Nature：重磅！在清除错误折叠的蛋白中，线粒体也能够降解

Nature：重磅！在清除错误折叠的蛋白中，线粒体也能够降解

在一项新的研究中，来自美国约翰霍普金斯大学的研究人员以酵母和人细胞作为研究对象，发现细胞清除蛋白团块的一种意料之外的途径。在分子水平上，清除这些蛋白团块有时相当于将太多的或错误的垃圾扔进垃圾桶。他们说，他们的发现可能有助揭示在帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病的进展中是什么发生差错。

细胞中遭受损伤的或者错误折叠的蛋白往往形成团块或聚集物。多亏一种被称作蛋白酶体的酶复合物，这些蛋白团块被认为在细胞质或细胞核中很快地溶解。这些蛋白团块被认为也能够在一种具有消化能力的被称作溶酶体的细胞器中很快地溶解。

但是利用酵母开展的实验中，这些研究人员意外地发现很多蛋白团块在被称作线粒体的细胞能量工厂中发生降解。他们也发现太多的错误折叠的蛋白能够阻塞和破坏这个至关重要的结构。这些发现可能有助解释蛋白团块和线粒体功能障碍为何是神经退行性疾病的两个典型特征。相关研究结果于2017年3月1日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Cytosolic proteostasis through importing of misfolded proteins into mitochondria”。

论文通信作者、约翰霍普金斯大学医学院细胞生物学、生物医学工程与肿瘤学教授Rong Li博士将这种蛋白团块处理系统比作为利用厨房水槽中的垃圾处理器处理家庭垃圾。这种处理是比较便利的，有助让房屋没有餐厨垃圾，但是危险在于如果有太多的垃圾，特别是很难磨碎的垃圾，那么这种系统可能会阻塞或者崩溃。

在之前的一项研究中，Li和她的团队就已发现在酷热等应激条件下形成的蛋白团块结合到线粒体的外表面上。线粒体的外表面上有一些孔，供这种细胞器在正常情形下运送制造它所需的蛋白。在这项新的研究中，他们发现这些蛋白团块结合到形成这些线粒体孔的蛋白上。如果这些孔因这些蛋白发生突变而遭受损伤，那么蛋白团块就不能够溶解。这些观察结果导致他们猜测在这些蛋白团块中，错误折叠的蛋白被扔进线粒体中进行处理，这种情形非常类似于将餐厨垃圾扔进垃圾桶中。Li说，测试这种假设是非常棘手的，这是因为大多数错误折叠的蛋白从细胞质中开始进入线粒体，而且针对这些进入线粒体中的错误折叠的蛋白而言，它们中的大多数被快速地降解掉。

因此，Li和她的团队采用一种技术，在这种技术上，一种荧光蛋白能够被分裂为两个部分。随后，他们将一个部分放入线粒体内部，并且将另一个部分与细胞质中的一种错误折叠的蛋白连接在一起。如果这种错误折叠的蛋白进入线粒体，那么这种荧光蛋白的两个部分能够结合在一起，照亮这个线粒体。事实上，这确实是这样发生的。

为了观察线粒体的蛋白团块处理功能出现故障时可能发生什么，Li和她的团队将一种参与肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS，也被称作路格里克氏病，是一种神经退行性疾病）产生的蛋白放入酵母细胞中。在接受导致这种ALS蛋白错误折叠的热处理后，它也在线粒体中缠结在一起。他们随后开展一项实验：让细胞质中的大量蛋白错误折叠，结果发现当太多的这些蛋白进入线粒体中时，这种细胞器开始降解。

Li和她的团队想要确信他们在酵母细胞中观察到的这种现象是否也能够人细胞中发生，因此他们同样地利用这种分裂为两部分的荧光蛋白观察错误折叠的蛋白是否进入在实验室培养的人视网膜色素上皮细胞的线粒体中。正如在酵母中观察到的那样，错误折叠的蛋白，而不是那些正确折叠的蛋白进入线粒体，并且照亮它们。

Li说，生物系统通常是非常强健的，但是它们也存在一些可能很容易导致疾病的致命弱点，比如依赖线粒体协助处理错误折叠的蛋白。尽管年轻的和健康的线粒体可能完全胜任这种清除任务，但是老化的线粒体或者在陷入困境的细胞中，那些忙于太多清除任务的线粒体，可能遭受损伤，这可能破坏它们的很多其他的至关重要的功能。

