重大突破：真正的人造卵母细胞(克隆人类是否可以?)

重大突破：真正的人造卵母细胞

2016年10月20日讯 科学家们第一次从实验室重编程小鼠胚胎干细胞（（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）中培育出了功能完整的卵母细胞。这一研究成果公布在10月17日的Nature杂志上，为理解卵子形成进程提供了新的蓝图，也为实现人体ESCs和ipsCs转化提供了技术铺垫。

纽约人类生殖研究中心主任，卵母细胞生物学家David Albertini（未参与该项研究）评价道，“这是真正的一项突破性成果。”

就小鼠而言，卵母细胞的发育开始于原始生殖细胞 （PGCs），这大约需要6.5天的发育时间。雌鼠体内的PGCs进入卵巢后，就开始减数分裂，形成初级卵母细胞，接着就是成熟阶段。2012年，来自日本九州大学的Katsuhiko Hayashi 等人从小鼠的ips细胞中培育出卵子（体内需要5天时间），并使其体外受精后产下健康后代。

最新这项研究则是在其基础上，进一步扩展了他们的培养技术，实现从整个胚胎干细胞到卵母细胞分化的过程，这个阶段在体内大约需要30天时间。

Hayashi等人从任何一种干细胞类型开始，首先通过诱导几个基因生成PGC样细胞（PGC-like），然后将其与雌性性腺体细胞混合，创造出了体外“重组卵巢”。这些细胞会逐渐失去PGC标志表达，开始表达卵母细胞标记。

在培养基中生长了三周后，研究人员观察到了减数分裂前期的初级卵母细胞，这一阶段的一个关键要素在于添加一种雌激素抑制剂，令早期阶段的卵母细胞体外形成卵巢卵泡。

研究人员再在培养基中加入促卵泡素和另外两种因子，这样细胞会分离出毛囊样结构，卵母细胞继续生长11天，组装出全尺寸生发泡卵母细胞。在第三阶段，成熟培养基中培养了一天的生发泡卵母细胞就会成为减数分裂-捕获卵母细胞。

Albertini认为，“这一研究最终克服了体细胞环境下雌性生殖细胞发育的一个关键障碍”，似乎与胚胎微环境细胞之间的相互作用在移植过程中并不需要。

这项研究一共完成了三次单独的培养实验，获得了58个重组卵巢，和3，198个生发泡卵母细胞，其中28.9%能成熟进入减数分裂II阶段。

“最令我感到惊讶的就是当我在重组卵巢中看到一丛次级卵泡和美丽的毛囊结构时，”Hayashi表示。

接下来为了检测这些卵母细胞的质量，研究人员分析了它们的染色体，其中78%具有正确数量的染色体。之后采用RNA测序方法，研究人员观察比对了体内卵母细胞和培养皿来源的卵母细胞的表达情况，结果表明有424个基因出现了或高或低的表达变化，尤其是线粒体功能的基因。

最后研究人员又将这些卵母细胞与野生小鼠精子进行体外受精，移植到雌鼠体内，培养出了健康的，能正常发育的小鼠，不过它们相对于野生型小鼠体质弱一些。

“体外培养卵母细胞的质量有一些变化，因为人造卵母细胞只有3.5%能生成小鼠，而体内的成功率则为60%，”Hayashi说。

但是最后生成的小鼠都很健康，也发育成了成鼠，不过目前要说应用到临床还言之过早，“我们仍然需要进行更多的小鼠和非人类灵长类生物的基础研究。”

另外需要注意的是，这一技术的局限性在于需要来自小鼠的性腺体细胞，这会阻碍人类卵母细胞体外培养的可能性。

克隆人类是否可以?

