CCR：抗体/小分子组合治疗展现对抗成神经细胞瘤的新希望

CCR：抗体/小分子组合治疗展现对抗成神经细胞瘤的新希望

2016年10月11日讯 最近来自美国洛杉矶儿童医院萨班研究所的研究人员进行了一项研究，进一步揭示了细胞因子TGFβ1在成神经细胞瘤生长中的作用，并且提示了小分子药物/抗体组合疗法治疗这种癌症的可能性。相关研究结果发表在国际学术期刊Clinical Cancer Research上。

成神经细胞瘤是一种发生在神经组织的实体瘤，也是最常见的一种儿童癌症类型，大约一半发病儿童不到两岁，占全部儿童癌症死亡的15%。使用一种叫做dinutuximab的抗体药物靶向成神经细胞瘤表面高表达的GD2分子是目前治疗这种疾病的一种治疗方法。但是这种基于抗体开发的治疗方法仍不足以防止癌症复发。

除了直接靶向参与疾病发生的分子，许多抗体疗法还靶向激活自然杀伤细胞（NK细胞）。NK细胞是一类受到抗体激活以后能够杀伤肿瘤细胞的免疫细胞。最近发现类似TGFβ1这样的蛋白分子能够抑制肿瘤微环境中NK细胞的抗癌功能。

TGFβ1是一种执行许多种细胞功能的分泌蛋白，其功能包括控制细胞生长、增殖和细胞死亡。在这项研究中，研究人员找到一个对抗成神经细胞瘤的新组合治疗方法，其中既包括抗体药物dinutuximab，又包含一种叫做galunisertib的小分子药物，这种药物能够抑制TGFβ1的作用。研究人员将成神经细胞瘤细胞系或病人来源的成神经细胞瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内在对其进行组合治疗，发现galunisertib介导对TGFβ1的抑制，让dinutuximab和NK细胞能够更加有效地杀伤成神经细胞瘤。

"将galunisertib这种药物加入到基于NK细胞的细胞疗法中能够抑制肿瘤生长，促进移植了肿瘤组织的小鼠模型的存活。"洛杉矶儿童医院萨班研究所的独立研究员Robert Seeger这样说道。他表示galunisertib能够逆转TGFβ1诱导的对细胞杀伤作用的抑制，或可提高基于抗体的免疫治疗方法对成神经细胞瘤的治疗效果。

肝癌的免疫治疗是怎样的？

肝癌的形成和发展过程中，可以通过干扰和抑制机体免疫功能逃避免疫系统杀伤作用。研究发现，肝癌患者淋巴细胞亚群，CD4阳性细胞降低，阳性细胞增高，导致下降，NK细胞、LAK细胞的活性亦明显下降，外周血T细胞亚群及NK活性呈明显抑制状态，患者经过继免疫治疗后，T细胞亚群及NK细胞活性明显改善。

临床类型不同的肝癌，TIL浸润程度亦不同，无TIL浸润的患者，术后生存时间较TIL浸润的短，肝癌复发率也明显增高。在肝癌患者血清和肝癌细胞培养上清液可发现一些能抑制机体免疫功能的物质。

通过调节和增强机体免疫力，达到对肝癌细胞抑制或杀伤效果的治疗方法，称为免疫治疗。临床常用冻干卡介苗、转移因子、免疫核糖核酸、干扰素、阿地白介素（白细胞介素2）、肿瘤坏死因子等。

近年应用IL-2/LAK和IL-2/TIL等过继免疫疗法治疗肝癌，取得了一定的疗效。采用合并化疗免疫或过继免疫化疗，以及单克隆抗体为载体的导向治疗，呈现了良好的趋势。但确切的疗效尚未肯定，有待进一步研究。

可分为主动、被动和过继免疫。根据特异性，又可以分为特异性和非特异性免疫。

（1）主动免疫治疗：①特异性主动免疫治疗：特异性主动免疫是将肿瘤细胞抗原加入完全或不完全佐剂，制成疫苗，对机体进行主动免疫，以提高机体对肿瘤的免疫力。Hanna等采用豚鼠荷瘤模型进行特异性主动免疫治疗发现，将静脉注射106肝癌细胞的豚鼠作为治疗组，90天以后，对照组动物全部死亡，而治疗组动物存活率为66.7%，同时观察到本方法与化疗能起协同杀伤作用。目前，特异性主动免疫治疗的方法有：制备肿瘤多肽疫苗和基因工程疫苗：