什么是电子漏，什么是线粒体电子漏？

　　对线粒体质子漏(proton leak）和电子漏(electron leak）的研究，是从20世纪70年代以来才在生物力能学(Bioenergetics）和自由基生物与医学(Free Radical Biology and Medicine）领域内开始进行的。生物力能学家通过大量实验发现，质子漏对机体的基础代谢率、能量转移过程的调节和能量分配可能起着重要作用〔1，2〕。自由基生物学家发现线粒体电子传递过程中电子漏所产生的氧自由基，是一类活性极强的物质，对组织、细胞具有较强的损伤性。它在生物衰老、疾病发生发展(如肿瘤、心肌梗塞、炎症等)及细胞程序死亡中起着极为重要的作用〔3，5〕。对质子漏及电子漏的研究在其它学科尤其是运动科学中尚未涉及。所以研究运动与线粒体质子漏及电子漏之间的关系，是一个很值得探讨的课题。
　　1 线粒体质子漏
　　1.1 质子漏的发现与概念
　　Nicolls于1974年在观察鼠肝线粒体的ΔP(质子电化学势能)与4态呼吸(线粒体呼吸底物耗尽时缓慢摄氧)速度的关系时发现：在ΔP达到一定数值以后，呼吸速度与ΔP之间呈非线性关系。4态呼吸对ΔP建立的贡献，在高ΔP时远小于低ΔP时。从而提示，在高ΔP时，有相当一部分已建立的ΔP被消耗掉了〔6〕。Nicolls认为，在高ΔP时，线粒体内膜的质子导性(proton conduction）增加了。内膜在此时表现为非欧姆特性的导体。也就是说，在高ΔP条件下，线粒体内膜允许已被质子泵泵出的质子以某种特殊的机制重新返回基质，而发生质子漏现象，因此使线粒体电子传递产生的质子电化学势能，在此时被质子漏所消耗。
　　在目前的文献报道中，已将静息呼吸状态(态4)的线粒体内膜在高ΔP时质子导性增加的现象称为质子漏。Murphy（1989)给质子漏下了这样的定义：“质子漏是指质子不通过F0F1－ATPase进行ATP合成，而直接通过线粒体内膜回到基质的过程，其结果导致贮存在ΔP中的自由能被消耗”〔2〕。
　　1.2 质子漏的可能机制
　　加解偶联剂到线粒体中可产生典型的质子漏〔7〕，其原因被认为是这些解偶联剂增加了线粒体内膜的质子导性。在生理条件下，在棕色脂肪组织线粒体中发现了一种增加其线粒体内膜质子导性的解偶联蛋白或称产热蛋白。这种蛋白质与线粒体内膜结合后可转变为有效的质子漏，这个漏可能是个氢离子通道〔8〕。上述过程可以消耗由游离脂肪酸氧化所产生的ΔP，并以热的形式释放自由能。解偶联蛋白通道的开通可使线粒体内膜的质子导性增加20倍。不过，这种解偶联蛋白在其它组织的线粒体中并未被发现。
　　除了上述解偶联蛋白可形成质子漏外，研究者还提出了氢键链模型〔9〕，电击穿模型〔10〕，质子移位体理论〔11〕等来解释质子跨越脂膜漏回基质的机制。我国学者刘树森提出线粒体态4呼吸中的电子漏产生的超氧阴离子可能作为内源性载体，即电子漏引起质子漏〔12〕。
　　总之，高膜电位时质子导性增强，质子漏回基质现象的发生，可笼统地解释为是由于高ΔP改变了质子跨膜势能障碍所致，但其分子机制并不清楚。
　　1.3 质子漏的生理意义
　　Nobes（1990）等人在完整肝细胞中观察了质子漏在总细胞耗氧所占的比例。他们测出约20～25%的细胞耗氧(或25～30%的线粒体耗氧)，用于驱动线粒体质子漏而产热，质子漏的耗氧量占线粒体总耗氧量的1／4～1／3〔13〕。
　　从能量转换的意义上来看，ΔP与4态呼吸速率之间的非线性关系，在由底物自由能转化为ΔP后，在低ΔP与高ΔP时是不同的，高ΔP时的能量耗散高于低ΔP。在3态呼吸时，能量从ΔP到ΔG(磷酸化势能)的转换增加，有利于更多的氧耗被用于ATP的合成。Ernster(1963)发现，增加己糖激酶的量，加快ATP的转运，也会增加ADP／O比〔14〕，因为加快ATP→ADP的转化，其结果同样可以降低ΔP。
