我学者开发精确的CRISPR注释程序(争当第二作者的苏尔斯顿如何获得诺贝尔奖？)

我学者开发精确的CRISPR注释程序

2016年09月10日讯 CRISPR系统对于原核生物免疫系统对抗入侵元素发挥关键的作用，也被设计成促进真核生物基因组的靶向基因编辑。近期，来自中科院深圳先进技术研究院、湖北工业大学和吉林大学等处的研究人员，在《Scientific Reports》发表一项研究，提出了一种精确的从头CRISPR注释程序--CRISPRdigger，可以将一部分组装的基因组作为其输入。

这项研究的通讯作者是吉林大学计算机科学与技术学院的周丰丰教授，其2000年本科毕业于中国科学技术大学少年班，2005年在中国科学技术大学计算机学院获博士学位，是吉林大学“唐敖庆”教授，博士生导师，中国科学院百人计划，IEEE（美国电气和电子工程师协会）高级会员，主要从事健康大数据挖掘核心算法的研究。

CRISPRs是原核生物基因组中的重要遗传因素，可从外来元素（如噬菌体）积极获取模板序列，用于随后的序列特异性切割。这些外来模板序列的长度从24到48?bp不等，其中穿插分布着保守的重复序列。一种CRISPR通常是由结合在其密切侧翼区上的前导区的一个相邻CRISPR相关（Cas）基因转录的。在超过40%的已测序的原核基因组中，CRISPR / CAS系统充当一种反入侵的免疫机制。

作为一种真核生物基因组编辑技术，CRISPR/Cas系统吸引了相当多的关注，因为它可切割特定的序列信号。发展最好的酶是来自化脓性链球菌的核酸酶Cas9，用一段合适的向导RNA片段，它可能在任何基因组的位置进行切割。另一种广泛使用的基因组编辑技术TALEN，需要研究人员为每个靶基因组位置合成一种核酸酶，比起只合成一种向导RNA，这成本更高，而且更费时。随着临床应用对靶专一性的要求越来越高，目前已经推出了一些Cas9突变体，它们具有超过50倍的较高特异性。

目前，已经开发出一些计算机程序，用于原核基因组中天然CRISPR的从头检测。自上世纪80年代被发现以来，研究人员已经分析了2762个原核生物基因组，在47.14%的基因组中检测到了CRISPRs，平均每个基因组有1.47个CRISPR。然而，原核生物的基因组测序在加速，在2015年9月，NCBI的微生物基因组数据库中就包含了4278个基因组。因此，在一个新完成测序的原核生物基因组中从头注释CRISPRs，对于更好地了解这个免疫系统是必要的。PILER-CR来源于重复检测程序PILER20，并在一个小的基因组中筛选CRISPRs。CRT筛选一个基因组中确切的k-mer / k-nucleotide重复序列，并将相邻的重复序列连接到候选CRISPRs。CRISPRFinder使用Vmatch来检测连续定位的重复序列，并能够更好地注释DR边界和短CRISPRs。

本研究提出了一种新的从头CRISPR检测程序--CRISPRdigger，并重点检测弱的DR信号，在当前的文献中这通常是被错过了。从头重复检测程序RepeatScout被用来在一系列的序列长度范围内找到重复拷贝。在这些重复拷贝被聚类之后，弱的DR副本被RepeatMasker注释--通过将模板DRs映射到基因组中。与现有程序的比较是基于来自dbCRISPR数据库的金标准CRISPR注释，在2014四月14日进行了更新。

研究人员发现，dbCRISPR包括DRs和间隔的所有的位置和序列信息。它比其他程序更方便和准确。实验数据表明，CRISPRdigger可能是对现有工具的一个很好的补充。该论文对本研究所使用的数据和crisprdigger算法进行了描述，接着对dbCRISPR中注释的CRISPRs进行了基本概述，并对CRISPRdigger与现有的程序进行了综合比较。

争当第二作者的苏尔斯顿如何获得诺贝尔奖？

苏尔斯顿，图片来自诺贝尔奖官网

导语：

3月14日，76岁的霍金离开了，备受世人关注。而在上周的3月6日，76岁的诺奖得主苏尔斯顿也离开了人世，却“走”得静悄悄。

事实上，纪念伟大科学家最好的方式，是继续他们未完成的事业。苏尔斯顿可以说是细胞图谱工程的先驱。他开拓了细胞谱系领域，过去数十年未有很大的突破，直到最近两年有了重大进展，西雅图华盛顿大学的Jay Shendure结合最新的测序技术和CRISPR基因编辑技术，开发了高通量解析高等生物细胞谱系的办法。在其他一些科学家的牵头下，另一个可能给生命科学带来巨变的科学大工程：人类细胞图谱工程（Human Cell Atlas）也在近期展开。也许我们离解析生物发育的全部秘密，已经不再遥远。