根据肿瘤相关抗原的结构，制备出相对特异的疫苗，使机体产生特异性免疫效应。

抗独特型抗体疫苗：抗肿瘤抗体高变区存在独特型抗原，而抗特异抗原的抗体高变区与肿瘤抗原结构相似，从而可以模拟肿瘤疫苗触发机体的抗肿瘤反应。

但是，主动特异性免疫尚存在某些缺陷，近年来，已经加强某些相关的治疗研究，如加强肝癌细胞MHC-I、B7等基因的表达，使得免疫细胞能更有效地识别和清除肿瘤抗原，达到更好的治疗效果。

②主动非特异性免疫治疗：采用非特异性免疫制剂，增强网状内皮系统功能，激活效应细胞，提高机体非特异性免疫能力，以发挥抗肿瘤效应的治疗叫主动非特异性免疫治疗。目前常用的免疫刺激剂和调节剂有四类：微生物及其制剂：冻干卡介苗、短小棒状杆菌、链球菌及病毒等。生物制剂：如干扰素、肿瘤坏死因子、胸腺素等。

化学制剂如左旋咪唑等。

以下介绍几种常用药物。

①冻干卡介苗：冻干卡介苗能非特异性地激活巨噬细胞和T淋巴细胞、K细胞、NK细胞，这可能是其抗肝癌的主要作用机制。临床试验表明冻干卡介苗对肝癌具有一定的疗效。单纯应用冻干卡介苗治疗143例Ⅱ期肝癌患者，一年生存率为25.8%，而对照组仅为13.4%。冻干卡介苗与肿瘤疫苗联合使用，疗效更好。

如接种冻干卡介苗后，皮肤溃疡数月才愈合，说明机体防御能力良好，如对疫苗无反应，则提示预后不良。冻干卡介苗一般用量为6×108个活菌，通常采用皮内接种、皮上划痕、口服和瘤内注射、腹腔注射等给药途径。毒副反应主要有局部皮肤红肿、溃烂，发热、肌肉酸痛、畏寒等感冒症状群，体温一般不超过39℃。

②短小棒状杆菌：短小棒状杆菌能刺激单核细胞和巨噬细胞，提高机体非特异性免疫功能。短小棒状杆菌结合化学治疗，使晚期肿瘤患者生存期较单纯化疗对照组延长2倍。用短小棒状杆菌加顺铂腔内灌注治疗肝癌腹水患者，有效率远高于单用顺铂的对照组。

短小棒状杆菌临床常用剂量为4mg/次，1次/周。注射途径有瘤内、皮下、肌肉、静脉和腹腔等。

③链球菌制剂（OK432）：OK432是从溶血型链球菌中开发出来的一种生物调节剂，它可以刺激淋巴细胞对肿瘤组织的反应，具体机制尚不太清楚。将OK432局部注射于肿瘤组织，能使肿瘤缩小，AFP水平下降。将OK432与肝癌的其他治疗方法如手术切除、动脉栓塞、化疗等联合使用，可以起到协同杀伤肝癌细胞的作用，患者生存期明显延长。

④干扰素（IFN）：最初发现，人体在接触病毒后会产生一种干扰病毒生长和增殖的蛋白质，称之为干扰素，后来发现，干扰素对许多恶性肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。目前认为干扰素的抗肿瘤机制为抑制肿瘤病毒的繁殖及癌细胞中癌基因的过表达，调节宿主的免疫活性，如激活单核.巨噬细胞、NK细胞活性，介导细胞毒效应，促使内源性干扰素的产生，促进肿瘤相关抗原、MHC-I类抗原的表达，提高效应细胞对肿瘤细胞的识别能力。

根据抗原特异性和分子结构的不同，将干扰素分为α、β、γ三种。

由白细胞（主要为淋巴细胞）生成的主要为IFN-α，由成纤维细胞生成的主要为IFN-β，由植物血凝素刺激正常淋巴细胞或经抗原致敏淋巴细胞接触同种抗原后生成的主要为IFN-γ，现已可以通过生物工程技术，生产出生物学作用相同，活性更强的各种干扰素。

