Cell,Metab：在体内仅需阻断两个基因就可高效地将α细胞转化为β细胞

Cell,Metab：在体内仅需阻断两个基因就可高效地将α细胞转化为β细胞

2017年2月19日/生物谷BIOON/---在一项新的研究中，来自来自美国、加拿大、瑞士和挪威的研究人员发现在活的小鼠体内，仅需阻断两个基因的表达就能够诱导胰腺中的α细胞快速地和高效地变成产生胰岛素的β细胞。他们对来自糖尿病供者死后的胰腺的研究还提示着α细胞的“职业改变”也在糖尿病患者体内自然地发生，但是仅是少量地和更慢地发生。这项新的研究提示着科学家们可能有朝一日能够利用这种细胞命运的天然灵活性在人体内诱导α细胞转化为β细胞，从而缓解糖尿病症状。相关研究结果于2017年2月16日在线发表在Cell Metabolism期刊上，论文标题为“Converting Adult Pancreatic Islet α Cells into β Cells by Targeting Both Dnmt1 and Arx”。论文通信作者为美国斯坦福大学医学院发育生物学教授、医学教授Seung Kim。论文第一作者是斯坦福大学医学院博士后研究员Harini Chakravarthy博士。

Kim说，“为糖尿病患者仔细地评估所有潜在的新的β细胞来源是比较重要的。如今，我们发现是什么让α细胞保持α细胞的身份，并且发现一种方法在活的动物体内将它们高效地转化为与胰腺中的β细胞几乎无法区分开的细胞。这是非常激动人心的。”

作为资助1型糖尿病研究的JDRF机构的创新研究主任，Andrew Rakeman博士（未参与这项研究）说，“将α细胞转分化为产生胰岛素的β细胞是一种非常有吸引力的恢复1型糖尿病中的β细胞功能的疗法。通过鉴定调节α细胞-β细胞转化的通路和证实这些通路在来自1型糖尿病患者的胰岛中也是有活性的，Chakravarthy博士和她的同事们在实现α细胞转分化的治疗潜力的目标上迈出了重要的一步。”

食物对葡萄糖水平的影响

胰腺中的β细胞和α细胞负责调节人体对就餐后血液葡萄糖水平的上升和下降作出的反应。当葡萄糖水平上升时，β细胞释放胰岛素，指示整个人体中的细胞储存这种糖分子，供以后使用。当葡萄糖水平下降时，α细胞释放胰高血糖素，从而促进储存的葡萄糖释放。

尽管1型和2型糖尿病主要与β细胞的数量下降相关联，但是有迹象表明α细胞也在这两种疾病中存在功能障碍。

Kim说，“在一些情形下，α细胞可能实际上分泌出太多的胰高血糖素。当不存在足够的胰岛素时，过量的胰高血糖素就好比是火上浇油。”

这些研究人员认为人体具有大的α细胞库，而且这些α细胞有时分泌太多的胰高血糖素，因此，将一些α细胞转化为β细胞应当是耐受良好的。

这项新的研究是建立在一家瑞士实验室几年前在小鼠体内开展的一项研究之上。那项研究已证实当β细胞受到破坏时，胰腺中大约1%的α细胞开始看起来和表现得像β细胞。但是这发生得非常缓慢。

Kim说，“那项指标研究所缺乏的是对这种转化机制的理解。但是针对主调控因子可能是什么，我们基于我们自己的研究，提出一些看法。”

Chakravarthy和她的同事们靶向两种主要的候选物：蛋白Arx，已知它在α细胞产生期间发挥着重要作用；蛋白DNMT1，它可能通过维持它的DNA上的化学标记，有助α细胞“记住”如何保持α细胞的身份。他们千辛万苦地培育一种实验室小鼠品种：当通过饮用水让它们服用一种化合物时，它们的胰腺α细胞不能够产生Arx和DNMT1。他们观察到在这些小鼠体内阻断这两种蛋白产生7周内，α细胞快速地转化为看起来像是β细胞的细胞。

为了证实这种转化，通过与斯坦福大学医学院生物工程教授、应用物理学教授Stephen Quake实验室合作，这些研究人员研究了所产生的这些细胞的基因表达模式。他们也将这些细胞运送到来自加拿大阿尔伯塔大学和美国伊利诺伊大学的合作者们那里，以便测试它们的电生理学特征，以及它们是否和如何对葡萄糖作出反应。

Kim说，“通过我们的同事们和合作者们开展的这些大量的研究，我们发现这些细胞在每个方面显著地类似于天然的β细胞。”

