/Cas9系统也作为一种新颖的筛选方法，来鉴定生物过程中的重要蛋白。Sloan Kettering纪念癌症中心的Ralph Garippa和John Poirier以及约翰？霍普金斯大学的Linde Miles为这一应用提出了一些建议。

George Church以及他实验室的一些成员讨论了CRISPR革命的下一站：RNA指导的表观遗传调控。最近，Cas9蛋白与效应物的融合，如转录激活子、抑制子和组蛋白修饰物，实现了可编程的转录和表观遗传调控。这篇综述讨论了基因调控的CRISPR工具，以及使用这些工具的最佳做法。

还有几篇综述主要介绍了CRISPR在疾病建模和模式生物中的应用。Sloan Kettering纪念癌症中心的Geulah Livshits及其同事介绍了利用CRISPR来研究体内的基因功能，重点在小鼠的疾病建模；西北大学的Erik Andersen和Mostafa Zamanian介绍了CRISPR在线虫中的应用，以研究热带疾病；宾夕法尼亚大学的Kiran Musunuru和Jennie Lin则介绍了利用CRISPR建立疾病模型时的注意事项。

CRISPRa基因过表达技术

上回说到，基因功能研究，最常用的策略就是功能获得和功能失活。基因过表达、基因干扰、基因敲除，这三板斧挥出去，配合下游的转录谱分析、表型分析，基因功能的神秘面纱，往往就能解开一角。

基因过表达技术，通常是指将目的基因的ORF构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因表达量增加的目的，可以使用的载体类型有Virus-Free转座子载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。

CRISPRa(转录激活)，作为基因过表达技术的新成员，是通过催化失活的Cas9（dCas9）连上转录激活子，来实现促进基因组特定位点的转录。

目前CRISPRa已经发展出好几个新版本。MIT的CRISPR先驱张锋通过改造dCas9和sgRNA优化了转录机器的招募，成功将RNA表达水平提升了一个数量级。张锋团队用自己的改良版CRISPRa激活了十个基因,研究显示，这些基因的转录都得到了两倍以上的增涨，许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。他们发现，CRISPRa离转录起始位点越近，转录激活的效果就越强。如果CRISPRa靶向转录起始位点的上游（超过200bp），触发的转录就会更为温和，更接近生理水平。通过这一途径揭示了基因表达量与表型强度之间的线性关系。

加州大学的Jonathan Weissman研究团队在dCas9上融合了一连串短肽（也就是SunTag array），这些短肽相当于一套分子挂钩，能在细胞中招募多拷贝的转录激活子，生成强劲的信号。

综合看CRISPRa（基因激活）系统是用于转录激活内源性基因的强大工具。完整的CRISPRa系统包含三个组分，每个组分分别由单独的载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。

gRNA/MS2表达载体，包括两个138-nt发夹RNA适体，形成噬菌体MS2衣壳蛋白的结合位点。这些发夹RNA适体与gRNA连接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

MS2/P65/HSF1辅助载体驱动由MS2，p65（NF-kB的反式激活亚基）和HSF1（人热休克因子1的激活结构域）组成的三结构域融合蛋白的表达。

dCas9/VP64辅助载体驱动催化失活变体dCas9和合成型VP64反式激活结构域融合蛋白的表达。

当这三种载体共转导细胞时，用户定制的gRNA可能会募集MS2/P65/HSF1（通过MS2结合发夹适体与gRNA连接）和dCas9/VP64（通过CRISPR/Cas9复合物组装） 到gRNA靶位点，从而组装出强大的SAM复合物。这些SAM复合物可通过VP64，p65和HSF1激活结构域之间的协同作用实现靶位点的强烈转录激活。

该载体系统可用于激活单个或一系列基因的转录，也可用于基因组的大规模筛选，使用gRNA序列文库来产生gRNA/MS2表达载体文库。?

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.??

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi:?10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPR a vs ORF 传统过 表达 技术

相比于传统ORF稳转过表达技术，CRISPRa通过激活内源性启动子高效转录，从而促进基因表达，不需要额外构建外源性表达元件，不受基因转录本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此，CRISPRa技术在长转录本基因过表达研究、单基因多转录本的整体激活研究具有不可替代的优势。

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基因定点突破技术在什么才被普遍认为获得了成功

基因定点突破技术是指通过定向改变某个特定基因的碱基序列，来实现基因的修饰、修正或修复的技术。在这个技术的发展历程中，有几个关键的里程碑被认为是其成功的标志。

首先是1993年，由美国加州大学伯克利分校的研究人员发明了CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术。这项技术基于细菌天然的免疫系统，利用CRISPR序列和Cas9酶，实现了在准确的基因位点进行精确的基因编辑和修饰。

随着CRISPR技术的出现，人类基因编辑技术进入了一个全新的时代。2012年，科学家首次利用CRISPR-Cas9技术在哺乳动物细胞中进行了基因编辑。这标志着该技术在实验室条件下的成功应用。

2015年，中国科学家使用CRISPR技术成功进行了非人灵长类动物（猴子）基因编辑，这意味着该技术已经能够在更复杂的生物系统中实现精确的基因编辑。

2016年，美国研究人员首次在人类胚胎中使用CRISPR技术进行基因编辑。虽然这项研究引起了伦理和安全方面的争议，但这标志着该技术在人类基因编辑方面的潜力和前景。

综上所述，CRISPR技术的出现和发展被认为是基因定点突破技术的成功之一，其成功应用于哺乳动物和更复杂的生物系统中，以及在人类基因编辑方面的初步尝试，都进一步表明了该技术的潜力和前景。

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