IFN已大量应用于肿瘤的临床治疗，对血液系统肿瘤的疗效良好，单独应用实体瘤治疗仅对肾癌、恶性黑色素瘤疗效较可靠。但应用IFN与化疗等联合应用治疗肝癌，癌肿缩小程度和患者生存时间均高于对照组。比较三种干扰素的抗肝癌作用发现，IFN-γ的抗肿瘤作用比IFN-α、IFN-β疗效强。

IFN目前常用的给药途径为肌内注射，一般剂量为次，1次/d或隔日1次。常见的副反应有发热、畏寒、肌肉酸痛等流感样症状，少数患者可出现轻度骨髓抑制现象。副反应在用药初期往往较明显，以后逐渐减轻，停药后症状消失。

⑤肿瘤坏死因子（TNF）：TNF是单核巨噬细胞受内毒素刺激后产生的一种非糖基化蛋白，由巨噬细胞产生的为TNF-α，由淋巴细胞产生的称TNF-β，由NK细胞生成的称为TNF-γ。其抗癌机制为：

能特异性、选择性抑制肿瘤细胞DNA合成；通过肿瘤细胞表面受体介导内化，进入溶酶体，发挥细胞毒作用；损伤或阻塞肿瘤血管，引起肿瘤组织出血性或缺血性坏死；增强免疫功能，活化淋巴细胞，激活NK细胞；可促进IFN-γ的生成；通过增强肿瘤血管内皮细胞MHC-I型抗原的表达，提高前凝血素的产生和降低血栓调节素的生成，促进血管内皮细胞转变为表面促凝，引起肿瘤血管内血流凝固，介导肿瘤组织细胞的坏死。

将TNF与化疗药物氟尿嘧啶（5-Fu）、顺铂（DDP）、多柔比星（ADM）或丝裂霉素（MMC）混合，加用碘化油和吸收性明胶海绵为栓塞剂治疗中晚期肝癌，肿瘤缩小率、手术切除率及生存期均较单纯化疗栓塞组高。有研究将表达TNF的真核表达系统导入肝癌细胞，发现其体外的致瘤性较对照组明显减弱。

TNF可用于肌内注射、皮下注射、静脉滴注、动脉灌注和腔内注射，由于其半衰期短，必须连续大剂量用药方能奏效。目前临床应用TNP治疗肝癌的经验尚不多，给药方法、剂量有待进一步完善。常见的副作用有寒战、高热、乏力、肌痛、恶心、呕吐，一过性ALT和肌酐升高，血小板和白细胞减少，严重者可出现毛细血管渗漏综合征。

（6）阿地白介素（白细胞介素-2）：IL-2是由抗原活化辅助性T细胞分泌的一种细胞因子，主要诱导效应细胞的增殖和活化，增强细胞毒或溶细胞活性。阿地白介素（IL-2）可以诱导细胞毒性T细胞、NK细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、CD3单抗激活的杀伤细胞（CD3AK）等效应细胞，增强对肿瘤细胞的杀伤效应。

（2）被动性免疫治疗：被动性免疫治疗是应用肝癌相关抗原的抗体，通过抗体介导的细胞毒作用达到杀灭肝癌细胞的作用。目前极少单独应用抗体对肝癌进行被动免疫治疗，多采用抗体为弹头的导向治疗，详见导向治疗。

（3）过继性免疫治疗：①特异性过继性免疫治疗：应用特异性抗原致敏的淋巴细胞及其因子，如转移因子、免疫核糖核酸对肿瘤的治疗，称之为特异性过继免疫治疗。

转移因子是一种小分子核酸肽，有免疫特异性，无抗原性，主要作用有：特异性转移细胞免疫反应。“抗原依赖”性增强淋巴细胞的反应性。非特异性刺激作用，提高细胞免疫功能，促进单核细胞吞噬功能，诱导干扰素生成。

转移因子配合化疗和中药治疗肝癌，能提高机体免疫功能，减轻临床症状，使肿块缩小，AFP水平下降，转移因子通常用于皮下注射，毒副作用较少见。

②非特异性过继性免疫治疗：应用非特异性免疫因子/免疫效应细胞对恶性肿瘤进行治疗的方法，叫非特异性过继性免疫疗法（AIT）。

AIT自20世纪80年代以来，已进行了大量的基础和临床应用研究，它不受宿主免疫状态的影响，也不引起免疫耐受，目前研究最多的是淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润淋巴细胞及白细胞介素-2。