在人细胞中测试这一理论

这些研究人员随后将他们的注意力转移到来自糖尿病供者和非糖尿病供者死后的人胰腺组织。他们发现来自死后一到两年内经诊断患上1型糖尿病的儿童的胰腺组织样品包括一部分产生两种激素的细胞，它们产生胰高血糖素和胰岛素。Kim和他的同事们认为他们可能捕捉到正在转化为β细胞的α细胞，作为对糖尿病产生作出的反应。他们也观察到来自糖尿病供者的人α细胞样品不表达基因ARX和DNMT1，而在小鼠体内，这两个基因的表达会阻断α细胞转化为β细胞。

Kim说，“因此，相同的基本变化可能也在1型糖尿病患者体内发生。这表明利用靶向方法阻断糖尿病患者胰岛中的这两个基因的表达或者控制它们的信号来提高α细胞转化为β细胞的比例可能是可行的。”

什么是细胞分化？是怎么分化的？

细胞分化 定义：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。
细胞在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程称为细胞分化（cellular differentiation）。细胞分化是一种持久性的变化，细胞分化不仅发生在胚胎发育中，而是在一生都进行着，以补充衰老和死亡的细胞．如：多能造血干细胞分化为不同血细胞的细胞分化过程。一般来说，分化了的细胞将一直保持分化后的状态，直到死亡。
导言

　　细胞分化就是由一种相同的细胞类型经过细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程。　也可以说，细胞分化是同一来源的细胞逐渐发生各自特有的形态结构、生理功能和生化特征的过程。其结果是在空间上细胞之间出现差异，在时间上同一细胞和它以前的状态有所不同。细胞分化是从化学分化到形态、功能分化的过程。分裂不等于分化。
　　从分子水平看，细胞分化意味着各种细胞内合成了不同的专一蛋白质（如水晶体细胞合成晶体蛋白，红细胞合成血红蛋白，肌细胞合成肌动蛋白和肌球蛋白等），而专一蛋白质的合成是通过细胞内一定基因在一定的时期的选择性表达实现的。因此，基因调控是细胞分化的核心问题。
ХⅪ特点
　　gvbvvr　主要可以概括成三点：
　　①持久性:细胞分化贯穿于生物体整个生命进程中,在胚胎期达到最大程度
　　②稳定性和不可逆性:一般来说,分化了的细胞将一直保持分化后的状态,直到死亡
　　③普遍性:生物界普遍存在,是生物个体发育的基础
　　正常情况下，细胞分化是稳定、不可逆的。一旦细胞受到某种刺激发生变化，开始向某一方向分化后，即使v引起变化的刺激不再存在，分化仍能进行，并可通过细胞分裂不断继续下去。
　　但大量科学实验证明，在植物细胞中高度分化的植物细胞仍具有发育成完整植株的翻hchahag的大的啊cdedddqxsedc饿gvr能力，即植物细胞的全能性。在动物细胞中，部分细胞（有细胞核）也有此能力。
　　胚胎细胞在显示特有的形态结构、生理功能和生化特征之前，需要经历一个称作决定的阶段。在这一阶段，细胞虽然还没有显示出特定的形态特征，但是内部已经发生了向这一方向分化的特定变化。细胞在整个生命进程中,在胚胎期分化达到最大限度.
　　细胞决定的早晚，因动物及组织的不同而有差异，但一般情况下都是渐进的过程。例如，在两栖类，把神经胚早期的体节从正常部位移植到同一胚胎的腹部还可改变分化的方向，不形成肌肉而形成肾管及红细胞等。但是到神经胚晚期移植体节，就不能改变体节分化的方向。可见，这时期体节的分化已稳定地决定了。
细胞分裂、生长、分化和癌变的关系
　　Ⅰ细胞分裂：是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础.
　　①使单细胞生物产生新的个体.
　　②使多细胞生物产生新细胞,使生物幼体由小长大.
　　③通过分裂将复制的遗传物质平均分配到两个子细胞中.
　　Ⅱ细胞生长：生物体的生长包括细胞数目的增加和细胞体积的增大两个方面.细胞分裂和细胞生长都是生物体生长的细胞学基础.
　　Ⅲ细胞分化：是生物界普遍存在的生命现象,是生物个体发育的基础,经细胞分化,多细胞生物形成不同的细胞和组织.
　　Ⅳ细胞癌变：是受致癌因子的作用,细胞连续进行分裂从而超过最高分裂次数无限增殖的现象.
　　四者的联系
　　⑴细胞分裂是细胞分化的基础
　　⑵仅有细胞分裂，生物体不能进行正常的生长发育
　　⑶细胞的正常分化能抑制细胞癌变，细胞癌变是细胞的畸形分化，癌变后会导致该细胞无限制地分裂下去，从而形成肿瘤而危害人体健康，而癌细胞因为糖被的变化，而有易转移的特点，难以根治，一直都是危害人类健康的难治之症之一。rty
　　特别提醒：①细胞分裂并不意味着生物体一定由小长大.因为受精卵开始进行细胞分裂时,细胞数目虽然增多,但由于受卵膜的限制,胚胎体积并未增大.②分化必须建立在分裂的基础上,即分化必然伴随着分裂,但分裂的细胞不一定就分化.分化程度越高,分裂能力也就越差.

