a和b是南京大学教授谭仁祥从螳螂肠道真菌中首先分离出来的、具有强免疫抑制作用的聚酮类天然产物，在抑制小鼠脾细胞增殖中表现出与环孢素a相当的抗免疫活性，而且 a和b的细胞毒性则更小。有趣的是天然的 a和b均为两个对映异构体的非消旋混合物，初步生物活性测试表明天然的混合物比光学纯的对映异构体具有更强的抗免疫活性。从分子结构上看， a和b均具有一个独特的含有七个不同大小稠环和两个手性中心（其中一个为手性季碳）的高密度碳骨架，合成挑战性大。由于它们独特的生理活性和结构特征，国际上许多研究小组展开了对 a和b的合成研究。在此之前，仅有一例关于 a和b的消旋合成，路线冗长，而且产率低。
中国科学院上海有机化学研究所生命有机国家重点实验室汤文军课题组一直致力于发展高效的不对称偶联方法学并应用于手性天然产物和药物的绿色合成。两年前，课题组发展了分子内两芳基间的不对称去芳构偶联，实现了对含有手性季碳中心的菲酮类三环结构的高效不对称构筑，并完成了对一些甾体和萜类分子或中间体的简洁合成。最近，赵国庆、徐广庆和钱超利用不对称去芳构偶联为主要合成策略仅用九步高效完成了对 a和b 的首次不对称合成，总产率高达11%. 其中关键步骤包括：利用课题组自主研发的手性为配体的钯催化不对称去芳构环化-动力学拆分串联高效构建含手性季碳多环结构、大位阻stille偶联、ddq氧化高效构筑分子不饱和度以及一锅法炔烃水解加成环化。此项研究成果将积极推动新型免疫抑制剂的研究和发展。
该研究工作得到国家自然科学基金委、中科院战略性先导科技专项、中科院和生命有机国家重点实验室的大力资助。
由动物体产生的、极少量即可引起中毒的物质。
动物毒素大多是有毒动物毒腺制造的并以毒液形式注入其他动物体内的蛋白类化合物，如蛇毒、蜂毒、蝎毒、蜘蛛毒、蜈蚣毒、蚁毒、河豚毒、章鱼毒、沙蚕毒等以及由海洋动物产生的扇贝毒素、石房蛤毒素、海兔毒素等。毒液中还会有多种酶。
根据毒素的生物效应，动物毒素可分为神经毒素、细胞毒素、心脏毒素、出血毒素、溶血毒素、肌肉毒素或坏死毒素等。
不同动物所制造的毒素种类和生物效应均不相同，如蜂毒主要是神经毒素、溶血毒素和酶；蝎毒含神经毒素和酶；蜘蛛毒素含10多种蛋白、坏死毒素和酶；蛇毒所含毒素类型因蛇的种、属不同而有很大差异。动物毒素对人与动物有毒害作用，但也有一定药用价值。是农药开发的潜在资源。根据沙蚕毒的化学结构，已合成出类似物杀虫剂杀螟丹、杀虫双、杀虫环等，并已大量生产应用。
抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质。最初，人们在研究北美天蚕的免疫机制时，发现其滞育蛹经外界刺激诱导后，其血淋巴中产生了具有抑菌作用的多肽物质，这类抗菌多肽被命名为天蚕素(Cecropins)。后来，从其他昆虫以及两栖类动物、哺乳动物中，也分离到结构相似的抗菌多肽。迄今为止，在不同动物组织中已发现了很多具有抗菌作用的蛋白质和多肽，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的概念得到了极大的扩展。
根据抗菌肽的结构，可将其分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾中分离到的Magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。
抗菌肽的生物学效应
抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。
除此之外，人们还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。
抗菌肽的广泛的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景。
抗菌肽的作用机制
自从发现抗菌肽以来，已对抗菌肽的作用机理进行了大量研究。目前已知的是，抗菌肽是通过作用于细菌细胞膜而起作用的，在此基础上，提出了多种抗菌肽与细胞膜作用的模型。但严格地说，抗菌肽以何种机制杀死细菌至今还没有完全弄清楚。
目前一般认为,Cecropin类抗菌肽作用于细胞膜，在膜上形成跨膜的离子通道，破坏了膜的完整性，造成细胞内容物泄漏，从而杀死细胞。
对于抗菌肽破坏膜的完整性，使细胞内外屏障丧失，从而杀死细菌这一观点已得到基本统一的认识，但对其具体作用过程、是否存在特异性的膜受体、有无其它因子协同等问题尚不十分清楚，存在不同看法。不同抗菌肽的作用机制可能不一样，尚有待进一步研究
抗菌肽基因工程
抗菌肽在动物体内含量极微。从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，开展抗菌肽基因工程研究具有重要意义。
目前，已进入临床应用的基因工程药物多数是采用原核表达系统生产的，但由于抗菌肽对细菌的杀伤作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表达，将给表达产物的后处理带来很大麻烦。因此，国内外的研究者多采用真核表达系统进行抗菌肽基因工程研究。
近年来，以酵母为基因工程受体菌的研究引起人们的重视，酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。自1978年Hinnen等首先试验酵母转化成功后，已有人干扰素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等数十种外源基因在酵母中获得表达。国内研究者大量研究表明，利用酵母表达抗菌肽是一条可行的道路，如能在表达产率上得到进一步提高，将为抗菌肽早日进入临床应用奠定良好的基础。