肯定可以,只是没有被允许克隆
克隆技术即无性繁殖技术。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子结合发育成胚胎，经妊娠后产出新的个体。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。

克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。

英国科学家培育出克隆羊“多莉”，震撼了世界。但是，科学家对克隆技术的认识远没有完结。他们普遍认为，克隆技术还存在很大风险。截止目前，已有越来越多的证据表明，克隆健康的动物远比想象的更为困难。这不能不令人担心动物克隆技术的安全性问题。

3月25日美国各大媒体援引科学家的话说，现有克隆动物技术已经出现许多严重问题，包括克隆动物发育迟缓、心肺存在缺陷、免疫系统功能不健全等。一些从事动物克隆技术研究的专家以及生物学家在接受媒体采访时表示，克隆技术安全性风险并不在于某个特定的程序或是克隆动物发育出现错误，而在于克隆技术过程似乎会使个别基因的表达出现差错，这些差错在生命发展过程中将造成一些无法逆转的问题。尤其严重的是，动物每次克隆过程均无法避免基因变异问题。科学家进一步解释说，动物克隆技术是将成年动物的体细胞，植入一个已经被去掉细胞核的卵细胞中，卵细胞会重新复制原成年细胞的基因，并使其控制胚胎发育，进而借腹形成胎儿，最后诞生一个基因与原提供细胞的动物完全相同的新生命。科学家认为，没有人知道卵细胞如何重新复制原成年细胞的基因，这是克隆技术可能出错的关键原因。

美国麻省理工学院的生物学家罗特夫·詹里斯说，在自然情况下，精子必须经过几个月才能成熟，期间其基因功能也会重新“设定”，卵细胞也会经历类似过程。这一过程必须完美无缺，否则个别基因将会出错，导致后代发育畸形。

与自然生殖过程相比，克隆过程中的卵细胞必须在几分钟或数小时内，完成通常要花几个月或几年才能完成的“任务”。有关分子生物学的试验显示，克隆技术人为地加快动物自然生殖过程，在很多基因复制时出现微妙的错误，造成胚胎停止发育或因克隆动物的基因变异，而在其诞生后产生许多生理问题。科学家表示，“多莉”羊是克隆技术的一个特例，并不代表克隆技术安全或是没有风险。此前，科学家曾取消对克隆动物会过早衰老的担心。“多莉”羊目前生长健康，但科研人员还是不得不将它与其他羊分开饲养，并帮助它“减肥”。继“多莉”羊后，克隆鼠、克隆牛、克隆猪等先后问世，甚至克隆鼠出现第6代复制品。首次克隆出老鼠的美国夏威夷大学生物学家柳町隆造曾表示，一些克隆鼠生长过快，变成肥胖鼠，或是通常肺发育不正常。美国得州A－M大学的克隆专家韦斯金说，克隆牛诞生时常出现心、肺发育缺陷问题。更为关键的是，目前的克隆技术引发的安全性问题还在于克隆技术成功率低。科学家表示，目前整个动物克隆技术的平均成功率不到3％。克隆牛的成功率只有1％。柳町隆造说，虽然克隆鼠的培育率相对高一些，但由于克隆胚胎经常出现遗传发育问题，其成活率很低，只有2％－3％。目前的克隆动物技术使人对其安全性心有余悸，而此前个别科学家提出利用现有克隆技术来克隆人，可能会发生何种情况，更是令人不寒而栗。虽然目前克隆人引起的争议主要集中在伦理道德方面，但科学家指出，真正的问题是在于克隆人可能会出现基因变异，导致克隆人出现致命的生理问题。正像詹里斯博士所说：“克隆人是不顾后果的、不负责任的行为。”

克隆技术研究现状
一、克隆的早期研究
克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。

目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。

采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。

从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。

哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。

二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响
以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。

在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。

三、近3年来克隆研究的重要成果
克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。

1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。

此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。

2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。

在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。

四、克隆技术的应用前景
克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。

转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。

体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。

胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。

克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。

五、克隆技术存在的问题
尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。

在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。

此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。

即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。

除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。
不断有人在评论克隆，可又有几人真正了解呢？要不是学校举行辩论，我会一直以为就象科幻片里说的那样，现在本人认为，克隆技术是好的，但克隆人却要不得，然而即使制定了法律禁止克隆人，也未必就有效，科学狂人太多了，它自身的利用价值也太大了！