分化与细胞核

　　在细胞分化中，细胞核起决定作用。一般认为细胞核内含有该种生物的全套遗传信息。在条件具备时，它可使所在细胞发育分化为由各种类型细胞所组成的完整个体。从培养的烟草，髓部小块形成的组织团块上取脱落的细胞，单个分离培养能得到有根和叶的幼芽，再移植到土壤中，会长出开花的植物。在两栖类，把囊胚期和早期原肠胚的细胞核移植到事先已经去掉细胞核的卵内能使卵正常发育，说明动植物体细胞的核是全能的。

分化与细胞质

　　分化与细胞质之间的关系可以从卵质谈起。如马副蛔虫受精后，所有经过染色体消减的细胞都发育为体细胞（见生殖质）。
　　许多动物卵子细胞质的分布有明显的区域性。这种区域性虽然不影响染色体的行为，但对于以后胚胎器官发育却有决定性作用。
　　中国胚胎学家童第周等利用核移植的技术，也证实了卵质在性状发生中的作用。他们把金鱼囊胚期细胞核移到去核的鳑鲏鱼卵子中；虽然发育到幼鱼的例子极少，但是发育的过程都比较正常，一些基本的发育的特点，如胚胎的背腹性，对称性以及早期的卵裂进程等都和鳑鲏鱼一样，幼鱼的体形也和鳑鲏鱼的幼鱼没有区别。这些性状的出现似乎完全根据细胞质。
　　细胞质对细胞核的作用，还表现在对核功能活动的影响。如培养的人宫颈上皮癌细胞——HeLa细胞——的DNA和RNA合成都很活跃；鸡的红细胞虽然有核，但是处于不活跃状态，不进行DNA合成，RNA合成也很微弱。用细胞融合的方法，使去掉细胞核的HeLa细胞的细胞质和鸡的红细胞融合，便可使后者的细胞核体积增大，浓缩的染色质变得松散，原来已经失去的合成RNA和DNA的功能在寄主HeLa细胞质的影响下，重新恢复了。

分化与细胞间的相互作用

　　细胞间的相互作用是各式各样的，可以是诱导作用，也可以是抑制作用。就作用方式来说，有的作用需要细胞的直接接触，另一些所需要的可能是间隔一定距离的化学物质的扩散。
　　①诱导作用。两栖类胚胎背部的外胚层细胞，在脊索中胚层的作用下，分化为神经细胞，以后发育为神经系统。这种中轴器官的诱导作用在脊椎动物具有普遍性，一般认为，脊索中胚层细胞释放某种物质，诱导外胚层细胞分化为神经组织。
　　诱导不但在中轴器官的形成中起作用，也在以后器官的发生中起作用。例如间质细胞的存在对体内腺体上皮的形成和分化是必不可少的。这些腺体包括甲状腺、胸腺、唾腺和胰腺，它们对间质细胞的依赖程度有很大差异。在离体条件下，胰腺原基只要有间质细胞存在就可以继续发育。
　　②抑制作用。如在蝾螈幼虫或成体摘除水晶体后，可以从背部的虹彩再生出一个新的。进一步的分析指出，再生水晶体的能力局限在虹彩背部的边缘层。如把这部分组织移到另一个摘除水晶体的眼睛，不是位于背部，而是使它位于腹部，仍旧可以由它再生出水晶体。
　　既然这部分细胞有生长水晶体的能力，为什么在正常的眼睛里不表现？如把虹彩的背部移到另一只未摘除水晶体的眼睛里，不管使它位于那一部位，都长不出水晶体。如在摘除水晶体的眼睛里，经常注射完整的（带有水晶体的）眼腔液体，在注射期间，虹彩背部的细胞也长不出水晶体。由此可见，虹彩背部的细胞本来具有产生水晶体的能力，正常水晶体会产生一种物质，对此起抑制作用。
　　细胞分化中基因表达的调节控制是一个十分复杂的过程，在蛋白质合成的各个水平，从mRNA的转录、加工到翻译，都会有调控的机制。在DNA水平也存在调控机制（如基因的丢失、放大、移位重组、修筛以及染色质结构的变化等）。不同的细胞在其发育中的基因表达的调节控制不同；相同的细胞在其发育的各阶段中，调节控制的机制不同。
细胞的分化潜能

