如何在癌症研究中使用CRISPR工具

如何在癌症研究中使用CRISPR工具

2016年10月05日讯 对CRISPR技术而言是具有里程碑意义的。这一天，美国NIH的重组DNA顾问委员会给美国的第一例临床试验开了绿灯。研究人员计划用CRISPR/Cas9技术来增强癌症疗法。这距离它的发现，仅仅只有四年。

Horizon Discovery的首席科学家Jon Moore认为，基因组编辑在药物靶点的鉴定和验证以及直接的细胞治疗上具有重要的意义。例如，Horizon已经启动了一项混合文库筛选，寻找与抑癌基因p53相互作用的基因。他们鉴定出MDM2，作为另一种潜在的药物靶点。“那些保留了野生型p53活性的癌细胞对MDM2的敲除十分敏感，”Moore说。

如果你也希望在自己的实验室中开展此类研究，那么你应该感到幸运，市场上的工具在不断涌现，且功能也很强大。

gRNA文库

对于希望在抗癌研究中使用CRISPR的人们来说，最有用的工具之一是向导RNA文库。这些文库通常有两种形式。芯片是将文库分配到一块或多块微滴定板的各个孔中，每孔包含针对单个基因的游离gRNA。筛选条件取决于特定的应用，但这种文库可以鉴定出增强肿瘤耐药性的基因。

赛默飞世尔的Invitrogen? LentiArray?文库就是慢病毒文库芯片，针对每个基因有四个gRNA。据该公司的研发主管Jon Chesnut介绍，他们致力于研究整个人类基因，但目前只有针对人类激酶组和GPCR的集合。

默克旗下的Sigma-Aldrich与Wellcome Trust Sanger研究院也合作开发出一款Sanger Human Whole Genome Arrayed Lentiviral CRISPR文库。它大约包含40,000个gRNA，针对人类和小鼠的每个基因有两个gRNA。

在混合文库中，所有用于筛选的gRNA都混合在单个管中。之后，用这个混合物来转导细胞，其中每个细胞都挑选一个表达载体。将细胞进行阳性或阴性选择，如药物处理，并测序存活细胞，研究人员可确定哪些gRNA是最有效的。

混合文库可从GE生命科学/ Dharmacon、默克/Sigma-Aldrich及安捷伦科技等公司购得。安捷伦在2月推出了一个文库的早期试用计划，它是基于Broad研究院的GeCKO v2慢病毒文库，总共包含123,411个向导RNA。这家公司也提供定制文库，最多提供20万个自行设计的gRNA。

Sigma-Aldrich也开发一种gRNA文库，专门用于它的dCas9-p300激活物载体。这个文库可上调目标基因的表达，而不是敲除或修复基因。据基因编辑开发部门的主管Patrick Sullivan介绍，这种文库可鉴定哪个基因的激活能让治疗更有效，或确定新的成药靶点。它预计在2017年推出。

CRISPR的导入

对于那些设计CRISPR实验的研究人员，Takara Bio欧洲的技术支持专家Cornelia Hampe提出了两方面的建议。首先，考虑到脱靶效应的可能性，每个目标应当设计多个向导RNA，大概四至五个。最好利用多个工具来设计它们，并在体外进行检验，之后才用到细胞上。她的第二个建议是控制Cas9表达的强度和持续时间，特别是在开发治疗剂时。

“在大多数情况下，如果是非常强的稳定表达，则有可能导致脱靶效应，”她说。“作为治疗剂，你需要确保脱靶效应尽可能地低。”

如何实现这一点？尽管研究人员有多种选择来导入Cas9和gRNA，包括DNA质粒表达、病毒载体、体外转录系统和纯化的mRNA，甚至是完整的核糖核蛋白复合物，但大多数专家表示，有经验的人选择瞬时导入。

“此时最流行也最有效的Cas9形式是纯化的蛋白或纯化的RNA，”Chesnut谈道。对于前者，研究人员将纯化的Cas9和体外转录的RNA混合，通过电穿孔或利用专门的试剂（如赛默飞世尔的Lipofectamine? CRISPRMAX?）导入细胞。