撰文孙梦逸

责编叶水送

2018年3月6日，2002年诺贝尔生理学或医学奖得主约翰苏尔斯顿（John Sulston）爵士与世长辞，享年76岁。这一消息得到了苏尔斯顿生前任职的桑格研究所（Sanger Institute）的确认，死因是胃癌。

苏尔斯顿爵士曾两次撼动世界：第一次是追踪线虫（C.elegans）的完整细胞谱系（cell lineage）；第二次是帮助并促成了人类历史上最宏伟的国际合作项目之一——人类基因组计划（HGP）。

1942年3月，苏尔斯顿出生在英国白金汉郡富尔默小镇。他的父亲是一位基督教牧师，母亲则是一位英语教师。尽管出生在一个基督教家庭（从小接受基督教教育），小时候的苏尔斯顿就展现了对物理世界运行规律的热爱，并顺理成章地把科学作为以后的发展方向。当然，对科学的了解让他几乎是不可避免地同时失去了对基督教的信仰，这曾让他的父母非常苦恼。但苏尔斯顿开明的父母最终还是选择了尊重孩子的兴趣和意志。

这里有个小插曲：苏尔斯顿当时出于一时冲动选择了攻读生物学。和今天一样，他的身边充满了劝退的人。尽管如此，苏尔斯顿还是坚持了自己的决定，修读了生物、物理和化学。

1960年，在分子生物学开始兴盛的年代，苏尔斯顿来到了当时分子生物学的中心——剑桥大学攻读学士学位。和大多数年轻人一样，苏尔斯顿的大学生涯也经历过迷茫：不善交际的痛苦，去剧院追剧和课业的冲突，以及作为一个心灵手巧但读书不好（“I'm not a books person but a hands person”）的少年，被充满识记的生物学折腾得够呛。当然在大学的最后一年，他幡然醒悟，回归正途。

拿到学士学位之后，苏尔斯顿继续在剑桥大学攻读博士学位，师从科林里斯（Colin Reese），研究多聚核酸的合成。那是他学术生涯的开始，也是他以后美满人生的发端——在这里，他认识了一生的挚爱，当时在剑桥大学做助研的达芙妮芭特（Daphne Bate）。

苏尔斯顿的博士阶段过得十分愉快，加上没有书本的束缚，他可以尽情地发挥自己动手的特长。三年内，他就获得了博士学位，并和芭特喜结连理。毕业之后，根据导师的建议，他把天赋带到了美国的西海岸，地处圣地亚哥的Salk 研究所，跟从Leslie Orgel研究有关生命起源的化学机理。

在Salk的第二年，Leslie把他引荐给了分子生物学的泰斗，当时还在剑桥大学的弗朗西斯克里克（Francis Crick）和悉尼布伦纳（Sydney Brenner）。那时的分子生物学可谓如日中天，风头无两。然而几位分子生物学的开山之祖，却在这时悄然转变了方向。克里克和西莫本泽（Seymour Benzer）都转向了神经科学，而布伦纳在那时鼓捣起了不被人看好的新模式生物——线虫。

线虫，图片来源 sanger.ac.uk

这是一种通体透明、体长仅一毫米左右的蠕虫。因为通体透明，所以易于在显微镜下观察，饲养起来也非常方便，给它们喂大肠杆菌就成了。线虫的繁殖周期也短，大约3天左右，这让线虫成为十分理想的模式动物。然而，这些都是后见之明，当时的学界对布伦纳的选择充满了嘲讽，有的学者甚至把线虫和一种扁虫搞混。苏尔斯顿却因此对布伦纳的工作产生了强烈的兴趣：好的科学就是要做别人都不在做的事情（“there's little point in doing what everybody else is doing”）。在布伦纳的劝说下，苏尔斯顿回到了梦开始的地方——剑桥大学，加入了布伦纳的研究组。这儿又有一个小插曲：回到剑桥之前，苏尔斯顿机缘凑巧，参加了一个暑期项目，学到了一种观察神经递质在组织分布中的小技巧。

这一技巧让苏尔斯顿在繁忙的线虫分子遗传学实验之余，开启了一个小项目：观察线虫的神经元。这个小项目倒没让他发现什么重要的神经元。然而，敏锐的苏尔斯顿注意到一件事情：比起刚孵化的线虫，成体线虫似乎多了几对神经元。这是个让人惊讶的发现，因为在当时大多数人都认为线虫的发育在孵化出来之后就停止了。于是苏尔斯顿有了观察线虫孵化后的细胞发育谱系树（cell lineage）的想法。