　　一、全能性、多能性和单能性
　　受精卵能够分化出各种细胞、组织，形成一个完整的个体，所以把受精卵的分化潜能称为全能性。随着分化发育的进程，细胞逐渐丧失其分化潜能。从全能性到多能性，再到单能性，最后失去分化潜能成为成熟定型的细胞。
　　植物的枝、叶、根都有可能长成一株完整的植株，细胞培养的结果也证明即使高度分化的植物细胞也可以培养成一个完整的植株，因此可以说绝多数植物细胞具有全能性。
　　成熟动物细胞显然不具备全能性。其原因并非在细胞核而在细胞质，如大量的核移殖实验证实，分化细胞的核仍保留完整的基因组DNA。我国发育生物学家童第周1978年成功地将黑斑蛙成熟的细胞核移入去核的受精卵细胞内，培育出了蝌蚪。60年代的爪蟾和80年代小鼠的核移殖，90年代末多利羊的诞生都证明了分化细胞具有完整的基因组DNA。
　　在人的一生中，皮肤、小肠和血液等组织需要不断地更新，这个任务是由干细胞完成的。干细胞是一类具有分裂和分化能力的细胞，多能干细胞可以分化出多种类型的细胞，但它不可能分化出足以构成完整个体的所有细胞，所以多能干细胞的分化潜能称为多能性（pluripotent）。单能干细胞来源于多能干细胞，具有向特定细胞系分化的能力，也称为祖细胞（progenitor）。
　　二、干细胞的特点
　　干细胞具有以下生物学特点：①终生保持未分化或低分化特征；②在机体的中的数目、位置相对恒定；③具有自我更新能力；④能无限制的分裂增殖；⑤具有多向分化潜能，能分化成不同类型的组织细胞，造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等成体干细胞具有一定的跨系、甚至跨胚层分化的潜能；⑥分裂的慢周期性，绝大多数干细胞处于G0期；⑦通过两种方式分裂，对成分裂和不对称分裂前者形成两个相同的干细胞，后者形成一个干细胞和一个祖细胞。
　　根据干细胞的分化能力，可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。全能干细胞可以分化为机体内的任何一种细胞，直至形成一个复杂的有机体。多能干细胞可以分化为多种类型的细胞，如造血干细胞可以分化为12种血细胞。
　　有些文献中将分化潜能更广的细胞叫做多潜能干细胞（pluripotent stem cell），如骨髓间充质干细胞，而把向某一组织类型细胞分化的干细胞叫做多能干细胞（multipotent stem cell），如前面提到的造血干细胞。单能干细胞只能分化为一种类型的细胞，而且自我更新能力有限。
　　三、胚胎干细胞
　　根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞又可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）是指从胚胎内细胞团或原始生殖细胞筛选分离出的具有多能性或全能性的细胞，此外也可以通过体细胞核移植技术获得。ESC能表达POU家族的转录因子Oct-3/4；在移植后能形成的畸胎瘤，在体外适当条件下能分化为代表三胚层结构的体细胞。
　　ESC的用途主要有：①克隆动物，由体细胞作为核供体进行克隆动物生产，虽然易于取材，但克隆动物个体中表现出严重的生理或免疫缺陷，而且多为致命性的；②转基因动物，以ESC细胞作为载体，可大大加快转基因动物生产的速度，提高成功率；③组织工程，人工诱导ESC定向分化，培育出特定的组织和器官，用于医学治疗的目的。
　　四、再生
　　狭义地讲再生指生物的器官损伤后，剩余的部分长出与原来形态功能相同的结构的现象称为再生，如壁虎的尾、蝾螈的肢、螃蟹的足，在失去后又可重新形成，海参可以形成全部内脏，水螅、蚯蚓、蜗虫等低等动物的每一段都可以形成一个完整的个体等等。但是从广义的角度来看再生是生命的普遍现象，从分子、细胞到组织器官都具有再生现象。
　　再生的形式：
　　生理性再生：即细胞更新，如人体内每秒中约有600万个新生的红细胞替代相同数量死亡的红细胞。
　　修复性再生：许多无脊椎动物用这种方式来形成失去的器官，如上述提到的壁虎的尾和螃蟹的肢。
　　重建：是人工实验条件下的特殊现象。如人为将水螅的一片组织分散成单个细胞。在悬液中，这些细胞重新聚集，在几天至几周以后，形成一条新的水螅。
　　无性繁殖：
　　关于再生存在着许多引人入胜的问题：
　　1．机体如何意识到失去的部分，又是如何知道丢失的部位及丢失的多少？即再生如何起始，如何控制？
　　2．替代物来此何处？是剩余的原胚细胞、干细胞还是已分化的细胞又去分化的结果？
　　3．原结构的重建是补充的新组织，还是由伤口处一些细胞增殖代替了缺失的结构。
　　现在普遍认为再生是细胞去分化，细胞迁移和细胞增殖的组合，而不是单纯的补充或增殖。如蝾螈的前肢被切除后，再生包括以下的过程：①伤口处细胞的粘着性减弱，通过变形运动移向伤口。形成单层细胞封闭伤口。这层细胞称为顶帽（apical cap）或顶外胚层帽（apical ectodermal cap）。②顶帽下方的细胞，如骨细胞，软骨细胞，成纤维细胞，肌细胞，神经胶质细胞迅速去分化。形成胚芽。③胚芽内部缺氧，PH下降，提高了溶酶体的活性，促进受伤组织的清除。④胚芽细胞加快分裂和生长，最后细胞又开始分化构成一个新的肢体。
　　从蝾螈断肢再生的实验发现，①当臂神经被完全切除时不再发生断肢再生。这是因为神经能产生再生促进因子，其中有一种被鉴定为神经胶质生长因子（glial growth factor，GGF）。②利用视黄酸处理前臂断肢芽基，肢干将忽略已存在的肱骨、桡骨、尺骨，而形成一只从肱骨到指骨的完整手臂。说明视黄酸能干扰正常的位置信息，现在认为位置信息与同源异形基因的表达有关。