一、概述
抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个被发现的抗菌队是1980年由瑞典科学家G.Boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins。此后数年间，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibactetial pepiides，ABP”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，因而对这类活性多肽的命名许多学者倾向于称之为”peptide antibiotics”一多肽抗生素。
二、抗菌肽的理化性质、作用机理和作用范围
天然抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右。大部分抗菌肽具有热稳定性，在l00℃下加热10～15min仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。
抗菌肽功能从目前的研究结果来看，一般认为抗菌肽杀菌机理主要是作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡。首先由静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的C端插入膜内疏水区并改变膜的构象，多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致某些离子的逸出而死亡。亦有学者认为抗菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡，亦有学者提出抗菌肽是否存在特异性的膜受休及有无其它因子的协同作用等问题。不同类别的抗菌肽的作用机理可能不一样。
抗菌肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。
1. 抗菌肽对细菌的杀伤作用
抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。国内外已报道至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。
2．抗菌肽对真菌的杀伤作用
最先发现具有抗真菌作用的抗菌肽是从两栖动物蛙的皮肤中分离到的蛙皮素（Magainins），它不仅作用于C+、C-，对真菌及原虫亦有杀伤作用。Defensins是一种动物细胞内源性杀菌多肽，是从吞噬细胞中分离出来的，具有很宽的抗菌谱，对G+的杀伤作用大于对G-的杀伤作用，它也作用于真菌和部分真核细胞。Cecropin A及其类似物如天蚕素——蜂毒素杂合肽对感染昆虫的真菌具有一定的杀伤作用。
3．抗菌肽对原虫的杀伤作用
抗菌肽Magainins对原虫有杀伤作用。实验证明抗菌肽可以杀死草履虫、变形虫和四膜虫。柞蚕抗菌肽D对阴道毛滴虫亦有杀伤作用。
4. 抗菌肽对病毒的杀伤作用
Melitiin和Cecropins在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制HIV-1病毒的增殖。Magainin-2及合成肽Modelin1 和Moderln－5对疱疹病毒HSV－1和HSV－2有一定的抑制效果。这些肽对病毒被膜直接起作用，而不是抑制病毒DNA的复制或基因表达。
5．抗菌肽对癌细胞的杀伤作用
抗菌肽对正常哺乳动物细胞及昆虫细胞无不良影响，但对癌细胞株则有明显杀伤作用。这种选择性机理可能与细胞骨架有关。已有有关抗菌肽对宫颈癌细胞、直肠癌细胞及肝癌细胞的杀伤作用与剂量相关的效应的报道。
三、抗菌肽的发展现状
迄今为止，从不同的生物体内诱导分离获得的抗菌肽已不下200多种，仅从昆虫中分离获得的就多达170余种。人们根据抗菌肽的来源及结构性质进行了分类。根据抗菌肽的结构，可将其分为5类
1．具有螺旋结构的线性多肽 cecropins是第一个被发现的动物抗菌肽，1980年，由Boman等从美国天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。此后，人们相继从家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇中分离到了cecropins类抗菌肽。1989年，Lee等人从猪小肠中分高到了cecropin P1，说明了cecropins可能在动物中广泛存在。cecropins对革兰阳性菌、阴性菌部具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。目前cecropins已被人工合成并已商品化。
magainins也是较早发现的一类具有双亲螺旋结构的抗菌肽。最初是从蟾蜍的皮肤中分离得到的，后来在哺乳动物的神经组织和肠组织中发现了其类似物。magainins对革兰阳性菌、阴性菌、真菌、原生动物都有杀伤作用，但是对革兰阴性菌的活性比cecropins要低10倍左右。
此外，从一些动物的再生性器官和两栖类的多种组织器官中分离得到了一些具有螺旋结构的多肽，如来源于南美蛙的dermaseptin和来源于树蛙的bombininh。