LAK细胞：将来自患者或异体的淋巴细胞，体外培养经IL-2诱导，转变成非特异性杀伤淋巴细胞，然后回输患者体内，利用被诱导激活的淋巴细胞，发挥对肝癌细胞的杀伤效应。LAK细胞的前体细胞可能是具有细胞毒活性作用的异质细胞群体，不受MHC-Ⅰ型抗原的限制，也不受肿瘤抑制因子的影响，具有广谱的抗肿瘤作用，因此，对逃避NK细胞“捕获”的肿瘤细胞也有广泛的杀伤作用。

最初LAK细胞是取自肿瘤患者外周血淋巴细胞，由于血液来源有限，使LAK细胞的应用受到一定程度的限制。继之研究发现，来自同种异体的淋巴细胞，如取自脐带血的淋巴细胞，经IL-2诱导活化后同样具有相同的生物学功能，从而为LAK细胞拓宽了来源。人们曾尝试能否应用大剂量阿地白介素（IL-2）在体内对淋巴细胞进行活化而达到LAK细胞的治疗效果，实践证明尚存较大的距离，可能的原因是阿地白介素（IL-2）半衰期短，不能维持足够的高浓度，而过大剂量的阿地白介素（IL-2）对机体的毒副作用大，难以耐受，从而使体内环境不利于LAK细胞的激活和扩增。

目前倾向于经肝动脉途径给药，这样可以增加局部有效细胞数量，减少LAK细胞用量，减轻毒副反应。有癌性胸腹水者可经胸、腹腔内给药。阿地白介素（IL-2）与LAK细胞可以同时输注，亦可经外周静脉维持滴注。一般治疗的LAK细胞数量应达到次，8～10次为1个疗程，阿地白介素（IL-2）用量为（1～3）×105U。

LAK/IL-2的毒副作用主要为畏寒、发热、皮疹等。

肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）：分离肝癌组织或癌周淋巴结中的淋巴细胞，经体外IL-2诱导活化和扩增，然后回输到患者体内，对肝癌细胞产生杀伤作用，即为TIL疗法。与LAK细胞比较，TIL的细胞来源不同，TIL的前体细胞绝大部分是细胞毒T淋巴细胞，能表达T细胞抗原，多数CD4、CD8阳性。TIL细胞经IL-2诱导后，扩增能力强于LAK细胞，容易获得所需要的效应细胞数。由于TIL细胞接受自体肿瘤抗原的持续性刺激，特异性高，杀伤活性比LAK细胞强50～100倍，因仅对自体来源的肿瘤细胞具有识别和杀伤作用。

TIL细胞输入体内后迅速分布在肺脏中，24h后聚集于肝、脾，48～72h在癌灶中达高峰，可维持5～9天。

由于TIL主要是利用患者瘤内或癌旁淋巴结的前体细胞，所以临床应用受到一定的限制。

免疫学技术知识总结 第二章

第二章 抗体制备技术

抗体的基本概念：多克隆抗体（多个淋巴细胞克隆所分泌的抗体）和单克隆抗体（单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体）

单克隆抗体的特点：

高度均质（同一亚类），化学组成均一，不含或很少含Ig

特异性强，只针对某一种抗原表位

亲和力强

抗原用量少，无须纯化

无批间差异

来源稳定，可达批生产，容易标准化

不易形成沉淀线

操作比较麻烦

什么条件下需要制备单抗：

目的蛋白有类似的结构

抗原不纯，无法分开

多抗的效果不好（已经排除非特异性反应）

希望将抗体用于治疗，研制成药物

希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂。

第一节?? 多克隆抗体的之别

一、多克隆抗体制备的原理

抗体制备、动物免疫、抗体纯化

二、多抗的基本条件

1.? ?免疫原的制备

颗粒性抗原：细胞、病毒、细菌等，一般具有较强的免疫原性，可以不加佐剂，直接进行腹腔注射。

可溶性抗原：可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核细胞或者真核细胞中表达，可溶性抗原需要与弗氏佐剂完全或不完全混匀，才可以进行免疫。