肿瘤的细胞分化

　　肿瘤患者经常会听到类似"高分化鳞癌" ，"低分化腺癌" 等专业术语。大多病人在患病之初往往不了解这些术语的意义。现在我们就来介绍一个关于癌细胞非常关键的一个术语--肿瘤细胞分化程度(Differentiation)。
　　所谓分化程度就是指肿瘤细胞接近于正常细胞的程度。分化得越好(称为"高分化")就意味着肿瘤细胞越接近相应的正常发源组织；而分化较低的细胞(称为"低分化" 或"未分化")和相应的正常发源组织区别就越大，肿瘤的恶性程度也相对较大。
　　按照肿瘤分化的程度，病理专家通常将其分为三个病理等级，并用英文字母G(代表Grade, 即分化) 来表示。级别越高表示细胞分化程度越差。
　　G1，即高分化，细胞分化程度较好。一般来说，G1的肿瘤细胞分裂速度较慢。
　　G2，即中分化，细胞分化程度居中。
　　G3，即低分化，细胞分化程度较差。肿瘤细胞分裂速度较快。
　　可以说肿瘤细胞的分化程度越差，它的恶性程度就越高，肿瘤体生长较迅速，而且容易发生转移。分化好的肿瘤一般生长较慢，而且在治疗后不易复发。但是，对不同肿瘤来说，肿瘤细胞的分化程度和病人的预后并不一定都有直接关系。 从治疗的角度上来说，某些分化程度低的细胞对于化疗和放疗更敏感，换言之，这些分化程度越低的肿瘤越容易通过化放疗来治疗。因此，并非高分化肿瘤的预后都好于低分化肿瘤。比如常见的血液恶疾淋巴癌，某些中高分化的淋巴癌通过化疗和放疗的联合治疗方法，治愈率可达40%左右。而大多的慢性淋巴癌(属低分化) ，病情的发展往往非常缓慢，可持续几年甚至十几年，但药物治疗对慢性淋巴癌却几乎没有治愈的效果。鼻咽癌的诊治中也有类似的情况。又如口腔或咽喉部鳞癌，肿瘤细胞的分化程度和病人的预后则没有直接关联。
　　总之，对于不同的肿瘤来说，细胞的分化程度有着不同的意义。肿瘤细胞的分化程度是癌症诊断和治疗中一个重要的参考的数据，但治疗的效果，还是需要结合癌症的种类，分期，治疗方法来综合判断。

TCR基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞构建

细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是机体抗肿瘤和抗病毒感染的关键效应细胞，CTL通过T细胞受体（TCR）特异识别靶细胞表面MHC-I 与抗原多肽形成的复合物，进而释放穿孔素、颗粒酶等生物活性物质对靶细胞进行溶解。鉴于CTL在治疗肿瘤和病毒性疾病中的潜在作用，对CTL的基础与应用研究备受关注，大多研究集中于对TCR基因的改造。随着分子生物学的发展，TCR基因克隆、转导技术已较成熟，研究方向主要是如何保证TCR基因高效、正确表达组装成为具生物活性的分子。