另一个选择是Takara的“gesicle”（糖蛋白囊泡）技术。据Hampe介绍，gesicle是布满糖蛋白的纳米颗粒。经过专门的包装细胞系的包装，这些颗粒具有广泛的细胞趋向性，可导入分裂和非分裂细胞。它们拥有红色荧光蛋白标志物，可照亮感染的细胞。此外，它们在快速编辑后快速清除。

类器官培养

另一个基于CRISPR的癌症研究工具是3D细胞培养，又称类器官培养。根据最新的一篇综述，类器官是来源于原代组织、ESC或iPSC的体外3D细胞簇，具有自我更新和自我组织的能力，并且表现出与来源组织相似的功能。

有了类器官和CRISPR，研究人员能够在正常细胞中引入突变，或者校正癌细胞中的突变，然后监控细胞的增殖能力或药物反应，以及它们的转录组或蛋白表达图谱。

在最近的一项研究中，荷兰Hubrecht研究所的研究人员利用CRISPR基因编辑，在人类野生型肠道上皮细胞类器官中引入四个与结肠直肠癌相关的突变。之后，培养物表现出染色体不稳定性，当注射到免疫缺陷型小鼠之后形成肿瘤，这表明它们代表了结肠癌的一个真实模型。

也许，这些工具在几年之后才能真正地步入临床。不过，考虑到CRISPR研究的速度，可以肯定地说，新工具还将不断涌现。

CRISPR 2.0 可微调的基因修饰技术

破解超级细菌的防护罩：南极海绵iPS万能细胞的研究开发蓝图认识基因检测癌细胞生长的开关：基因启动子(Promoter)？ 在日常生活中，我们早已习惯可微调水量和温度的水龙头、可依需要调整亮度的电灯、以及可随喜好改变甜度和冰度的手摇饮料。同理来说，基因修饰技术亦是如此，CRISPRi 作用非常精确，鲜少会影响到目标以外的基因；CRISPRa则可将原来基因表现增加 1,000 倍以上，精准度也非常高。

相较之下，当前最热门的 CRISPR 基因修饰技术就显得僵化许多，因为 CRISPR 作用的原理就是锁定目标基因将其剪下，然后再换上一段修饰完成的基因。所幸分子生物学家也注意到这样的问题，近期更推出 CRISPR 的 2.0 进阶版，预期运用价值和范围将可大幅超越传统的 CRISPR 1.0 技术。

CRISPRi + CRISPRa：基因表现随你调

CRISPR 2.0 技术由美国史丹佛大学的团队所研发，作法是将原先 CRISPR 技术用来剪下和贴上基因的剪刀酵素 Cas9 换掉，改为可降低 (CRISPRi) 或增加 (CRISPRa) 基因表现量的各种酵素。目前 CRISPRi 可将基因表现量压制到原来的 1-10% 左右，且作用非常精确，鲜少会影响到目标以外的基因。CRISPRa 则可将原来基因表现增加 1,000 倍以上，精准度也非常高。由此可知，CRISPRi + CRISPRa 系统可让基因调控的幅度相差 10 万倍以上，相当惊人，也比只能做剪下和贴上的 CRISPR 1.0 技术增加许多应用价值。

基因在天地之间，平衡是王道

人生并不是非黑即白，而生物体更是讲求平衡，过于极端的治疗反而应用价值有限。而目前已知人类许多代谢性疾病和癌症可能是源自基因的异常表现，但基因本身其实没有任何突变或问题。在这种情况下， CRISPR 1.0 技术就无用武之地，因为基因本身若没有问题，单靠剪下贴上是无法表现过高或过低的现象。CRISPR 2.0 技术此时就能扮演导正的角色，而且作用具有时效性和可逆性，可设定在一段时间内发挥功能就好。这对于未来基因医学的运用其实更有潜力，相关临床发展颇令人期待。

探索园地 1. CRISPR 2.0技术原始作者对该技术的深入分析: Gilbert LA et al. Cell 2014; 159:647-61. doi: 10.1016/j.cell.2014.09.029. 2. CRISPR 2.0技术的未来展望与潜在应用: Lau E. Nat Rev Ge 2014; 15:778-9. doi: 10.1038/nrg3850.