卵母细胞成熟过程中哪些因素起作用，是如何起作用的

卵母细胞成熟过程中哪些因素起作用
1 卵母细胞胞质成熟 目前,通常以第一极体排出作为卵母细胞核成熟的标志.在卵母细胞核成熟的过程中卵母细胞质也在经历着成熟的变化［2］.卵母细胞的胞质成熟质量对受精和胚胎发育起着决定性的作用［3］,卵母细 胞质中线粒体和皮质颗粒的变化是目前卵母细胞质成熟的研究重点和重要反映指标. 1．1 线粒体的变化 卵母细胞中含有丰富的线粒体［4］,线粒体的活化与重组影响着卵母细胞的胞质成熟［5］,
线粒体的成熟状况决定着卵母细胞发育成熟质量、受精成功等关键环节［6］.线粒体在大部分未成熟卵子的细胞质中呈现周边分布,线粒体簇较小,在卵母细胞成熟过程中,线粒体数量增加,并且从胞质皮质部向胞质内部发生迁移［7］.IVM 后,线粒体簇变大,着色变深,发育潜能较高的卵子的线粒体在
细胞质中多呈均匀分布,发育潜能较低的卵子中,线粒体仍维持周边分布［8］.线粒体缺乏在胞质中的重新分布是胞质未成熟的标志,与卵子较低的发育潜能密切相关［9］.卵母细胞发育过程中线粒体外迁和增殖,为卵母细胞和卵丘细胞的物质交换提供能量物质,定量研究发现在发育充分的卵母细胞中线粒体DNA复制在生殖泡期已经完成［10］.另外,Combelles和Albertini［11］研究发现,线粒体的分布是细胞质区室化一个较容易观察的指标,细胞质区室化在卵母细胞细胞核和细胞质同步成熟方面发挥重要作用. 1．2 皮质颗粒（cortical granules, CGs）的变化 CGs在细胞质中的分布随卵母细胞的生长发育呈现明显的变化,合成初期散布于细胞质中,之后逐渐向皮质层迁移,排卵前呈单层排列于细胞膜下,卵母细胞活化后皮质颗粒明显减少［12］.在即将排卵的成熟卵母细胞中,皮质颗粒分布于皮质区,邻近质膜处最多.当 CGs 位于卵母细胞皮质下则为胞质成熟,位于中部或由中部向边缘迁移则为胞质未成熟［13］.CGs的合成和迁移因物种不同而异,小鼠卵泡生长之初CGs开始合成,而人的则开始于已有数层卵丘细胞包绕的卵母细胞.随着卵母细胞的成熟,CGs逐渐向细胞的皮质区迁移,当卵母细胞成熟时,CGs沿质膜呈线状排列［14］.微丝驱动着CGs的迁移,但当CGs定位于皮质层时不再受微丝的作用［15］.由于皮质颗粒的分布特性,目前,卵母细胞成熟过程中CGs的分布被作为衡量细胞质成熟的指标［16］.CGs是卵母细胞特有的一个细胞器,它对保证单精受精和胚胎正常发育有着重要作用［17］.侯绍英等［18］研究发现,巯基乙酸能够抑制CGs的迁移,影响小鼠卵母细胞细胞质成熟,从而导致受精时无法实现正常CGs胞吐,造成受精后胚胎发育异常.2 卵母细胞核成熟 卵母细胞核成熟早于胞质成熟,研究核成熟对于提高卵母细胞质量意义重大.卵母细胞在进行减数分裂时,细胞核膜破裂,rRNA合成停止,核仁发生致密化,核内物质与胞质混合,形成生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）.GVBD发生后,染色体凝聚并排列在赤道板上,排出第一极体,直接进入第二次减数分裂并停滞在MⅡ期［19］,显示卵母细胞核已经成熟.目前,生发泡破裂和第一极体排出是卵母细胞核成熟的标志.Watson［20］研究发现体内成熟的卵母细胞发育形成的胚胎比体外成熟的卵母细胞具有更强的发育能力,主要原因是 体外培养的卵母细胞核成熟与胞质成熟不同步,在卵胞质积累发育必要的因子达到完全成熟之前卵母细胞核已经成熟.因此,通过抑制GVBD来阻滞卵母细胞减数分裂进程是促进胞质成熟和核质发育同步化的一条有效途径［21］.腺苷酸环化酶cAMP及其类似物双丁酰基腺苷酸环化酶dbcAMP、磷酸二脂酶的抑制物等,均能抑制GVBD 的发生,dbcAMP在卵母细胞体外成熟研究中常代替cAMP［22］.目前,卵母细胞核成熟的抑制剂主要有异丁基甲基黄嘌呤 （isobutylmethylaxantihine,IBMX）、次黄嘌呤（hypoxanthine,HX）和二丁基环一磷酸腺苷 （dibutryrylcyclic AMP,dbcAMP）.除了直接提高cAMP的浓度外,在培养基中联合添加IBMX或次黄嘌呤间接达到提高cAMP浓度的目的［21］.IBMX是一种磷酸二酯酶抑制剂,它通过减少cAMP的降解提高cAMP浓度,HX则通过防止卵母细胞内cAMP水平降至抑制阈值以下来完成.周红林等［23］用Hx＋dbcAMP或IBMX＋dbcAMP联合抑制,可使60％以上的绵羊卵母细胞抑制在GV期,并在去除抑制剂后卵母细胞恢复减数分裂,加快由GVBD到MⅡ的成熟过程［23］. 磷酸二酯酶3 （phosphodiesterase, PDE3） 特异性抑制剂米力农（milrinone） 能阻止cAMP的降解,用其处理牛、羊、小鼠、短尾猿及人的卵母细胞,结果均导致胞质cAMP的积聚,卵母细胞减数分裂的自发恢复受阻,延迟了卵母细胞的核成熟,从而有利于核质成熟的同步化,其机理可能在于cAMP是细胞周期蛋白激酶p34cdc2激酶的翻译后调控因子,抑制了p34cdc2的磷酸化.当卵母细胞内cAMP水平下降时,cAMP依赖蛋白激酶活性下降,细胞内磷酸化与去磷酸化水平发生相应的改变,激活酪氨酸磷酸酶,催化p34cdc2发生去磷酸化,成为有活性的激酶,进而使多种蛋白质发生磷酸化.这些物质分别在转录和翻译水平上控制减数分裂周期,影响微丝的排列与重组、中间丝的组合、核的重排等,进而使卵母细胞恢复减数分裂［24］.马利兵等［25］在成熟培养液中添加适当剂量的米力农能显著提高体外成熟的山羊卵母细胞的质量及孤雌激活后的卵裂率和囊胚率.Kim等［26］用dbcAMP处理猪未成熟的卵母细胞,经过22h成熟后,成熟率达91．3％,并在IVF后显著减少了多精入卵,囊胚发育率增高.另外,蛋白激酶A能够激活外源性dbcAMP,使大多数卵母细胞处于GV期,促使卵母细胞减数。