（1） 完全抗原的提取：细胞破碎法、抗原提取、抗原的纯化

（2）半抗原与载体的交联：载体的选择、半抗原与载体偶联的方法、偶联复合物的鉴定

（3）合成肽抗原：免疫原性肽的选择、肽的合成和纯化

2. 免疫动物的选择：

3.? ?佐剂的准备：

佐剂的种类：无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂

三、多克隆抗体制备的基本方法

1.? 抗原计量、免疫途径与免疫日程

免疫动物的方法：

免疫原值被：

无佐剂免疫法：适用于颗粒性抗原

弗氏佐剂免疫法：适用于可溶性抗原

铝佐剂免疫法：适用于人的免疫

免疫动物（一般选择雌性动物，温顺并且可以生产）

皮内免疫法

皮下或肌肉免疫法

淋巴结免疫法

混合法

抗体效价满意后静脉注射加强免疫

常见的注射方法；皮下注射、皮内注射、尾静脉注射、静脉注射

2.? ?小样试血与采血

抗血清的获得：眼眶取血、颈动脉放血、心脏采血

免疫效果评价：取血（兔耳动脉、鼠尾静脉）、检测（双向免疫扩散、ELISA）

3.? ?抗体的分离和纯化技术

盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析、亲和层析法、电泳分离法

亲和层析法原理：利用蛋白质之间的特异性结合（抗原-抗体、受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合，捕捉与他相配的物质，洗脱另外一种物质，并且洗脱一般用改变pH的方法。

主要步骤：将蛋白质与活化柱子结合，将腹水或者血清处理后过柱子，用结合缓冲液洗柱子（知道A280为零），永安氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液，测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品。

4.? ?抗体的鉴定

蛋白质浓度的测定：紫外分光比色法、双缩脲法、福林酚法、

免疫效果评价：双向免疫扩散、ELISA

纯度分析：免疫印迹（WB）

抗体类别分析：免疫金试条

亲和力分析：ELISA、荧光偏振

5.? 抗体的保存

抗体的浓缩：吸收、蒸发、超滤

抗体的保存：浓缩抗议+甘油+防腐剂

免疫效果不佳的原因可能是：抗原纯度不够、免疫原性低、免疫途径乳化不合格、免疫剂量不合适、动物疾病或者种属差异小。

第二节? 单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理

1个B细胞只能产生1个抗体。方法是细胞工程杂交技术和B细胞杂交瘤技术

需要将单克隆B细胞和肿瘤细胞相结合才可以永久产生单抗

Barski等发现细胞额自然融合现象，但是频率很低

冈田等发现灭火的仙台禀赋和聚乙二醇能显著提高细胞融合的效率。

二、单抗制备的基本条件

需要培养正常的B细胞以及B细胞融合的肿瘤细胞

1.? ?动物的免疫抗原与载体、动物的选择、免疫途径

举例：小鼠免疫

第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂——小鼠背部皮下注射（4周后）

第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂——小鼠背部皮下注射（3周后）

第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（10天后检测血清效价）

加强免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（3天后）

细胞融合

2.? 酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养

细胞DNA合成途径：

次黄嘌呤（H）通过嘌呤合成跑路途经合成HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）进一步合成鸟嘌呤核苷酸

胸腺嘧啶核苷（T）通过嘧啶合成旁路途经合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），进一步合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸

氨基酸、谷氨酰胺、鸟核苷单磷酸通过核酸生物合成主要途径结合上面两步合成的鸟嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脱氧核苷酸形成DNA

将第三步当中氨基端变为氨基碟呤（A），则无法形成DNA。

因此酶缺陷型细胞的筛选就是HAT筛选

3.? ?单抗检测方法的建立

免疫酶技术

免疫荧光技术

免疫扩散技术

三、单抗制备的基本方法

1.? ?酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养

组织培养的基本条件：

仪器：包括CO2培养箱、倒置显微镜、超净台、液氮罐、低速低温离心机

试剂：培养液、HAT选择培养液、HT培养液、血清、抗生素

耗材：培养板、培养品、吸管、移液管

骨髓瘤细胞系的选择要点：

（1）? 所选的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同

（2）? 自身不产生免疫球蛋白的重链和轻链

（3）? 对氨基碟呤敏感

（4）? 与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌的Ig杂交细胞

2.? ?饲养细胞的制备

饲养细胞的作用：

（1） 增加细胞浓度，满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的要求

（2）? 吞噬清楚死亡的细胞

（3）? 分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长

饲养细胞的种类和制备方法

（1）? 小鼠腹腔巨噬细胞

（2）? 小鼠脾细胞

（3）? 成纤维细胞

3.? ? ?脾细胞的分离

（1）? 拉颈椎处死小鼠

（2）? 无菌操作取出脾脏

（3）? 清洗、研磨

（4）? 收集细胞

（5）? 离心洗涤

（6）? 细胞计数

4.? ? ?细胞融合：骨髓瘤细胞和脾细胞按照1:10或1:5的比例混合并加入促融剂PEG

细胞融合的方法：PEG融合、仙台病毒、电融合

5.? ? HAT选择性培养

?????? HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成右主要途径和补偿途径。当A存在是，能够阻断DNA合成的主要途径，须通过补偿途径合成DNA，这时就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。