2．富含某种氨基酸的线性多肽 apidaecins是从蜜蜂中分离得到的富含脯氨酸的多肽抗生素，一般含有16～18个氨基酸残基，其中脯氨酸含量高达33％，精氨酸含量可达17％。apidaecins对某些革兰阴性菌具有很强的活性，而对革兰阳性菌不起作用。apidaecins对某些革兰阴性的植物病原菌和肠杆菌科的致病菌的高杀伤力，使其在植物抗细菌病基因工程和食品工业中有着很好的应用前景。
drosocin是来源于果蝇的一种富含脯氨酸的抗菌肽，在结构上与apidaecins具有一定的相似性，但是在其11位的苏氨酸羟基上连接着一个O－二糖链（－N－乙酰半乳糖胺－半乳糖。）
coleoptericin和hemiptericin分别来源于鞘翅目和半翅目昆虫，一级结构中富含甘氨酸，分子量一般较大。Oppenheim等人从人的腮腺和下颌腺分泌物中分离得到了一组富含组氨酸的抗菌肽，长度在7～38个氨基酸残基不等，被称为histatins。对于引起口腔感染的多种微生物具有活性。indolicidin是来源于牛中性粒细胞的多肽抗生素，因其13个氨基酸中含有5个色氨酸而得名。其C端是酰胺化的。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很强的杀菌活性。
3．含有一个二硫键的多肽 这是一类数量很少的抗菌肽，第1个被发现的这类多肽是bactenecin，来源于牛中性粒细胞。其12个氨基酸中含有4个精氨酸，在其第2位和第11位氨基酸残基间形成二硫键。bactenecin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有活性。这类多肽中还包括一些来源于蛙类皮肤的多肽抗生素，一般在C端有一个由7个氨基酸形成的“loop”和一个长的N端“尾巴”，如brevinin-1,brevinin-2。
4．含有两个或两个以上二硫键的多肽 这类多肽的典型代表是defensins，最初发现的α－defensins来源于哺乳动物的组织中，一般含有29～34个氨基酸残基，其中6个保守的半胱氨酸形成3个分子内二硫键，此外，其第6位和第15位的精氨酸，第24位的甘氨酸也是保守的。α－defensins可形成3层的β片层结构，通过3个二硫键和Arg-6与Glu-24之间的盐桥而被稳定。目前，defensins已被合成并已商品化。defensins对多种细菌和某些真菌具有杀伤作用，并且对真核细胞有一定的毒性。defensins对革兰阳性菌的活性比革兰阴性菌强。defenssins的活性比cecropins弱，并且通常在低离子强度下起作用。 β－defensins比α－defensins大一些，一般含有38～42个氨基酸残基。都含有3个二硫键和4～8个精氨酸。昆虫defensins在C末端与α－defensins相似，但是只有两个β片层结构，中间有一段α螺旋起稳定作用，主要对革兰阳性菌起作用，而对真菌没有作用。 植物defensins一般有45～54个氨基酸残基，可形成4个二硫键，3个β片层结构和一个α螺旋结构。植物defensins一般只对真菌起作用而对细菌没有作用。不同植物defensins对真菌的抗菌谱不同。 thionins也是一类来源于植物的多肽抗生素，含有45～47个氨基酸残基，有6个或8个半胱氨酸形成的3个或4个二硫键。其二级结构可形成2个反平行的α螺旋结构和2个反平行的β片层结构。thionins抑制多种植物致病细菌和真菌，但是对假单胞菌属和欧文氏菌属的细菌不起作用。
5．羊毛硫抗生素 羊毛硫抗生素（1antibiotics）是指一些由细菌产生的，由基因编码在核糖体中合成，经翻译后加工而含有一些特殊有机基团的多肽抗生素。其中研究最广泛的是nisin。它是来源于乳酸菌的一种抗菌肽，成熟多肽由34个氨基酸组成，含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基因。主要对革兰阳性菌起作用，而对革兰阴性菌不起作用，已被广泛应用作食品保鲜剂。nisin及其类似物在医药上的应用研究也正在进行。
四、抗菌肽在医药工业的应用及前景
目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。目前，已有多种多肽抗生素正在进行临床前的可行性研究，其中magainins已经进入三期临床试验阶段。一些多肽抗生素在医药研究中的进展情况。
现在大多数临床试验是用于局部治疗，这种治疗应该是安全和有效的，因为一些毒性更强的多肽和脂多肽，如短杆菌肽S，多粘菌素B已被用于制造皮肤软膏。这些多肽也可用于那些常规抗生素和常规疗法无效的地方。利用粉剂的方法治疗肺部感染是一个很有前途的发展方向。口服药物可能会被用于治疗肠道感染，nisin正在进行抗螺旋杆菌的临床试验。至少有两个公司正在开发非肠道给药的治疗方法。
抗菌肽基因工程在农业上的应用，主要是用于转化农作物培育抗病品种。由于抗菌肽对多种植物病原菌有杀菌活性，将抗茵肤基因导人植物体内表达可望提高其抗病能力。
抗菌肽基因用于转化农作物培育抗病品种，如抗马铃薯青枯病、烟草抗青枯病及水稻抗白叶枯病等已有良好的开端。
抗菌肽对正常哺乳动物细胞无不良影响，但对癌细胞株，部分病毒则有明显杀伤作用。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒方面具有良好的应用前景。
由于某些多肽抗生素对一些植物致病细菌和真菌具有很强的抗性，一些多肽抗生素已经被用于植物抗病基因工程。如Jaynes等将两个cecropin的类似物基因，Shiva-I基因和SB－37基因转入烟草，发现Shiva－I的转基因烟草对青枯病具有一定的抗性，而SB－37的转基因烟草没有抗性。Huang等的研究表明将cecropin类多肽MB－39基因与大麦、淀粉酶信号肽基因融合后转入烟草中，所得植株野火病的抗性增强。在国内，黄大年等利用cecropinB基因转化水稻，得到了一些对水稻细条病具有不同抗性的植株。
