CRISPR先驱Nature子刊揭示重要机制

CRISPR先驱Nature子刊揭示重要机制

2016年09月10日讯 CRISPR是规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的缩写。CRISPR与内切酶Cas是一对好基友，细菌依靠它们组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能够在引导RNA的指引下，靶标并切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统使用简单而且扩展性强，很快便成为了生物学领域最耀眼的明星。

在细菌的CRISPR-Cas适应性免疫系统中，Cas1-Cas2蛋白复合体会捕获30-40bp的外源DNA，将它们整合到CRISPR的间隔区，形成自己的免疫记忆。如果这种外源DNA再次入侵，细菌就能够及时将其剪切，从而保护自身安全。外源DNA整合应当是特异性很强的，不然就会损害基因组或CRISPR序列。然而令人吃惊的是，这种活动在体外显得相当混乱。

加州大学伯克利分校的研究团队九月五日在Nature Structural & Molecular Biology杂志上发表文章，向人们展示了CRISPR免疫对基因组完整性的保护。这篇文章的通讯作者是著名CRISPR先驱Jennifer A. Doudna。Doudna教授是CRISPR技术的共同开发者，曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（Breakthrough Prize），是CRISPR专利的有力竞争者。

研究人员发现，酿脓链球菌（S. pyogenes）II-A型Cas1-Cas2整合酶通过限制整合第二步来维持特异性。在非CRISPR位点，整合会停在位点中间，使反应能够逆转。酿脓链球菌的Cas1-Cas2对旁边的前导重复序列有很高的特异性，能够识别重复序列的回文末端。这项研究指出，DNA插入位点没有此前人们以为的那么普遍，这样可以防止CRISPR免疫适应的毒性，有助于维持基因组的完整性。

加州大学伯克利分校以Jennifer A Doudna为首的研究团队取得了诸多令人侧目的CRISPR研究成果。去年四月Doudna领导的研究团队在Science杂志上发表文章，为人们揭示了CRISPR-Cmr 复合体结合靶标的具体机制。他们通过冷冻电镜技术获得了天然III型Cmr复合体及其与目标RNA结合时的分子结构，获得了接近原子水平的高分辨率。

去年十月，Doudna及其同事在Nature杂志上发表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶结构域构象状态直接控制了DNA切割活性。他们通过分子内荧光共振能量转移（FRET）实验，鉴定了HNH核酸酶结构域的一种激活构象。研究还证实，一个α-螺旋将HNH的构象改变传达给RuvC结构域，激活它实现DNA切割。

今年年初，Doudna的研究团队揭示了CRISPR-Cas9准备剪切DNA时的关键分子结构。在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白与小CRISPR RNA（crRNA）形成复合体，切割与RNA互补的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一个典型特征，基因组编辑常用的sgRNA就会和Cas9形成R-loop。为了阐明R-loop的作用，研究人员通过冷冻电镜获得了酿脓链球菌Cas9 R-loop的高分辨率结构。

crispr/cas9细胞系敲除和shRNA的区别

两种技术方法的差别还是非常大的，各有优劣：

两种技术方法的对比

但是Cas9有很多是只有这个技术才能实现的：

1、对目的基因引入点突变；

2、敲除circRNA、LncRNA、miRNA等非转录的序列；

3、进行大片段的基因敲除研究调控序列的功能；

所以这个些高级的基因研究就必须使用Cas9基因敲除技术了，而RNA干扰就望尘莫及了。

所以不同的方法在不同的应用场景下面，都有其有点和局限性，孰优孰劣取决研究者的目的。

关注Cas9X，让更多的研究者使用Cas9X发表自己的SCI文章。

“基因魔剪”安全性再遇什么挫折？

6月11日，顶级学术期刊《自然》（Nature）子刊《自然-医学》（Nature Medicine） 同时发表了两篇新成果，给持续受到追捧的“基因魔剪” CRISPR技术泼了冷水。来自瑞典卡洛林斯卡研究所和剑桥诺华生物医学研究院的两个研究团队分别将关注点投到了一处：CRISPR编辑成功或增加患癌风险。

两个团队认为，CRISPR/Cas9基因编辑过程中造成的DNA双链断裂，会激活p53蛋白通路，引起人多能干细胞的凋亡。反过来也就是说，经基因编辑后还能存活下来的细胞，通常存在p53功能缺陷。?

p53缺陷是至今已知的与癌症相关的最普遍的基因突变。p53基因被称为“抑癌基因”，其编码的p53蛋白的重要作用之一是调控细胞分裂和增殖。正常情况下，一旦该基因察觉有严重DNA损伤或染色体结构变异的“坏”细胞，p53基因会抑制细胞的分裂，并引导细胞自杀，因此也被冠以“基因警察”称号。?

CRISPR技术的安全性再次受到质疑后，首当其冲的是几家基因编辑领域内的公司。Editas Medicine、Intellia Therapeutics、CRISPR Therapeutics这三家在纽约纳斯达克上市的公司， 6月11日当天股票均大幅下挫，跌幅分别为7.8%、9.81%和12.59%。截至6月12日，仅Intellia Therapeutics一家收住跌势翻红，上涨1.55%。?

增加患癌风险
此前的研究发现，CRISPR/Cas9技术运用到人多能干细胞（hPSC）时，效率通常低下，仅为其他细胞类型的1/5或1/10。然而，多能干细胞因其具有分化成多种成体细胞的潜能，在疾病治疗时被寄予厚望。??研究团队认为，在基因编辑前后，确保p53功能正常至关重要。毕竟，如果编辑成功的前提是p53缺陷，运用到临床治疗的后果是增加患者的患癌几率。

CRISPR Therapeutics首席执行官Sam Kulkarni此番也表示，该研究结果看起来是有道理的。并表示，这是我们该重视的地方，尤其是目前 CRISPR 疗法被应用于越来越多的疾病中。我们要确保这些编辑过的细胞不会在回输体内后成为癌细胞。

来源：澎湃新闻网

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