什么叫体外受精呀“

体外受精(In Vitro Fertilization)或（external fertilization）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tube animal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。
体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，IVF-ET技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。

一、体外受精技术的发展简史
早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术，但一直没有获得成功。直到1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。 1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。
20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。同时，通过射出精子和附睾精子获能效果的比较研究，人们发现射出精液中含有去能因子，并认识到获能的实质是去除精子表面的去能因子。这些理论和方法上的成就，推动了体外受精技术的发展，试管小鼠(Whit-tingham，1968)、大鼠(Toyoda和Chang，1974)、婴儿(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、绵羊(Hanada，1985)和猪(Chang等，1986)等相继出生。
20世纪80年代中期以后，以牛为代表的家畜IVF技术发展迅速，1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。这对牛IVF的研究和应用具有重要意义，因为这种方法可利用屠宰场废弃的卵巢和冷冻精液进行胚胎体外生产，不仅成本低廉，而且效果稳定。此后，牛的卵母细胞体外成熟和胚胎培养体系逐步趋于成熟，胚胎体外生产效率得到很大提高。目前，采用IVF-ET技术，每对废弃的牛卵巢可获得3头左右的犊牛。为充分利用良种母牛的遗传资源，20世纪80年代后期，牛的活体取卵技术（Ovum pick UP.OPU）发展迅速。活体取卵和IVF-ET结合已成为欧、美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群选择的重要繁殖技术。
牛的体外受精技术不仅应用于畜牧生产，同时，也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段。