抗菌肽动物转基因的研究也已经取得了一些进展，比如可以通过基因工程的方法来阻断一些虫媒疾病的传播，Possani等的研究表明，在蚊子体内表达Shiva-3可以抑制疟疾的传播，但是在蚊子的转基因技术方面还存在着一些困难；Durasu1a等通过在长红猎蟋的共生菌中表达CecropinA明显减少了其体内锥虫的数量。Reed等将Shiva-Ia转入小鼠中，转基因小鼠对布鲁氏杆菌的抵抗力显著增强，这为人工培育抗病饲养动物新品种提供了新思路。此外，抗菌肽在食品防腐，鲜花保鲜和动物饲料添加剂等方面的应用研究也正在进展之中。
五、国内抗菌肽研究开发现状
华南农业大学教授黄自然及其研究组从我国特有物种柞蚕蛹中经人工诱导和提取的产物（溶菌酶）--抗菌肽，是经过十几年的努力取得的一项首创性科研成果。抗菌肽医药产品即以生物工程方法将抗菌肽纯化为一类新型药物。具有广谱性杀菌作用，并能抑制乙型肝炎病毒的复制。特别是对耐药性细菌，抗菌肽有较强杀灭作用，并能选择性杀伤肿瘤细胞，是一种具有作用靶点及新作用机制的化合物。
南开大学、天津大学和大港油田联手攻关，成功地从苍蝇体内分离出抑制多种病源菌和病毒的抗菌肽。目前多种抑菌实验已经完成，科研人员正在着手进一步纯化从苍蝇幼虫体内提取出的抗菌肽。
中国科学院上海生化与细胞所张永莲等人对名为Binlb的鼠源新基因的功能研究取得突破（批准号：39893320）。该基因只在附睾头部上皮细胞中特异表达具有抗菌功能的多肽，生育旺期表达最高。这是目前第一个发现与附睾防御系统相关的天然抗菌肽，人体也类似，也是国际上发现的第一个与男性生殖系统炎症相关的功能基因，第一次证实附睾具有免疫系统。其研究成果：《大鼠生殖系统中的一个抗菌肽基因》，于2001年3月在《Science》上发表，是我国生命科学基础研究成果第一次在《Science》上刊载。
中国水稻所黄大年教授主持的蚕抗菌肽B基因转化水稻的研究，抗菌肽B基因转化植株表现出对白叶枯病合细条病的抗性有明显提高,为水稻白叶枯病的抗性育种提供了一条新的途径.将该基因导入推广品种,可以获得农艺性状保持优良.另外,转基因第二代植株仍然表现对白叶枯病合细条病的抗性。
中国农业科学院生物技术研究中心研究员贾士荣完成了抗菌肽Cecropin B及Shiva A基因的合成，构建了表达载体，并将这些基因成功地导入我国七个马铃薯主栽品种(品系)，获得1050个转基因株系，经多年多点抗病性鉴定,初步筛选出三个较起始品种抗病的株系。
黄亚东，郑青，王林川，廖富苹，黄自然等采用病毒载体pAcGP67B，通过PCR点突变技术将柞蚕抗菌肽基因起始密码ATG删除以利于形成信号肽切除位点的编码序列。gp67信号肽的插入能引导表达产物分泌到细胞外而便于表达产物的鉴定及其生物活性的测定，对柞蚕抗菌肽D基因重组杆状病毒表达载体的构建及其表达。
六、总结
抗菌肽要成为药物，目前还需要解决一些问题。首先是来源问题。由于昆虫抗菌肽的天然资源有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。化学合成肽类，成本较高。而通过基因工程，在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因，虽然可以克服这一缺点，但仍有表达产物少的问题。尽管来自青蛙皮肤的抗菌肽maganin类作为基因工程药物已进入临床II，III期实验，但人们认为，只有每克价格低于10美元，抗菌肽才可能商品化。因此，如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，是应用抗菌肽必须解决的问题。其次，与传统抗生素相比，昆虫抗菌肽的抗菌活性还不够理想。改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是创造高活力抗菌肽的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽结构与活性的关系和作用机理，为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据
汗，你问的范围太广了！
常用的免疫抑制剂主要有五类：
1、糖皮质激素类，如可的松和强的松；
2、微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；
3、抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；
4、多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；
5、烷化剂类，如环磷酰胺等。
免疫抑制剂能抑制与免疫反应有关细胞的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。 免疫抑制剂主要用于器官移植抗排斥反应和自身免疫病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等。
扩展资料
常见免疫抑制剂介绍：
1、环孢菌素
环孢霉素可以有效地特异性抑制淋巴细胞反应和增生。对T细胞，尤其是TH细胞有较好的选择性抑制作用，而对其他的免疫细胞的抑制作用则相对较弱，因此在抗器官移植排斥中取得了很好的疗效。
2、他克莫司
他克莫司是从土壤真菌中提取的一种大环内酯类抗生素，具有较强的免疫抑制特性，其药物强度是环胞霉素A的10-100倍，预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢菌素。