本文授权转载自： 基因领域最专业媒体团队－基因线上GENEONLINE

话题： CRISPR, 基因, 基因修饰

耶鲁大学发布新型免疫疗法结果，有望为癌症治疗带来新突破

近年来，通过人体自身免疫系统抵抗肿瘤的免疫疗法为肿瘤治疗的发展拓展了更多可能性。相对于手术、放疗、化疗等治疗方式，免疫疗法的副作用相对较小，也对一些其他疗法不起作用的情况有不错的疗效。但由于目前的免疫疗法主要包括 免疫检查点单克隆抗体治疗、过继性免疫细胞治疗、人重组细胞因子（非特异性免疫疗法）、溶瘤病毒疗法和肿瘤疫苗治疗 几个方面，然而这些疗法在临床应用上仍然面临各种限制，并非万无一失，肿瘤细胞仍然有逃脱免疫细胞“检查”的可能性，因此急需开发新类型的肿瘤免疫疗法。

近期，耶鲁大学研究团队将其关于治疗肿瘤的一项新的免疫疗法结果发布于《Nature Immunology》期刊上。这篇名为“Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity”的文章中所展现的结果表明，基于CRISPR激活（CRISPRa）平台的多重激活内源基因免疫疗法（MAEGI，Multiplex Activation of Endogenous Genes as Immunotherapy）可靶向特定类型的癌细胞并激活相关基因表达，通过精确定位、标记并放大信号，使免疫系统攻击标记的癌细胞，可有效杀伤或消除小鼠体内多种类型的肿瘤。这种治疗方式通过改变肿瘤微环境，并以增强T细胞浸润和抗肿瘤免疫为特征。多路内源性基因激活是一种多用途的、高度可伸缩的策略，以引发针对肿瘤的有效免疫反应，有别于所有的肿瘤疗法。这项研究有望帮助人类的免疫系统识别、攻击并杀死癌细胞。

首先，研究人员用腺相关病毒来递送CRISPRa文库到肿瘤内部并精准靶向肿瘤的突变基因。研究表明通过CRISPRa慢病毒载体转染三阴性乳腺癌（TNBC）细胞E0771?，使得细胞同时表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1，并进而利用磷酸甘油酸脂激酶PGK基因的启动子激活OVA蛋白的表达从而得到E0071-OVA稳转细胞系，并与分离出来的经OVA体内活化的CD8+?T细胞进行共培养，来评估此肿瘤免疫疗法的有效性。TAAs(肿瘤相关抗原)低表达的肿瘤细胞经CRISPRa激活后可在细胞膜表面高表达TAAs，并被免疫系统的CD8+?T细胞识别和杀伤。

在上述的模式研究模型的基础上，研究人员将MAEGI疗法拓展到了小鼠身上，并借助AAV-CRISPR体系递送sgRNA文库到C57BL/6J小鼠的TNBC肿瘤内部，结果发现相比PBS处理组和空载质粒组，导入AAV-g-MAEGI小鼠的肿瘤生长受到了显著的抑制，于此同时ELISA实验也证明AAV-g-MAEGI组小鼠有着更多IFNγ的产生和更多数目的活性CD8+?T细胞。以上结果也表明，通过MAEGI疗法，小鼠体内的抗肿瘤免疫活性得到了显著增强。

最后，研究者借助单细胞测序技术，在细胞水平进一步验证了活化的免疫细胞群的组成，发现C57BL/6J乳腺癌小鼠在经过不同剂量的AAV-MAEGI治疗后，高剂量组的小鼠体内有着更高比例的CD4+和CD8+活性细胞，显示了MAEGI疗法可通过增强免疫反应来达到消除肿瘤的目的。