二、体外受精技术的基本操作程序
哺乳动物体外受精的基本操作程序，主要环节包括以下几个方面:
(一)卵母细胞的采集和成熟培养
1．卵母细胞的采集：卵母细胞的采集方法通常有三种。
(1)超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。
(2)从活体卵巢中采集卵母细胞 ：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。
在家畜中， 牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直肠把握卵巢，经阴道壁穿刺插入吸卵针，借助B型超声波图像引导，吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目前的技术水平，一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。在家畜中，活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义，在有些国家已用于商业化生产。
(3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30℃~37℃)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期(GV期)，需要在体外培养成熟后才能与精子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。因此卵巢从畜体摘取后须放入含有生理盐水或磷酸缓冲液（PBS）的保温瓶中；吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤；所用溶液都要添加抗生素。
这种方法的最大优点是材料来源丰富，成本低廉，但确定母畜的系谱困难。
2．母细胞的选择：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complesx COC）。无论采用何种方法，采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精实践中，一般只培养A级和B级卵母细胞。
3．卵母细胞的成熟培养：由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时，先将采集的卵母细胞在实体显微镜经过挑选和洗涤后，然后放入成熟培养液中培养。家畜卵母细胞的成熟培养液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培养法，微滴体积为50-200微升，每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移入小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39℃、100%湿度和5%二氧化碳的空气。牛的培养时间为20-24小时，卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后，卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。
(二)体外受精
1．精子的获能处理：哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。
2．受精：即获能精子与成熟卵子的共培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。受精培养时间与获能方法有关。在B2液中一般为6-8小时而用TALP或S.F液作受精液时可培养18~24h。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1~9×10 6/ml，每10微升精液中放人1~2枚卵子，小滴体积一般为50~200微升。
(三)胚胎培养
精子和卵子受精后，受精卵需移入发育培养液中继续培养以检查受精状况和受精卵的发育潜力，质量较好的胚胎可移入受体母畜的生殖道内继续发育成熟或进行冷冻保存。
提高受精卵发育率的关键因素是选择理想的培养体系。在家畜中，胚胎培养液分为复杂的和化学成分明确的培养液两大类。复杂培养液中的成分很多，除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它们培养胚胎时，可以采用体细胞共培养体系，即体细胞与胚胎在微滴中共同培养，利用体细胞生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。