什么是细胞发育谱系呢？多细胞生物的发育，都是从单个细胞（受精卵）开始的。通过细胞分裂和分化，一变二，二变四，最终形成整个组织分明秩序井然的生物体。这个过程可形象地描绘成一棵倒置的树。

细胞谱系树简图，图片来源Aaron et al,2016

树的顶端是受精卵，每一次分叉代表一次细胞分裂事件，而树的终端（底部）代表的是成体生物的每一个细胞。这棵树就是细胞谱系树。如果我们能够知道这棵树的全貌，相当于知道了生物的整个发育过程。想知道人类的肝脏是如何发育过来的？查查人类细胞谱系树（如果有的话）里对应的肝细胞，往上回溯到顶点，你就知道了这个器官发育的整个过程。

除此之外，如果能够知道谱系树上每一个节点对应的细胞内部发生的分子事件，比如哪些基因在这个节点被激活或沉默，我们就掌握了细胞类型切换的钥匙。掌握了这把钥匙，也许有一天我们可方便地制造出各种各样的健康器官，用于替换病变或衰老的人体器官，人类的寿命也将会大大延长。

可以说，发育生物学的全部问题，就是绘制和注释这棵细胞谱系树。布伦纳早有做线虫的细胞谱系树的想法。不过，当时大家都认为线虫在孵化之后就停止发育了，研究的重点一直在胚胎产生到孵化前的阶段。但观察这一阶段的细胞谱系极其困难。原因是在胚胎发育早期，大量细胞会发生重排，这让细胞追踪起来极具挑战。当线虫孵化之后，定位细胞就容易得多了。然而，孵化之后的线虫观察起来也有其他的困难：线虫会到处爬。最后苏尔斯顿采用了一个巧妙的办法：在视野的中心放置一盘美味的大肠杆菌。这样线虫就会在视野的中央缓缓蠕动，观察就变得容易多了。大约在苏尔斯顿研究出怎样观察线虫孵化后的发育的同时，另一位日后获得诺贝尔奖的科学家罗伯特霍维茨（Robert Horvitz），加入了布伦纳实验室。两人通力合作，共同把线虫孵化后的发育树绘制了出来，论文发表在Developmental Biology杂志上（影响因子：2.944）。发表的时候还有一件趣事：两人据说争当第二作者，都想把credit给对方。最后是霍维茨争赢了：他知道苏尔斯顿并不喜欢写作，于是提出自己来写文章，苏尔斯顿由此被列为第一作者。这之后，两人分别转向了不同的方向：霍维茨转而研究在观察细胞谱系发育过程中发现的细胞凋亡现象，而苏尔斯顿则再接再厉，和约翰怀特（John White）、朱迪思金布尔（Judith Kimble）等人把孵化前的细胞谱系也绘制出来了。下图就是线虫的完整细胞谱系树：

线虫的完整细胞谱系树，图片来源：Sulston JE,2003

这也是迄今为止唯一的细胞谱系树。凭借这个工作，苏尔斯顿获得了2002年的诺贝尔生理学或医学奖。与他一同获奖的是他的搭档：霍维茨和他的老师布伦纳，霍维茨主要贡献是细胞凋亡机制，而布伦纳是这一切工作的开始。

在完成细胞谱系的工作之后，苏尔斯顿又一次展现了他不凡的眼光。所有人都认为，苏尔斯顿应该接下去研究那些可导致细胞谱系变化的基因突变。苏尔斯顿的想法是：这个分析已有不少人在着手做了，参与进去还有什么意义？他把眼光转向了对线虫基因组进行测序的可能性。他也是第一批尝试用生物信息的方式组装基因测序片段的人，还自学当时常用的编程语言：Fortran，写了一个半自动的组装小程序。

与此同时，在苏尔斯顿的共同倡议和推动下，生命科学研究史上第一个国际合作的大工程——人类基因组计划启动。苏尔斯顿的工作主要是募集资金和组织合作，这里不再细表。值得一提的是，在推动人类基因组计划的同时，苏尔斯顿和当时的测序竞争对手、私人公司塞雷拉基因组公司（Celera Genomics）的领头人克雷格文特尔（Craig Venter）对基因组测序结果是否应该商业化，有过著名的论争，它也是科学家参与公众议题的典范。

2018年3月6日，苏尔斯顿因胃癌去世，结束了他传奇的一生。

参考文献

[1] Sulston, John E."NOBEL LECTURE: C. elegans: The Cell Lineage and Beyond." Bioscience reports 23.2-3(2003):49-66.

[2] Brenner, Sydney."Nobel lecture: nature's gift to science." Bioscience reports 23.5-6(2003):225-237.