3、雷帕霉素
雷帕霉素是一种用于固体状器官移植排斥反应的免疫抑制剂。雷帕霉素结构与他克莫司相似，但作用机制不同。雷帕霉素与他克莫司之间的相互作用尚未经深入研究。
参考资料来源：百度百科——免疫抑制剂
在抗肿瘤免疫应答过程中，药物的疗效很大程度上取决于肿瘤特异的效应性免疫细胞的功能状态，而效应细胞的增殖和活性受免疫检查点共刺激和共抑制信号的共同调节。因此增加抗肿瘤免疫反应往往是通过 增强作为正向调节的共刺激信号，或阻断负向调节的抑制信号 。但往往事情没有我们想的那么简单，尤其是在异质性很强的肿瘤微环境中，各种免疫调控网络纷繁复杂，这也就促使我们采用多种免疫检查点抑制剂联合治疗的方案。
目前发现具有可用于药物治疗的免疫检查点分子有很多： PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, PVRIG, NKG2A 等，因为PD-1/PD-L1和CTLA4最早被发现，也研究的最多，因此目前抗CTLA-4 与抗 PD-1/PD-L1 联合策略也被用于多种肿瘤的免疫治疗中。但这种组合方式在很多肿瘤患者中的疗效并不显著，还具有很强的副作用，因此近些年科学家正不断研究别的免疫检查点联合用药方式。其中因 TIM-3 广泛表达于T细胞、Tregs、B细胞、NK细胞、DCs、巨噬细胞和肥大细胞等各种免疫细胞，并与 Galectin9 、高迁移率组盒1( HMGB1 )和癌胚抗原相关细胞粘附分子1( CEACAM-1 )结合成为了近几年基础和临床研究工作者的青睐。此外，TIM-3与PD-1在耗尽的T细胞和TILs上的共表达现象为联合使用抗PD-1和抗TIM-3提供了一个思路。并且一些小鼠模型的实验为这种组合的有效性提供了直接证据，几个I期的抗PD-1联合抗TIM-3的研究已经在晚期和转移性实体肿瘤中开始施行。
那么接下来我就先通过解读今年发表在 Nat Commun (IF:14.91)一篇名为：Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy的文章介绍免疫检查点分子情侣PD-1/TIM-3以及 Galectin-9 的三角恋故事。
1.质谱分析筛选PD-1的结合蛋白
研究者首先通过IP/Western和免疫复合物的质谱分析确定了Galectin-9是PD-1的结合蛋白，且具有免疫调节活性。这里可能大家需要想到作者肯定筛选出了很多可以与PD-1结合的蛋白，然后通过实验逐一进行功能验证，最后发现Galectin-9蛋白具有较好的表型，因此后续都对这个蛋白进行分析。 类比这样的方法我们还可以筛选与自己研究基因相结合的蛋白，从而缩小靶基因的范围。 后续实验证明了Galectin-9与PD-1的结合是高度选择性的，并且是由多糖介导的，它不影响PD-1与其同源配体PD-L1的结合，也不影响PD-1和治疗性抗体Pembrolizumab和nivolumab的结合。
Galectin-9主要有两个CRD ( N-CRD，C-CRD )结合位点，研究者发现Galectin-9主要通过其 C-CRD 与PD-1结合，而N-CRD和C-CRD均介导其与Tim-3的结合。为了确定PD-1上与Galectin-9结合的糖基化位点，将PD1上4个可能的糖基化位点(N49、N58、N74和N116)上的天冬酰胺(N)残基分别突变为谷氨酰胺(Q)，发现 N116Q 突变在很大程度上影响了PD-1与Gal-9的结合，因此Galectin-9/PD-1的相互作用主要由Gal-9的C-CRD和PD-1的N116连接的糖链介导。
图1：
2. Galectin-9可与PD-1和TIM-3交联形成复合物
紧接着研究者通过平板蛋白结合实验，发现在没有Galectin-9的情况下，PD-1 ECD并不结合TIM-3 ECD，而Galectin-9促进了它们的协同结合。DuoLink实验和IP/Western实验的结果进一步证实了这一点。但神奇的是， 在没有外源Galectin-9的情况下，PD-1/TIM-3相互作用也能被检测到 ，这种相互作用并不被乳糖或PD-1 N116Q突变所抑制。这就好比PD-1/TIM-3本来是一对情侣，只是感情并不是太稳定，这时生活中出现了一个和两人都能处得来的好友Galectin-9，表面是调节二者关系，其实是和其中一人搞暧昧。
图2：
3. Galectin-9可作为癌症免疫治疗的靶点
通过流式细胞术分析,研究者发现 Galectin-9诱导的T细胞死亡可能与抗癌免疫抑制有关 ，因此研究者评估了抑制Galectin-9在癌症治疗中的潜力，并推测这可能是由于抑制Galectin-9后T细胞共刺激受损所致。接下来，通过将抗Galectin-9与 GITR (TNFRSF共刺激受体家族的一个成员)的激动型抗体DTA-1相结合验证了这一想法，它们的组合在不同的肿瘤模型中协同抑制了肿瘤的生长和延长了总生存期。因此，这些结果表明Galectin-9是肿瘤免疫治疗的靶点，并且抗Galectin-9联合GITR激动剂可以诱导出强大的抗肿瘤活性。
图3：
4. 质谱流式证实抗Galectin-9治疗针对特定的肿瘤浸润性T细胞亚群