机体免疫防御主要由体液免疫与细胞免疫两大系统构成，其中以CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤过程中发挥重要作用。CD8+T从静息性T细胞活化为具有特异杀瘤作用的细胞毒性T淋巴 细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)经过如下3个关键步骤：第一步是抗原加工与提呈，主要由专职抗原提呈细胞树突状细胞（dendritic cell, DC)负责; 第二步是识别与活化，CD8+ T细胞通过其表达的T细胞受体(T cell receptot, TCR)特异识别DC提呈的MHC-Ⅰ-多肽复合物，接受T细胞活化的第一信号，DC表面丰富的免疫共刺激分子给予T细胞活化的第二信号;第三步是识别与杀伤，活化的CTL通过TCR特异识别瘤细胞表面MHC-1-多肽复合物，释放穿孔素和颗粒酶等生物活性物质溶解瘤细胞，或通过Fas-FasL途径诱导瘤细胞凋亡。CTL的TCR对肿瘤抗原的识别是发挥其效应的基础，抗原识别的特异性取决于TCR结构的多肽性。越来越多的研究小组利用现代分子生物学技术克隆能识别特定抗原表位的TCR基因，构建TCR基因病毒载体再转染外周CD8+ T细胞，将之修饰成为能识别特定靶抗原的CTL。体外大规模扩增经TCR基因修饰的CTL，将为肿瘤及传染性疾病提供新型、特异的治疗手段。

TCR是T细胞表面能够特异性识别抗原表位和介导免疫应答的分子，TCR的多态链依编码基因不同命名为α、β、γ、δ链，分别形成αβTCR和γδTCR。 人外周血中约95%为γδTCR，约5%为αβTCR。

TCR分子是由两条糖基肽链通过二硫键组成的异二聚体。所有α、β、γ、δTCR肽链均可分为胞外、 跨膜(TM)和胞质(Cy)3部分。胞外部分又分为可变区（V）、高变区（D）、结合区（J）和恒定区（C）。α链 由V、J、C基因编码，β链由V、D、J、C基因编码。两链不同区域等位基因的重排决定了TCR的多态性，赋予了T细胞识别不同抗原的巨大潜力。TCRα和β肽链可变区存在4个氨基酸高变区（hypervariable region, HVR），亦称互补决定区（complementarity determining region, CDR），其中CDR1、CDR2，CDR3又称为超变区，是抗原特异性结合部位。TCR多态性主要由CDR3决定。

克隆TCR基因的关键是分离到具有高亲和力的识别抗原肽的T细胞克隆。已经有多个课题组利用不同技术从不同来源获得CTL克隆。Morgan等从黑色素瘤患者的肿瘤浸润性淋巴细胞中分离出能识 别MART-1抗原表位的T细胞克隆。Zhang等从慢性丙型肝炎患者外周血中分离得到HCV特异性的CTL克隆。Morgan等运用HLA-A2限制性多肽体外致敏预先免疫该多肽患者的外周血淋巴细胞 （peripheral blood lymphocyte, PBL），然后用有限稀释法获得CTL克隆。Varela-Rohena等运用噬菌体展示技术分离抗原特异性TCR。利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、反转录PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）技术克隆上述TCRα、β链全长基因。利用基因扫描技术对TCR CDR3区域进行分析，了解其可能存在的亚家族。 Meyerhuber等运用此方法从HER2(369-377)特异性CTL中成功克隆了TCR基因。

目前在TCR基因转染过程中报道较多的是运用逆转录病毒载体。逆转录病毒载体有多方面优势，感染细胞范围广，不仅适用于单层培养的细胞，而且适用于悬浮培养的淋巴细胞;机体对载体产生的免疫反 应较低，在宿主内可以稳定遗传;往往以低拷贝整合，避免了基因重排;经特殊构建的反转录病毒载体是缺陷型的，比较安全;选择不同的外壳蛋白进行包装，可赋予病毒特定的宿主选择性，从而达到靶向导入的目的。

Morgan等从黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中获得能识别 MART-1抗原表位的CTL克隆，从中克隆到TCR基因，利用逆转录病毒载体将该基因转导入至人外周血 T淋巴细胞，经体外扩增后治疗17例Ⅳ期黑色素瘤患者，15例患者在治疗2个月后循环T细胞数量至少增加了10％，2例患者病情得到控制，在18个月内未复发。Parkhurst等将癌胚抗原（carcino-embry-onic antigen, CEA）特异性TCR构建入逆转录病毒载体转导人外周血淋巴细胞，在TCRα链CDR3区域引入单核苷酸突变，增强了TCR的亲和性。临床试验对3例转移性结直肠癌患者进行治疗，结果所有病例血清CAE水平均有所下降（74％~99％）。