受精卵的培养广泛采用微滴法，胚胎与培养液的比例为一枚胚胎用3~10微升培养液；一般5~10枚胚胎放在一个小滴中培养以利用胚胎在生长过程中分泌的活性因子，相互促进发育。胚胎培养条件与卵母细胞成熟培养条件相同。有的实验室采用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合气体培养，以降低培养液中氧自由基浓度，提高胚胎发育率。胚胎在培养过程中要求每48-72小时更换一次培养液，同时观察胚胎的发育状况。当胚胎发育到一定阶段时可进行胚胎移植或冷冻保存，牛、羊受精卵通常培养到致密桑椹胚或囊胚时进行移植或冷冻保存。
三、家畜体外受精技术的发展现状和存在的问题
(一)发展现状：家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进展，其中牛的IVF水平最高，入孵卵母细胞(即进入成熟培养)的卵裂率为80%~90%，受精后第七天的囊胚发育率为40%~50%，囊胚超低温冷冻后继续发育率为80%，移植后的产犊率为30%~40%.平均每个卵巢可获得A级卵母细胞10个左右，经体外受精可获得3~4个囊胚，移植后产犊1~2头。
(二)存在的问题和发展方向
1．存在的问题
(1)囊胚发育率低，细胞数少。体外受精卵在培养过程中普遍存在发育阻断(developmental
block)，即胚胎发育到一定阶段后停止发育并发生退化的现象。牛胚胎阻断发生在8~16细胞阶段，这就导致体外受精卵的囊胚发育率远低于体内受精。此外，与体内受精囊胚相比，体外受精囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数明显减少。
(2)产犊率低，胎儿初生重高。家畜体外受精胚胎，特别是牛的IVF胚胎移人受体后，产犊率比体内受精低15%~20%，但胎儿初生重比人工授精后代高3~4kg，导致受体母畜难产率高。
2．发展方向
(1)深入研究卵母细胞成熟和胚胎发青的分子机理 体外受精效率低的主要原因是人
们对卵子发生和胚胎发育的分子机理了解不够。大幅度提高IVF效率的前提是探明卵母细胞和早期胚胎发育的分子调控机理，然后以此理论为指导，研究理想的培养体系，促使胚胎基因组得到稳定、有序表达.
(2)加强腔前卵泡培养的研究，利用优良母畜的遗传资源 目前IVF技术利用的卵母细胞不足家畜卵巢上卵母细胞总数的千分之一。为此，一方面提高活体取卵技术，另一方面需研究腔前卵泡和小卵泡的体外成熟技术。为保证卵母细胞的稳定来源及良种母畜或濒危动物的保种，卵泡和卵母细胞的超低温冷冻保存技术的研究也必须加强。
(3)加强体外受精与其他生物技术的结合。体外受精与转基因、克隆、性别控制及胚胎干细胞的培养密不可分。通过体外受精可为外源基因的导人提供充足的胚胎来源；为克隆技术提供成熟卵母细胞和克隆胚胎的培养体系；用分离的X和Y精子与卵子体外受精，可对哺乳动物进行性别控制。同样，胚胎干细胞的分离也需要IVF技术提供胚胎和培养体系。这些生物技术的综合发展将对人类生活产生重大影响.
四、辅助受精技术
辅助受精技术(Techniques f.r assisted fertilizati.n)是IVF的延伸，它是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，克服在某些情况下精子不能穿过透明带和卵黄膜的缺陷。这项技术起源于20世纪60年代，20世纪80年代得到迅速发展，在医学上已成为治疗某些男性不育症的主要措施之一；在基础生物学中，它对研究哺乳动物受精和发育机理有很重要的价值；它还对挽救濒危动物和充分利用优良种公畜等有重要意义。目前哺乳动物的辅助受精技术有透明带修饰和精子注人两种方法。由于两种方法都需要借助显微操作仪来完成，所以又称辅助受精技术为显微授精(microinsemination)。
(一)透明带修饰法：它是运用物理或化学方法对卵母细胞的透明带进行打孔、部分切除或撕开缺口，为精子进入卵黄周隙打开通道，然后把卵子与一定浓度的精子共培养以完成受精过程.这种方法适用于具有一定运动能力，但顶体反应不全，无法穿过透明带的精子。它的优点是对卵子的损伤小，但对于靠透明带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子受精，影响胚胎继续发育。目前这种方法仅在小鼠中取得成功。
(二)精子注入法：它是利用显微操作仪直接把精子注入卵黄周隙或卵母细胞的胞质中，前者称透明带下授精(subzonal inseminatiom SUZI)，后者称胞质内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)。透明带下授精对注入的精子数有严格要求：具有活力且已发生顶体反应的精子要单个注入；没有发生顶体反应的精子，注入的数目可加大。SUZI的优点是对卵母细胞的损伤小，已在临床医学上得到运用，但多精入卵是制约这一技术发展的主要原因。胞质内精子注射对精子活力、形态和顶体反应没有特殊要求，只需注入单个精子即可，为提高受精率，注射后卵子需要人为激活。胞质内注射精子作为治疗男性受精障碍症的方法已在许多国家得以应用，由此获得的试管婴儿数已超过3000例。

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