　　较高的ΔP更利于引发质子漏，导致贮于ΔP的自由能以热的形式释放。应该认为，在生物体内，这种释放热能的形式并非能量的浪费，而可能是具有重要的生理意义：产热、保持体温、维持基础代谢。Brand认为：人体90%的静态热产生是来源于只占体重8%的内脏(如：肝、肾、心脏、脾、肠等)，而这些内脏的热产生可能是来源于其线粒体伴随氧化磷酸化过程中的质子回漏〔1〕。
　　虽然直到目前质子漏的生理意义尚未被肯定下来，不过很多的研究者发现，在生理条件下，线粒体质子漏的发生，会使氧化磷酸化得到最优的偶联系数，并使产热和氧化磷酸化这两个对机体十分重要的过程之间达到精确的平衡〔1，2，15〕。
　　2 线粒体电子漏
　　2.1 电子漏的概念及发现
　　体内大部分的氧耗发生在线粒体细胞色素氧化酶上。一个氧分子在此接受由呼吸链传递来的4个电子后被还原，并与4个H＋作用生成2个分子水，但在呼吸过程中，线粒体电子传递链会“漏出”少量的电子直接与氧结合形成超氧自由基(superoxide radical，)，这一现象被称为线粒体电子漏(electron leak）〔16〕。
　　随着对生物体内氧自由基检测手段的提高，如电子顺磁共振(ESR)的应用，人们逐渐发现了线粒体电子漏出的部位、数量及其在各种生理病理条件下的变化〔17，18〕。Loschen（1971）首先证明了线粒体呼吸链产生氧自由基〔19〕。Turrens等人(1980)发现线粒体中H2O2主要来自的歧化〔20〕。不同组织分离的线粒体在代谢过程中，都不同程度地检测到有的存在，因此线粒体已被肯定地认为是产生的重要场所〔18〕。
　　2.2 电子漏的可能部位
　　线粒体内膜呼吸链上的4个复合物中，复合物Ⅰ和Ⅲ被认为是电子漏产生的主要部位〔20〕。在生理条件下，复合物Ⅰ产生电子漏总量的2／3，复合物Ⅲ产生总量的1／3〔17，20〕。一般认为，细胞色素氧化酶能够将反应过程中产生的氧的中间产物——氧自由基牢固地结合在蛋白质上，而不游离到周围的环境中〔16〕。不过，在特定的条件下，如Ksenzenko(1992)用ESR检测发现，在H2O2存在时，细胞色素氧化酶可能催化H2O2产生〔21〕。徐建兴(1995)观察到外加H2O2浓度低于10－7M(接近生理浓度)时，仍可观察到电子通过细胞色素C直接传递给H2O2的现象。认为在细胞色素C处也存在一个电子漏，这个电子漏可能起着生理上清除和H2O2的作用〔22〕。
　　电子是如何从呼吸链漏出的，机制尚不清楚。有人认为从泛半醌(Ubisemiquione，QH*)自氧化生成〔23〕，也有人认为由还原性细胞色素的自氧化产生电子漏〔24〕。无论电子漏是由于泛半醌，还是由于还原型细胞色素的自氧化形成的，这两个电子传递体都具有较高的还原势能，都位于线粒体内膜的胞浆一侧。因此，从它们对产生的贡献来看，其机制可能是相似的。
　　2.3 电子漏的生理意义
　　目前，对于电子漏现象产生的在线粒体中的作用，报道最多的是关于它对生物体的损伤作用，如的进一步转化导致脂膜的过氧化，蛋白质的交联，核酸的破坏等等〔16〕。而对产生与存在的生理意义报道极少。但已有人观察到炎症反应时在中性白细胞中产生的有抵抗细菌、病毒的生理作用〔25〕。这些在细胞水平上观察到的的生理意义提示我们，在线粒体中，经长期进化后，依然有少量可躲避SOD的作用而存在着，势必有其特殊的意义。
　　3 电子漏与质子漏的相互作用
　　刘树森等(1995)提出了电子漏导致质子漏的假想模型〔12，26〕，其理论为：电子漏与质子漏是线粒体电子流与质子流这一能量转换基本反应相伴随的过程，电子传递和质子转移相偶联建立ΔΨ和ΔpH，ΔΨ的高电位可能是导致电子漏产生的条件，从而缓冲由于高ΔΨ所造成的电子传递障碍；而ΔpH的建立使膜表面pH下降，与质子结合形成易透膜的HO2*。HO2*可能作为体内的质子移位体，通过pH依赖的质子转运过程，将质子从内膜外侧转移到内侧，从而为质子漏提供条件以维持态4呼吸再循环，二者共同分配和调节ΔP以保持ATP合成与ΔP耗能产热之间的平衡。