[3] Horvitz, H. Robert."Worms, life, and death (Nobel lecture)." Chembiochem 4.8(2003):697-711.

[4] Brenner, Sydney."In the beginning was the worm?." Genetics 182.2(2009):413-415.

[5] McKenna, Aaron, et al."Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing." Science 353.6298(2016): aaf7907.

[6] Regev, Aviv, et al."Science forum: the human cell atlas." Elife 6(2017): e27041.

[7]https://www.nobelprize.org/nobelprizes/medicine/laureates/2002/sulston-bio.html

斑马鱼基因敲除常规流程及关键步骤质控标准及注释

一、设计方案

1.1 基因的基本信息

确认基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI等查询。

1.2?分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析

1.3分析蛋白质的保守结构功能域

通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。

1.4分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况

一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。

二、CRISPR活性验证

2.1分析并确认基因组序列

设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。

该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。

2.2合成sgRNA

使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。

2.3显微注射

将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。

2.4活性验证

随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。

[if !supportLists]1）?[endif]如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；

[if !supportLists]2）?[endif]如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）

三、突变体制备及确认

3.1 F0饲养

如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。

3.2 F0可遗传突变的确认

将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。

3.3 F1饲养

将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。

3.4 F1确认

将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。

四、最终交付产品

至少获得3尾以上移码突变F1代斑马鱼（不限雌雄、不限具体突变类型），以及上述结项报告一份。

后续服务

一般客户拿到3尾移码突变斑马鱼并不能直接做实验，还需要继续扩繁、建系或做后研究等，因此我们也有后续服务。

五、突变体传代

释义：根据客户具体要求，通过自交（或者杂交），将某一种（或者多种）突变型扩大种群（或保持种群。

根据客户常规要求，我们一般提供30~40尾（雌雄各不少于8尾）经尧顺禹鉴定后的确认为突变体的Fn+1代斑马鱼。

六、表型观察及基因功能研究

定制化服务，依据客户实际要求实现。

?一、设计方案

1.1 基因的基本信息

确认基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI等查询。

1.2?分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析

1.3分析蛋白质的保守结构功能域

通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。

1.4分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况

一般使用CCTOP，少数物种如没有可找其它专业网站。

二、CRISPR活性验证

2.1分析并确认基因组序列

设计Genotyping引物，确认实际基因组序列与理论匹配情况，如CRISPR靶点验证与理论序列存在出入，需回到1.4重做。

该步骤还需要确认引物扩增条件，以备后用，如不能正常扩增需要重新设计，并且不能进行下一步操作。

2.2合成sgRNA

使用Thermo转录试剂盒转录，完成后需测定浓度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。

2.3显微注射

将上述合成好的sgRNA按照一定的比例与Cas9蛋白预混，使用显微注射技术将其注入斑马鱼早起胚胎中。

2.4活性验证

随机选取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通过PCR后将其产物送商业公司sanger测序，需要看到至少有一组在靶向位置存在Indel突变。

[if !supportLists]1）?[endif]如有，挑取存在Indel突变的亚克隆确认；

[if !supportLists]2）?[endif]如没有，回到2.3或2.2或1.4（具体回到哪一步需要根据实际情况决定）

三、突变体制备及确认

3.1 F0饲养

如2.4验证有活性，一般需要显微注射400~500枚胚胎作为F0（一般由胚胎发育至成体有10~20%），至少需要40尾以上的F0。

3.2 F0可遗传突变的确认

将上述F0亲本与野生型杂交（或者自交），将所产胚胎随机选取8枚经测序确认，如存在Indel突变，则该F0亲本即为可遗传突变体。以此方法至少鉴定出3尾可遗传的F0。

3.3 F1饲养

将3.2至少3尾亲本经交配，每组一般15~25尾，一般总量需到达40~50尾。

3.4 F1确认

将3.3的F1饲养至2~2.5月龄,获得其尾鳍基因组，通过PCR后测序确认其具体基因型（要求必须是移码突变或出现提前终止密码子的突变）。

四、最终交付产品

至少获得3尾以上移码突变F1代斑马鱼（不限雌雄、不限具体突变类型），以及上述结项报告一份。

后续服务

一般客户拿到3尾移码突变斑马鱼并不能直接做实验，还需要继续扩繁、建系或做后研究等，因此我们也有后续服务。

五、突变体传代

释义：根据客户具体要求，通过自交（或者杂交），将某一种（或者多种）突变型扩大种群（或保持种群。

根据客户常规要求，我们一般提供30~40尾（雌雄各不少于8尾）经尧顺禹鉴定后的确认为突变体的Fn+1代斑马鱼。

六、表型观察及基因功能研究

定制化服务，依据客户实际要求实现。

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