?????? 由于选用西黄嘌呤鸟嘌呤荷塘转移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在细胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）细胞作为亲本，该校只能通过群全条件的DNA培养基才可合成，因此杂种细胞通过互补作用获得HGPPT或者TK基因。只有杂种细胞可以活，酶缺乏性细胞完全无法存活，单克隆B细胞一般不能长期生长，就起到了分离杂交细胞的作用。

?????? 细胞生长情况：融合3-4天之后，可以看到刑诉骨髓瘤细胞，混元透亮的克隆。融合后第7-9天去培养上清，检测特异性抗体。

?????? 筛选后存活的细胞就是脾细胞和骨髓瘤细胞融合细胞。

6.? ? ?阳性克隆的筛选

分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的检测方法

免疫酶技术：简介ELISA法

免疫荧光技术：间接免疫荧光测定法、流式细胞分析技术（阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清，阳性对照：免疫鼠血清）

7.? ? ?克隆化培养：阳性细胞的单克隆化

克隆是指由单个细胞繁殖、扩增而形成的性状均一的细胞集落的过程。

常见方法有：有限稀释法和软琼脂克隆技术

有限稀释法：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞。

软琼脂克隆技术：从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，一适当浓度杂交瘤细胞加入到软琼脂培养基中，形成有一个细胞增殖来的细胞集群。

单克隆抗体的鉴定：

（1）? 抗体敏感性检测：对腹水和培养基上清进行效价测定

（2）? 抗体特异性鉴定：是否与其他抗原右交互反应。

（3） 抗体效价测定

（4）? 抗体亚类鉴定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM

（5）? 抗体亲和力鉴定

（6）? 识别表位分析

8.? ? 单克隆抗体的扩大生产：细胞培养法、小鼠体内诱生法、生物反应器

细胞培养法：杂交瘤细胞、培养瓶或罐中培养、收集上清液、纯化抗体

动物体内诱生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液体是啦或降植烷、腹腔内接种杂交瘤细胞、收集腹水

生物反应器：发酵罐培养

单抗培养常见的问题：

（1）? 污染：培养环境、操作

（2）? 融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基

（3）? 抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、培养体系有问题

（4）? 杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性

第三节? 基因工程抗体制备技术

基因工程抗体：通过基因工程的手段，按照个人意愿进行细胞人工改造的技术。

优点主要有：特异性高、质量稳定、成本低廉、工艺简单、异源性滴低、穿透性好、功能丰富。

一、鼠源抗体人源化

鼠源抗体应用中的障碍：免疫原性、半衰期短、抗体功能片段失活。

1.? ? ?嵌合抗体：可变区基因克隆、表达载体的构建、嵌合抗体的表达

2.? ? ?改型抗体

二、小分子抗体：Fab抗体、Fv抗体和单链抗体、单域抗体、最小识别单位

小分子抗体的优点：

（1）可在原核体系中表达，降低生产成本。

（2）因为其分子量小，穿透能力强，易进入病灶部位，有利于对肿瘤等疾病的治疗。

（3）不含Fc片段，不与Fc受体结合，可减少因广泛分布的Fc受体而带来的不利影响。

（4）在体内半衰期短，有利于体内毒性物质的消除

（5）易于进一步基因工程分改造。

三、]基于抗体的应用

1.? ? ?CAR-T免疫治疗：

?????? CAR-T免疫疗法：即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的过继性细胞疗法，即利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞的细胞疗法，并非药物。

?????? CAR-T技术：通过整个嵌合抗原受体的经过基因修饰的T细胞抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原，识别结合后将激活及增值信号传递到T细胞内，引起T细胞激活，增殖释放细胞因子，从而杀伤肿瘤细胞。