　　4 运动与质子漏、电子漏的关系
　　按照Mitchell的化学渗透学说，线粒体通过电子传递和耗氧，建立跨线粒体内膜的质子电化学梯度，用于驱动ATP合成〔27〕。当高能质子由F0F1－ATPase复合体重新进入线粒体基质时，能量转化合成ATP。若线粒体内膜通透性改变时，质子可由非特异性部位渗漏回基质，即形成质子漏时，ADP／O将降低〔28〕。有假说认为：在运动时，由于体温升高，将增加质子通过线粒体内膜的特异性渗漏〔29〕。Brooks等人(1971)发现在寡霉素(质子通过F0F1－ATPase复合体的阻滞剂)存在的情况下，温度升高，线粒体态4呼吸耗氧也增加〔30〕。Kozlowski等人(1985)〔31〕报道高热可降低运动狗的能量态(energy state）。ATP需求一定时，能量态降低说明化学渗透质子环中存在短循环(质子漏)〔28〕。Willis等人(1994)观察到当温度从37℃升高到40℃时，线粒体ADP／O比下降10%〔29〕。朱丽萍等人也观察到随温度升高质子漏增加，30℃以上时增加更快〔32〕。
　　Klug等人(1980)观察到大鼠耗竭性跑台跑后，以琥珀酸为底物启动的肝脏线粒体态4呼吸明显增加，这直接表明耗竭运动可导致肝脏质子漏增多〔33〕。其原因除了温度影响之外，运动性内源自由基及线粒体钙反常应该起着很重要的作用。
　　运动可导致自由基生成增多及线粒体钙反常〔34，35〕。自由基及其引发的脂质过氧化反应可对线粒体膜造成多方面的损伤，如攻击膜蛋白和脂类，改变多种膜蛋白的脂微环境，使膜流动性下降，通透性增加〔36〕，这显然会导致非特异性质子渗漏的增多。线粒体钙反常也会损伤线粒体膜，如Ca2＋可激活PLA2，使膜脂降解〔37〕，其产物FFA、溶血磷脂又会产生类似去垢剂样作用，从而使线粒体内膜通透性改变，推测也会导致质子漏形成。
　　虽然有大量实验结果表明运动后线粒体膜受到损害，但仍缺乏足够证据说明质子漏形成增加是运动后线粒体ADP／O比降低，ATP合成减少的原因。
　　从Davies等人(1982)〔38〕首次用ESR捕捉到急性耗竭运动大鼠肝脏、骨骼肌的自由基信号后，运动性内源自由基生成增多已为国内外大量研究所证实。运动性内源自由基的产生目前认为有两条途径：黄嘌呤氧化酶途径和线粒体呼吸链途径〔39〕。电子传递过程中电子漏形成的是自由基的重要来源。由于运动时耗氧剧增，而超氧自由基生成与线粒体氧利用率成正比〔23〕，故推测电子漏所形成的自由基在运动性内源自由基中应占相当比例。从目前对运动后自由基的ESR检测来看，都是观察肌肉或肝脏匀浆，没有能够对线粒体直接观察，所以，在对运动性内源自由基形成的贡献上两条途径孰重孰轻，尚需进一步研究。
　　由于缺血—再灌注损伤与运动性脂质过氧化损伤机制相似，因此有关缺血—再灌注的研究或许对运动导致线粒体损伤的问题有所裨益。张桦等(1993)观察到心肌缺血—再灌注后质子转位发生变化，呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ复合物的H＋／2e比下降〔40〕。H＋／2e直接反映了线粒体能量转换的情况〔41〕。H＋／2e下降说明缺血—再灌注的鼠心肌线粒体能量转换的偶联程度下降。其原因可能是由于质子回漏增加或电子传递与质子泵出发生脱偶联所导致的。刘树森的研究表明这种偶联下降可能是由于电子漏产生的引起的〔12〕。
　　综上所述，线粒体质子漏与电子漏可能通过对线粒体能量转换过程及膜结构的影响，而在运动性线粒体功能下降中起着重要作用。但迄今为止，仍缺乏直接的实验证据。此外，运动中线粒体质子漏、电子漏的产生是否还有其它积极的生理意义，如质子漏是否可通过调节产热和氧化磷酸化平衡，起到保护性抑制作用等等，都值得进一步的研究。

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