目前较常用的逆转录病毒载体为Moloney小鼠白血病病毒改构的各类逆转录病毒载体，理论上它能转染几乎100％的靶细胞，但实际的转染效率远低于此。近年来人们通过各种改良方法不断提高逆转录 病毒载体转染效率。Yang等运用高速离心法浓缩病毒，4℃，6000rpm，过夜，可使病毒滴度提高50~100倍，进而提高转染效率。研究人员利用逆转录病毒载体将TCRαβ基因转导人初始T细胞,发现在相同的病毒滴度下，以骨髓瘤病毒（myeloproliferative sarcoma virus,MPSV）或鼠干细胞病毒（murine stem cell virus, MSCV）为基础载体比以小鼠白血病病毒（murine leukaemia virus, MLV）为基础的载体有高转染效率和高TCR表达。

改良的逆转录病毒载体已被多个研究组用于不同肿瘤相关抗原特异性TCR基因转移中。但逆转录病毒只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段长度不超过8000bp，病毒滴度低，有的反转录病毒可能具有激活癌基因的危险。

慢病毒载体其优点在于可有效转染分裂和未分裂细胞;能稳定整合到靶细胞的基因组中;可转移约 8000~10000bp基因片段;能持久稳定表达外源基因，不易导致基因沉默;没有整合位点偏好性。

Yang等将识别MART-1和gp100的TCR基因重组入VSV-G假型第3代慢病毒载体，转染外周T细胞，转染细胞出现了特异性抗瘤活性，包括释放γ干扰素和溶解瘤细胞。2010年该课题组运用CD3抗体和PBL饲养细胞预刺激T细胞，明显提高T细 胞转染效率，12 d内CD8+ T细胞数量扩增达600倍，且具有特异性杀伤活性和记忆性。Stauss等对比逆转录病毒载体与慢病毒载体转移WT-1特异性TCR研究表明，慢病毒载体相对比较安全，可获得较高转染效率。Canderan等设计了杂合非小细胞肺癌特异性TCR，该TCR是由人TCRV区和鼠TCRC区嵌合而成，后将该TCR构建入慢病毒载体转导T 细胞前体，产生特异性CD4＋ CD8＋可稳定表达杂合TCR，T细胞体外增殖良好，并可特异性识别非小细胞肺癌。虽然慢病毒载体有较多优势，但存在有毒力恢复、垂直感染等潜在的安全隐患，仍需要临床更多的深入研究。

将外源基因直接用理化方法转导入靶细胞。常用的转导方法有电穿孔技术、磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法等，其对外源基因片段大小无要求，安全性很高，但转染效率很低。

TCR基因转染的载体主要还是病毒载体，但研究人员一直都在尝试寻找更理想载体系统。值得一 提的是，“睡美人”（sleeping beauty, SB）转座子系统已被应用于TCR基因转移过程中，Peng等报道， 该方法TCR转导效率可与病毒载体相媲美，但该系统缺陷在于存在整合位点偏好性，这将是其应用于临床前亟待解决的问题。

研究人员将TCRα和β两条链分别构建入两个独立病毒载体中，因为编码CR单链基因的小病毒载体容易包装，可获得较高的病毒滴度。但为了得到功能性的TCR，含有α和β两条链的两个病毒颗粒必 须同时转染同一个T细胞。这种双感染容易增加插入突变的风险，此外，引入TCR单链易形成内源与外源TCR链的杂合体。Dossett等用不同的启动子来调控TCR两条链的表达，其中TCRα链受控于一 个长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）元件，该元件也驱动报告基因neo的表达，TCRβ链的表达由杂合HTLV-I/SV40启动子SRα来驱动。该方法易受启动子的干扰，导致TCR表达下调。Wang等将HC/2G-1 TCR两条链由一个内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）原件连接，在一般启动子启动下作为一个单一转录盒来表达。IRES原件可以保证TCR两条链同时表达，但IRES5′端基因通常较3′端基因表达量高，会导致突变的发生。 Chinnasamy等将TCR基因两条链通过一个源自 微小RNA病毒的肽原件2A（2A peptide, p2A）来进行连接。这种连接方式可以产生一条单一的编码TCRα和β链的mRNA。翻译时，核糖体可跳过2A肽序列，从而产生两条单独的肽链：TCRα-2A融合蛋白和甘氨酸TCRβ，这种连接方式可以等量表达TCRα和β链，此外肽序列要比IRES原件短，构建的病毒载体较小，容易包装，可获得较高病毒滴度。