2. 免疫检查点

3.? 免疫毒素

4.? ADC

5.? 双特异性抗体

第四节??[endif]抗体库技术

抗体库技术：即用基因克隆技术将全套抗体轻重链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体上，通过原核系统直接表达有功能的抗体分子片段，并筛选出特异性的抗体分子和可变区基因。

一、噬菌体展示技术原理：噬菌体展示技术是将外源蛋白质或者DNA序列查到噬菌体外壳上的适当位置，使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随着噬菌体的重新组装而展现倒是菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已经靠发出单链丝状噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统等。

二、噬菌体抗体制备的基本程序

1.? ? ?收集淋巴细胞提取mRNA并转录到cDNA或直接提取斯堡基因组的DNA

2.? ? ?扩增DNA的抗体可变区基因

3.???? [构建重组噬菌体库

4.? ? ?筛选所需特征的重组噬菌体

5.? ? ?采用突变或链置换使亲和力成熟

三、噬菌体抗体技术的特点

1.? ? ?筛选步骤简单、快速、有效

2.? ? ?扩大了筛选流量，一次就可以筛选多于1010个的克隆

3.? ? ?抗体基因型与表现性联系密切，基因稳定且容易改造

4.? ? 模拟天然免疫系统亲和力成熟过程

5.? ? ?无需人工接种

6.? ? ?可替代动物多克隆抗体

7.? ? ?构建康体苦时。轻重链可变区基因在体外随机组合，可产生体内部存在的轻重链组合，得到新的特异性抗体。

8.? ? ?可以在预案和系统中表达，大规模生产方便，且成本低。

四、抗体库技术的应用

1.? ? ?制备全人源抗体

2.? ? ?改良基因工程抗体

肿瘤免疫治疗的单克隆抗体类免疫检查点抑制

1. Anti-CTLA-4单抗
细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4）又名CD152，是由CTLA-4基因编码的一种跨膜蛋白，表达于活化的CD4和CD8 T细胞。CTLA-4和CD28均为免疫球蛋白超家族成员，具有高度同源性，二者与相同的配体B7-2（CD86）和B7-1（CD80）结合。与CD28功能相反，CTLA-4与其配体B7分子结合后后产生抑制性信号，抑制T细胞激活，是免疫系统一个至关重要的 “刹车”。CTLA-4是使肿瘤细胞免受T细胞攻击的一个重要机制。因此阻断CTLA-4的免疫效应可刺激免疫细胞活化，大量增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。
目前两种靶向CTLA-4的抗体Ipilimumab和Tremelimumab在黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、肺癌等的临床研究已广发开展。1/2期临床研究结果显示两种抗体无论是抗体单药还是联合IL-2，gp100疫苗或化疗均显示安全有效。
Ipilimumab是全人源化单抗，已被美国FDA批准用于晚期黑色素瘤。在肺癌治疗中的Ⅱ/Ⅲ期临床试验也迅速开展。Tremelimumab也是一种人源化CTLA-4单抗，是一种IgG2抗体，目前在多种肿瘤中的临床试验正在进行中。
2. Anti-PD-1/PD-L1单抗
程序性死亡受体1（programmed death 1, PD-1）为CD28超家族成员。 PD-1表达于活化的T细胞，B细胞及髓系细胞，其有两个配体，即程序性死亡配体-1（programmed death ligand 1, PD-L1）和PD-L2。PD-L1/L2在抗原递呈细胞都表达，PD-L1在多种组织也有表达。PD-1与PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，调节T细胞活化和增殖，起到类似于CTLA-4的负调节作用。华裔科学家陈列平实验室首先发现PD-L1在肿瘤组织高表达，而且调节肿瘤浸润CD8 T细胞的功能。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤有重要的意义。
近年来，已有多种Anti-PD-1/PD-L1抗体在肿瘤免疫治疗的临床研究迅速开展。目前Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批准用于晚期黑色素瘤，最近Nivolumab也已被美国FDA批准用于晚期鳞状非小细胞肺癌的治疗。另外，MPDL3280A （anti-PD-L1单抗），Avelumab（anti-PD-L1单抗）等也已进入多个晚期临床研究中，覆盖非小细胞癌，黑色素瘤，膀胱癌等多个瘤种。
3. 其它类型单克隆抗体
其它如增强T细胞第二信号从而促进肿瘤特异性T细胞活化和增值的单抗类，如肿瘤坏死因子TNF受体家族的OX40和4-1BB单抗也在研发中。

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