只有推测，没有动物实验当然是不行的，研究者接下来就在荷瘤小鼠中进行体内实验。通过分析几组质谱流式的结果，研究者发现抑制Galectin-9可以选择性地扩大了瘤内TIM-3+ CD8T和CD4T细胞亚群，这也包括具有免疫抑制性的Treg细胞， 并且Treg细胞在总CD45+TIL中的比例增加 ，特别是CD8T细胞中CD8T_1亚群的比例在抗Galectin-9处理后增加了两倍以上。由于Treg可以特异性的抑制抗肿瘤免疫，因此接着通过联合使用抗Galectin-9和抗GITR（可特异下调Treg）后，CD8T亚群的比例进一步增加，而Treg细胞几乎完全丧失。因此，抗Galectin-9单一疗法虽然扩增了具有效应潜能的CD8T细胞亚群。然而，它的治疗效果可能会因为Treg细胞的共同扩增而受到影响。
图4：
一般情况下，CD8T细胞在肿瘤抗原的不断刺激下会逐渐失去功能，变成衰竭前体细胞。在这个阶段的CD8T细胞会高表达TCF1，同时也表达PD-1,TIM-3，如果肿瘤抗原持续存在，CD8T细胞就会走向终末衰竭的T细胞，并且逐渐走向死亡。但是处在这个终末衰竭性T细胞状态前的T细胞可以被抗Galectin-9治疗给逆转成具有较强增殖和分化能力的功能性T细胞，只不过同时扩增的还有Treg细胞。因此，联合使用抗GITR来控制Treg细胞的扩增则解决了这一难题。
图5：
5.单细胞数据揭示Galectin-9的表达分布
其实讲到这，文章的主体研究思路都讲完了，但是为了进一步解析Galectin-9在各类免疫细胞的表达情况，作者还分析了之前发表的一套单细胞数据。所以，这也进一步说明了数据挖掘的重要性。无论是多高级的研究思路，都是需要大数据作为支撑才变得更有说服力，这个数据可以来源于自己花钱测的，也可以来自已经发表的研究。这里作者就通过数据挖掘发现Galectin-9(LGALS9)在多种免疫细胞中都有表达，而且发现与对PD-1治疗没有应答的患者相比，应答患者表达更高水平的Galectin-9,这也证实了抗Galectin-9和抗PD-1联合用药的可能性。
图6：
6.关于免疫应答研究可做的生信思路
好了，上面介绍了如何通过 实验研究 免疫检查点分子间的互作关系从而探索影响肿瘤免疫治疗应答的因素，学习了一些实验设计的研究策略。然而，为了符合我一贯写作的气质，下面得对应来点别的有深意的生信干货。其实作为数据挖掘的热点，有关肿瘤对免疫治疗应答的相关生信思路有很多，下面主要列举几篇今年刚发表的研究免疫治疗应答的文章思路:
图7：
第一篇解读的是发表在Mol Ther Oncolytics（IF:7.20）杂志上篇名为“Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 + T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma”的文章。作者重新分析了已经发表的黑色素瘤单细胞数据，揭示出来7群CD8 T细胞亚群，这些亚群具有不一样的特征。此外，作者还鉴定出了3个在衰竭性CD8 T细胞上过表达的基因(PMEL, TYRP1和EDNRB)，它们与患者的不良预后显著相关。像这种思路，只要有数据都能很容易的复现一篇，至于发到什么样的杂志上，就看证实的发现是否新颖。
图8：
另一篇发表在 J Immunother Cancer （IF:13.75）篇名为：CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer的文章则是从影响免疫浸润的趋化因子着手。这个思路主要是对明星分子在不同癌型中的功能进行探索，需要通过实验来进行功能验证。因为明星分子被研究的很多了，除非做泛癌分析，否则基本上很难做出太新颖的东西。但是这类实验设计很简单，只需要证明某个明星分子在 特定的癌型 中通过何种方式影响免疫治疗反应即可。
图9：
如果觉得明星分子没有太多研究新意，当然还可以通过各种生信方法筛选出关键基因。接下来一篇发表在 Oncoimmunology （IF:8.11）的篇名为“YKT6, as a potential predictor of prognosis and immunotherapy response for oral squamous cell carcinoma, is related to cell invasion, metastasis, and CD8+ T cell infiltration”的文章就是先通过 WGCNA 的方法筛选出和免疫抑制相关的基因YKT6，进行后续的分析。对于这种新筛出的之前没有报道过的基因就比较容易说故事，当然这个思路有一些运气的成分，很有可能百费周折筛选出的基因要么没有很好的功能，要么就已经被报道。
图10：
如果你肿瘤免疫的生物学背景知识不强，也没有很好的实验平台，那么还有最后一种选择，那就是万能膏药之临床预测模型。最后一篇发表在 Front Immunol （IF:7.56）杂志上，篇名为“9-Gene Signature Correlated With CD8 + T Cell Infiltration Activated by IFN-γ: A Biomarker of Immune Checkpoint Therapy Response in Melanoma”的文章就是通过构建和免疫治疗相关的临床预测模型。有关临床预测模型的构建，现在已经很成熟了，如 LASSO,COX,NMF 等模型都可以套用。这个思路前提是需要找一个较为新颖切入点，且最后能被多套数据集验证出来，那就基本可以发表一点不错的SCI文章了。
7.小结