TCR组装和表达是一个复杂的过程，在细胞表面进行表达之前，TCRα链和β链首先形成异源二聚体，然后与CD3复合物在内质网结合，最终TCR CD3复合物由内质网释放后转移至细胞膜，在这个过程中会有诸多因素影响TCR的表达效率。

密码子优化是指用人类基因组中常见的同义密码子置换非常见密码子。已有证据表明，密码子优化的TCR基因在转导T细胞中表达水平比野生型TCR基因有所提高，从而增强其体内功能。但是，密码子优化可能产生免疫源性TCR，此过程也可能会伴随多肽序列的改变产生另一种开放读码框，有一定风险。

TCR基因转移载体构建时最好使用单病毒载体，可以同时编码TCRα链和β链，这样可以防止插入突变和转导T细胞仅表达引入的1条链，可以减少引入链与相应内源性TCR链误配的风险。如果存在TCR其中1条链供应不足的情况，会削弱TCR异源二聚体的聚合细胞表面表达。近年来，研究人员运用IRES序列或者P2A，连接TCRα链和β链构建载体，很大程度上克服了载体配置造成的两条链表达不均衡的问题。

有效的细胞表面TCR表达需要稳定的TCR CD3复合体构建。没有CD3的情况下，TCR不能聚合而被降解。因此向T细胞内引入外源性TCR时，CD3分子的存在是主要限速步骤。竞争可降低引入性TCR细胞表面表达。 引入性TCR的表达水平通常比内源性TCR低，内源性TCR可以削弱转导T细胞对低浓度TCR识别抗原的反应活性，这一结果验证了引进TCR与内源性TCR竞争有限的CD3分子。 Sachiko等通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的表达使内源性TCR沉默以提高外源性TCR基因的表达和活性。最近研究表明，带有编码TCR α和β链基因载体与另一个编码CD3γ、δ、ε、ζ基因的载体进行双重转导CD8+T细胞，可以提高CD8+T细胞活性。

有研究表明单独α或β链转导T淋巴细胞可导致外源性TCR链和内源性TCR链混合二聚体的形成。外源性TCRα或β链与内源性TCRα或β链的误配导致目标TCR自身配对减少，从而影响TCR的亲和性。此外，误配二聚体的形成可能会导致自身免疫反应等安全问题。Thomas等将TCR恒定区鼠源化，或进行半胱氨酸修饰产生分子间二硫键，发现均可提高外源性TCRα和β链的正确配对。 Voss等在TCRα和β链恒定区插入一对相互作用氨基酸，改变TCR恒定区二级结构（从“knob-into-hole”构象变为“hole-into-knob”）来提高两条链的正确配对。

尽管目前TCR基因修饰CTL的基础与临床研究均取得较好进展，但仍存在一些问题，如功能性TCR的正确表达、TCR表达效率、TCR基因修饰CTL的亲和力与体内有效性和存活时间、临床安全性等均需要深入研究。

细胞癌变的原因是原癌基因和抑癌基因都突变吗?还是其中一个一个突变就行?如果两个都不突变，但是细胞中

在个体发育过程中，大多数细胞能够正常完成细胞分化。但是，有的细胞由于受到致癌因子的作用，不能正常完成细胞分化，因而变成了不受机体控制的、连续进行分裂的恶性增殖细胞，这种细胞就是癌细胞。细胞的畸形分化，与癌细胞的产生有直接关系。
细胞的癌变：接触致癌因子使正常细胞转变为癌细胞。

癌变特征
与正常细胞相比，癌变后的细胞有些独具的特征 [1] ：
1、癌细胞的形态结构发生了变化
例如，培养中的正常成纤维细胞呈扁平梭状每当这种细胞癌变以后，就变成了球形。
2、能够无限增殖。
在人的一生中，体细胞能够分裂50~60次，而癌细胞却不受限制，可以长期增殖下去。
3、癌细胞的表面也发生了变化。
由于细胞膜上的糖蛋白等物质减少，使得细胞彼此之间的黏着性减小，因而容易移动，转移至其他组织或器官中分裂、生长，这就是医学上所说的癌细胞转移（浸润性 扩散性）。癌细胞转移是患者死亡的重要原因。为防止正常细胞的癌变，应尽量避免接触各种致癌物质，还要保持健康的心态，注意增强体质，养成良好的生活习惯。
原癌基因突变引起。两个概念：1.原癌基因 它存在于一切正常细胞中，是具有引起细胞癌变潜能的基因。 　2.抑癌基因 其又称肿瘤抑制基因，是细胞中的一类正常的“管家”基因。 可见，当原癌基因突变为癌基因，细胞发生转化就会引起细胞癌变。而抑癌基因并不作用于细胞的增值和转化，是为了保证细胞正常代谢。

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