综上所述，研究者证明了通过CRISPRa直接激活内源性突变基因可以放大肿瘤细胞的“非自身”信号，从而诱导强大的抗肿瘤适应性免疫。各种形式的MAEGI，包括AAV-g-MAEGI和AAV-p-MAEGI，以及任何内源性基因激活治疗的未来衍生物，提供了一种正交模态的肿瘤免疫治疗模式，即作为单一药物或与其他治疗模式协同使用。在进入I期临床试验之前，MAEGI的未来临床转化还需要排除过表达的潜在有害基因，优化成分和设计，在动物模型中评估毒性，以及开发成药的探究性研究。

抗癌英雄免疫细胞

美国生物学家乔治戴利曾说：如果20世纪是药物治疗时代，那么21世纪就是细胞治疗的时代。在精准定位和识别癌细胞相关抗原的基础上，人体的免疫系统会开始攻击标记的癌细胞，其中杀伤性的免疫细胞作为尖兵构成了抗肿瘤免疫系统的核心力量，因此免疫细胞是抗癌战役中真正的英雄。正常人体每天都将产生上百个癌变细胞，但它们在形成肿瘤病灶前就基本被免疫细胞消灭了。所以优质的免疫系统是人体自身最好的医生。过继性免疫治疗（Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT），是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫细胞治疗主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T、CAR-T等几大类。其中CIK（cytokine-induced killer），又称为多种细胞因子诱导的杀伤细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此， 应用 CIK细胞被认 为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案 。

CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%～5%，在体外经多因子培养28～30天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上，进而再回输到体内，发挥响应的功能活性，CIK的活性主要有以下几方面：

(1) CIK细胞增殖速度快，抗肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强。(2) CIK细胞具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用。(3) 杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗，对多重耐药肿瘤细胞同样敏感。(4) 是典型的个性化生物治疗模式。将这类细胞回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对肿瘤治疗施以双重的作用。(5) 由于CIK细胞是活化的自体细胞，用起来非常安全。

然而免疫细胞也有质量之分，随着年龄的增长，人体的免疫细胞也会发生相应的变化，其细胞活力及数量会随着年龄的增加而减弱。例如，人在40-50岁时，免疫细胞的功能（活力和数量）就仅为身体巅峰时期的1/2。这在一定概率上增加了人体的患病（如肿瘤等疾病）风险。为避免这一问题，尖端生物科技的细胞存储技术应运而生，这种技术可以将细胞存储一定的时期，保证其功能和活性不受因时间推移产生明显的影响。如果能将人体年轻时的优质免疫细胞进行存储，在需要时提取使用，无疑对于抗感染、抗肿瘤及提高自身免疫力等方面都有很大的帮助。

免疫细胞存储—您的“健康种子”

免疫细胞存储是指利用先进的生物技术，从人体血液中分离并富集一定数量的免疫细胞，结合细胞的生物物理因素，将免疫细胞保存在-196℃的低温条件下，从而维持免疫细胞的多样性与高活性潜能，使细胞处于休眠状态，待需要时再进行复苏和扩增，用于精准细胞治疗和美容抗衰老等领域。具体来说就是利用特定的细胞冻存基质，这些基质通常含有冷冻保护剂DMSO或者甘油以及血清组分，并通过缓慢的梯度降温历经4℃、-20℃、-80℃并最终达到-196℃，也可通过商业化的细胞冻存盒将细胞直接放入-80℃并进而放入液氮中。细胞复苏则强调的是快速，即将液氮中的细胞直接放入37℃进行水浴，快速升温减少细胞复苏过程中冰晶等融化带来的伤害，通过慢冻存快复苏可以最大程度的减少细胞的受损程度，维持细胞的高活性。

细胞存储的目的是为了将来使用，无论是防病、治病还是抗衰老，都对存储细胞的机构的科研能力和存储能力有很高的要求。在国内相关的企业中，吉涛健康与中国科学院在近日签署了免疫细胞科研战略合作协议。雄厚的科研实力和专业的市场化管理，让双方的合作在细胞存储、制备及科研转化等方面形成了四位一体的细胞全流程服务链条。中国科学院种子库冻存细胞的服务更为吉涛生物的用户打造了多点备灾的保险柜，可为用户终身存储细胞。

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