本文从研究肿瘤免疫治疗应答的这个科学问题着手，先是通过一篇以实验为主的研究型文章解读了如何通过巧妙的实验设计筛选出有潜力的免疫检查点分子，随后分别解读了一些纯生信和生信联合实验的文章思路。有关肿瘤免疫治疗问题可以研究的方向有很多，但是 一般需要先了解研究癌型的免疫治疗进展 ，有的问题在一些癌型中已经被研究的很通透，那就没有必要再去浪费时间了，而同样的科学问题在一些肿瘤中就还是一个未知，那这样的问题就比较有研究的价值了。此外，就像开头说的因为免疫治疗应答与否牵扯的问题主要和免疫细胞的比例有关，而免疫细胞在肿瘤中的占比不高，因此bulk测出来的高表达基因主要是肿瘤细胞自身的基因，从这个角度看基于 bulk数据差异分析找出的高表达基因需要用肿瘤细胞系去做实验验证 。而单细胞数据就比较利于揭示免疫细胞上表达和免疫治疗的基因，但是商品化的10X平台可测得的基因不多，我的经验是先从单细胞数据揭示各种免疫细胞的比例，找出应答和非应答的差异免疫细胞亚群，从而进一步找出高表达的基因，最后通过简单实验进行免疫细胞的功能验证就基本都可以发表一篇不错的生信文章了。
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原代培养（primary culture）又名初代培养，是从供体取得组织细胞后的首次培养。其特点是细胞或组织刚离开机体，生物性状尚未发生很大的改变，一定程度上反映了它们在体内的状态，表现出原组织或细胞的特性。对于药物实验研究，原代培养是一种很好的实验技术。由于原代培养的组织含有多种细胞成分，即使生长出同一种类型的细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织的类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。因此原代培养细胞的部分生物学特征尚不够稳定，在进行较为严格的对比性实验研究时，还需先对细胞进行短期传代。近年来，原代培养技术已被广泛应用于中医药研究尤其是中药研究之中。1 原代培养技术1.1 组织块培养法 组织块培养法即将组织剪切成小块后接种于培养瓶，简便易行且成功率较高。但由于反复剪切和接种过程对组织块易造成损伤，因此并不是每个小块都能长出细胞。此法适于细胞数量较少的原代培养，如牙髓细胞培养等。1.2 消化培养法 用酶制剂（最常用的是胰蛋白酶）处理组织块，除去细胞间质，使细胞相互分离形成单细胞悬液，大多形成单层细胞生长方式。本法的优点在于单层细胞更易摄取营养及排出代谢产物，因此生长较快。但操作不慎易于造成污染，且消化处理须恰到好处，否则会对细胞产生一定的损伤。随着实验技术水平的提高，目前此方法已被较多地应用于研究之中［1］。2 原代培养技术在中医药研究中的应用 综合近十年来的文献报道，体细胞、血细胞和肿瘤细胞的原代培养技术较为成熟，已被应用于中医药的研究之中，尤其是肝细胞和神经细胞的原代培养，其应用更为广泛。2.1 用于中药药理学研究 中药药理学研究是目前应用原代培养技术最广泛的领域，被称为中药的生物学效应研究，用以了解中药的细胞药理与毒理作用。与体内整体实验相比，体外实验具有简便迅速、条件易控制、药理靶点与环节较为清楚等优点。2.1.1 用于药效学研究 利用原代培养技术研究中药有效成分和复方的作用效果和机制，是从分子水平研究药效的重要手段。 朱陵群等［2］研究发现：原代培养的大鼠海马神经细胞缺氧、缺糖5 h后再给氧，可诱导神经细胞凋亡和细胞坏死，并显著增加细胞内Ca2＋浓度和乳酸脱氢酶的释放，且随再给氧时间的延长而增加；三七总皂苷能降低神经细胞凋亡及坏死的百分率，降低细胞内Ca2＋浓度，减少乳酸脱氢酶的释放，且其作用随剂量增加而增强。Shih等［3］发现，川芎提取物川芎嗪可以保护原代培养的大鼠海马神经元线粒体，减少自由基的产生并帮助清除自由基，从而对红藻氨酸所致的细胞损伤起到保护作用。刘晓玲等［4］原代培养大鼠滑膜细胞，发现青藤碱可以通过抑制滑膜细胞恶性增殖及白细胞介素6 mRNA基因的表达来阻断滑膜炎的进程。林爱华等［5］报道，粉防己碱可以明显抑制气道平滑肌细胞的增殖活性。粉防己碱对组胺激发的［Ca2＋］ i升高表现出明显的抑制效应，推测粉防己碱抑制培养的气道平滑肌细胞增殖活性的作用可能是通过阻断细胞膜Ca2+通道而降低［Ca2＋］ i实现的。Bickmeyer等［6］研究报道，粉防己碱可以阻滞原代培养的牛嗜铬细胞电压依赖式钙离子通道，促进儿茶酚胺释放，增加细胞内钙离子的水平。崔云华等［7］原代培养大鼠肝星状细胞，发现丹参酸乙可降低活化的以及经丙二醛刺激后的肝星状细胞内的氧化程度、抑制增殖细胞核抗原的表达量，在抗氧化和抗增殖作用之间可能存在一定的联系。Li等［8］原代培养中脑神经元及神经胶质细胞，发现雷公藤提取物雷公藤内酯可以对抗脂多糖所致的多巴胺吸收减少和细胞中酪氨酸羟化酶免疫活性的丢失、抑制小神经胶质细胞的活动和肿瘤坏死因子α及一氧化氮的过度生成。雷公藤内酯还可保护脂多糖所致的多巴胺能神经元的损伤，其机制可能是抑制小神经胶质细胞的活动。Kamei等［9］采用原代培养技术培养大鼠脂肪细胞和心肌细胞，首次证实中药提取物紫草素在体外实验中具有胰岛素样作用。Hsu等［10］采用原代培养技术培养嗜中性粒细胞，发现灵芝多糖可促进嗜中性粒细胞的移动，增强蛋白激酶C、丝裂酶原激活蛋白激酶和酪氨酸激酶的活性，从而增强嗜中性粒细胞的趋化性和吞噬作用。Wang等［11］报道，从白术中提取的有效成分苍术酮对原代培养的人白血病单核细胞有一定的细胞毒性。 万文成等［12］发现清开灵能减少谷氨酸所致的原代培养大鼠大脑皮层神经细胞内乳酸脱氢酶的漏出量、减轻细胞的形态学改变，表明清开灵能够对抗谷氨酸介导的兴奋性毒性，对培养的大鼠皮层脑细胞具有保护作用。李彧等［13］原代培养大鼠系膜细胞，经脂多糖刺激10 h后，核转录因子-κB的活性达到最高峰，且最高荧光强度位于细胞核内；大剂量温脾汤药物血清可明显抑制核转录因子-κB的活性；大剂量药物血清能明显抑制核转录因子-κB抑制剂IκB的降解。李彤等［14］采用血清药理学方法及原代培养心肌细胞技术，发现在通脉汤含药血清干预下，缺氧心肌细胞游离钙离子的浓度明显下降，同时细胞膜L型钙离子通道的表达在缺氧条件下亦明显下降，表明通脉汤可以减轻缺氧心肌细胞钙的超负荷。尤红等［15］的实验结果显示，一定浓度的复方861（由丹参、黄芪等十味中药组成）可以促进体外分离培养的大鼠肝细胞DNA的合成，对肝细胞的凋亡则无明显影响。张斌等［16］观察抗纤复方对大鼠纤维化肝原代培养贮脂细胞自分泌的影响，结果表明抗纤复方药物血清能明显抑制贮脂细胞产生转化生长因子β1，阻断肝纤维化时贮脂细胞的自分泌。Imanishi等［17］采用原代培养技术培养肝星状细胞，并用硫代乙酰胺造成肝纤维化模型。结果表明，茵陈蒿汤主要是通过抑制血小板源生长因子b受体的磷酸化及下行信号传导通路来抑制DNA的合成与转录，可能是茵陈蒿汤治疗肝纤维化的机制。Zhang等［18］原代培养胎鼠皮层神经细胞，用谷氨酸盐造成细胞损伤，使细胞中胆碱酯酶和链亲合素标记的过氧化物酶活性降低、乳酸脱氢酶释放增加。加入清脑益智方药物血清后，上述酶的活性可恢复至正常水平，一氧化氮的生成及细胞凋亡亦受到抑制。2.1.2 用于方剂配伍机制的研究 刘成海等［19］将扶正化瘀319方进行拆方，各自制备药物血清并作用于原代培养肝细胞。结果显示，各药物血清对细胞形态无明显影响，对肝细胞白蛋白分泌及其前白蛋白原mRNA表达则有不同程度的促进作用，其中尤以扶正化瘀319方全方的作用最为显著。2.2 用于针灸学研究 梁希彬等［20］观察电针后大鼠中脑腹侧部粗提液对体外培养多巴胺能神经元表达数目、神经元胞体直径及神经突起长度的影响。实验证实，电针后大鼠中脑腹侧部粗提液能够促进多巴胺能神经元胞体的发育和突起的生长，但对多巴胺能神经元表达数目则无明显影响。2.3 用于中医证候本质的研究 陈云波等［21］采用血瘀证兔模型血管内皮细胞直接培养以及血瘀证兔模型血清培养血管内皮细胞两种方法，建立血瘀证细胞损伤模型。原代培养的血管内皮细胞出现了病理性损伤及内分泌功能的改变。此外，模型组原代细胞培养液中一氧化氮的含量比对照组明显减少，而内皮素含量则有上升趋势。证明实验建立的细胞损伤模型从功能和结构上能反映血瘀证整体动物模型及部分临床病人的病理特征，可用于血瘀证实质和活血化瘀作用机制的研究。3 原代培养技术应用于中医药研究存在的问题及前景3.1 加强相关的基础研究 原代培养经首次传代成功即成细胞系，通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定、生物性状较为明确的细胞群。细胞系分裂繁殖过程中形成单层有利于培养，细胞亦可冻存，以备以后的培养。一般来说，细胞系优于原代培养。细胞系在中医药研究中已被广泛应用，如各种肿瘤细胞、肝星状细胞系、巨嗜细胞系、经乙肝病毒基因转染的肝细胞等，主要用于中药的药效学研究。但毕竟还有许多细胞尚无法获得细胞系（株），尤其在现阶段的中国，稳定的细胞系、细胞株不易获得，原代培养细胞至少提供了体外细胞水平实验的工具。因此，须加强细胞培养的基础研究，将更多的细胞系（株）应用于中医药研究领域，使中医药研究在细胞水平上有所提高。 目前，国内外已有许多取材于人的细胞培养研究，其细胞多取材于器官捐献者。国内在此方面的研究工作开展较少，在中医药领域中的研究才刚刚开始。由于存在伦理学等方面因素的制约，其应用范围仍然较窄，目前主要用于一些比较容易获得的细胞，如子宫内膜细胞、人牙髓细胞、角质细胞（来源于手术切除的包皮）、血细胞及血管内皮细胞（来源于脐带）等，还有一些来源于手术切除的细胞，如肿瘤细胞及腹主动脉瘤血管平滑肌细胞等。 细胞培养技术研究中药时的一个关键技术是中药的给药方法，关于这方面的基础研究正日益受到重视。目前在中药药效学研究中主要存在两种给药方式：（1）直接添加法。将中药复方以水煎醇提等方法进行粗提，直接添加于培养体系，或将粗提物冷冻干燥，再用培养液稀释后添加于培养体系。该方法简便，但易受制剂的杂质、pH值、渗透压、电解质等因素影响。国内外相关研究中已有使用中药有效成分进行直接添加的实验报道。（2）间接添加法（血清药理学方法）。给予动物复方灌胃给药，收集服药后的动物血清，将含药血清添加于培养细胞。该法避免了体外用药的一些干扰因素，但起步较晚，尚有待进一步完善。3.2 用于中医理论的研究 细胞培养技术在中医药研究中主要用于中药尤其是药效学的研究，并已取得不少成果。迄今为止，研究目的多限于验证临床有效复方或探索其可能的作用机制，但这显然是不够的。应充分发挥体外实验的优势，深入研究中药复方在组方、剂量、辨证论治上的奥妙，进而推陈出新，给临床以启示或指导［22］，这对于开发中药、推进中医药走向世界有重要意义。 此外，运用细胞培养技术阐明中医理论的实质亦是值得探索的领域。如吴正正等［23］提出中医“证”（虚证和部分实证）的本质是细胞内基因诱生性表达的细胞因子。中医“证”发生的分子机制是由于细胞因子网络自稳态平衡破坏的结果。阴虚证的本质可能是由于白细胞介素1和肿瘤坏死因子基因表达增强、生物学活性相对升高，引起细胞因子网络自稳态平衡失调的结果。现已有一些研究证候实质的实验，如血瘀证血管内皮细胞病理模型的建立及其相关研究。郑爱华等［24］探讨了肝郁证、脾虚证模型动物干扰素γ及白细胞介素4 mRNA表达的变化。由于传统中医理论比较重视整体而忽视微观的原因，因而从细胞、分子水平来研究中医基础理论的工作目前还相对较少，利用细胞培养技术深入进行这方面的研究，可以促进中医基础理论研究的进一步发展。
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