如何利用基因魔剪—crispr技术来进行非编码基因组功能的研究呢？

如何利用基因魔剪—crispr技术来进行非编码基因组功能的研究呢？

我们或许才刚刚开始打开对巨大的基因组非编码区域的研究，基于crispr的两项新技术或许就能够帮我们开启研究的新篇章。我们（原文笔者）能够很好地理解基因组中编码蛋白组分背后的规则，同时通过对dna序列的观察我们也能够找出从事编码作用的基因的开始以及终止位置。

对于基因组中残留的98%的基因组而言，却又是一番不同的故事了，如今我们对于dna暗物质的理解都是来自于对非编码dna单个片段的研究和理解，而真正指导非编码基因组发挥作用的规则目前研究者并不清楚。博德研究所的创始主任eric lander说道，90%的影响人类疾病的遗传突变都位于非编码区域，但如今我们并没有有效的方法去阐明到底是哪些调节子在影响着这些基因的表达

刊登在science杂志上的一篇研究报告中，来自博德研究所的两个研究团队通过研究利用crispr基因编辑技术揭示了非编码基因工作的机制。利用两种互补的方法，研究人员以crispr作为工具系统性地同时调查了数千个非编码的dna序列，研究人员（来自lander实验室和来自zhang feng实验室的研究者）在研究中鉴别出了多个非常有意思的遗传调节子，其中就包括那些远离所控制基因位点的数以百万计的碱基。

研究者jesse engreitz指出，我们希望能够在每个细胞周期中对控制每个基因表达的非编码元件进行编录，这在生物学研究上是一个非常大的问题，而且这也是一个限速的步骤，即将和基础分子机制相关的许多遗传特性同人类疾病相联系。

变化多端

目前两个研究小组都利用了crispr进行了相关筛查来干扰非编码的dna，但两个研究小组却是利用不同的方法来进行了相关研究。研究者张峰（zhang feng）利用cas9来对非编码dna的重叠延伸片段进行精准的切割，在这种情况下，围绕在三个基因nf1， nf2和cul3周围区域的功能就会丧失，而这与某些形式的黑色素瘤耐药性产生直接相关。研究者解释道，这种方法就能够帮助我们诱导一系列多样性突变的产生，而且我们也不必推测既定的序列为何会被干扰。

另外一组研究者engreitz等人则利用了crispr的干扰系统，即利用失活形式的cas9同krab蛋白相互融合从而沉默靶向序列的表达，这些靶向序列围绕在myc和gata1附近，这两个基因是重要的转录因子。engreitz说道，这种系统能够帮助我们队非编码区域的调节性影响进行定量的评估，同时其还能够为我们展示如何能够控制一个既定的基因。

每个研究小组都利用了一种功能性的“读数器”以及深度的测序技术观察了哪种导向rnas能够影响目标基因的表达，同时还能够帮助绘制出导向rnas所影响的调节子的图谱。两个研究团队的研究结果都阐明了利用crispr工具追踪非编码基因组调节机制的重要性。研究者engreitz等人阐明了7个myc和3个gata1增强子的重要性，而张峰研究团队则筛选出了多个增强子以及仅结合cul3的转录因子结合位点。

在“自然栖息地”对序列进行研究

类似于传统的报道分子实验，即科学家们感兴趣的在质粒中将序列同报道自偶联进行研究；这些混合的crispr筛选技术有着明显的不同，其能够直接探查序列，也就是说在最原始的位点进行序列的研究解读。研究者sanjana强调道，这些筛选技术能够从内源性的角度来对序列进行研究，同时报道子实验也是非常有帮助的，但其缺少了3d构象和局部的染色质环境，在这里这些调节性序列或许就会经历正常的一些相互作用。

研究者表示，举个例子说，我们或许能够在基因启动子和非编码位点之间观察到长期的循环结构，但如果我们仅仅观察这些调节性原件的话或许就会错过一些感兴趣的3d相互作用。engreitz指出，目前存在一种限制，不管是crispr方法还是别的方法，在当前的形式下，发现基因组固有的冗余程度或许并不足以破碎一种增强子来理解基因被控制机制，或许我们需要对多个增强子进行打断来研究。

但engreitz及其同事表示非常乐观，他们希望能够利用基于crispr的技术来阐明非编码基因组背后所隐藏的秘密。目前在非编码基因组上研究的最大挑战就是，尽管非编码基因组非常庞大，但其中所包含的单一功能性元件却是非常小的，未来研究者希望开发新的研究方法在保证非编码基因组较高分辨率的情况下对更大的基因组区域进行探索。

研究者指出，随着他们绘制出多个图谱以及其相关性，他们相信能够帮助预测关于非编码基因组的一些信息；利用导向rnas文库引入crispr或者抑制子或许就能够帮助研究者阐明大块区域的非编码dna对不同基因的作用以及效应，而届时科学家们或许才刚刚打开对基因调节的系统性图谱研究的第一步。

上帝的手术刀中基因的秘密有哪些科学家做出了贡献

“上帝的手术刀”对海洋生物做了啥？
今年的诺贝尔化学奖颁发给了两位女科学家——埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna），以表彰她们开发了被誉为“上帝的手术刀”“基因魔剪”的CRISPR/Cas9基因编辑技术。

今年的诺贝尔化学奖得主
CRISPR即成簇的规律性间隔排列的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat ）。Cas是CRISPR关联基因（CRISPR associated gene）的缩写。
CRISPR最初由日本科学家在大肠杆菌中发现，后来被证明广泛存在于约45%的细菌和约90%的古细菌中，是其抵御噬菌体入侵的重要武器。
当噬菌体第一次侵染细菌时，细菌的Cas1和Cas2蛋白会将噬菌体的一小段DNA片段整合到自己的重复序列区中，成为一个新的间隔序列。待同一种噬菌体再次来袭时，病毒DNA被间隔序列转录的guide RNA识别，并激活Cas核酸酶，切断噬菌体的DNA双链，从而守护自身安全。利用此原理，科学家们可以实现对研究对象某一特定序列的靶向敲除、敲入等。

CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9系统可分为三类，其中CRISPR/Cas9结构和操作更简洁，由guide RNA引导Cas9核酸内切酶进行靶向基因编辑，自2013年首次运用到真核生物基因编辑以来，发展迅速，曾于2013年、2015年两次被Science杂志评为当年十大科学突破，且今年终于不负众望，摘得诺奖桂冠。
目前关于CRISPR基因编辑技术的报道多集中于人类医学（处于实验室研究阶段）和线虫、拟南芥、果蝇、斑马鱼、小鼠等模式生物。那么，这把“上帝的手术刀”在海洋生物中的应用取得了哪些进展呢？

构建海洋模式生物与疾病模型
将CRISPR基因编辑技术运用于海洋生物的最早报道可追溯至2014年。这一年，Sasaki、Stolfi等人均以海洋模式生物——玻璃海鞘（Ciona intestinalis）为研究对象，利用CRISPR技术先后实现了Hox基因定位和ebf基因定点突变。

Hox基因是一种动物基因组内高度保守的发育调控基因，在动物体轴形成过程中起重要的作用。ebf基因可在胚胎发育过程中决定细胞命运。这两种基因突变的玻璃海鞘模型可用于探究脊索动物身体形成的分子机制。
2016年，Nymark等将CRISPR技术运用到了海洋藻类中, 成功敲除了三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的CpSRP54基因。
CRISPR技术为海洋生物模型构建提供了新的视角，加快了科学家们探秘海洋生物起源与进化的步伐。

培育海洋经济新品种
海产鱼虾贝蟹是我们饮食中重要的蛋白质来源，而良种的培育能促进海水养殖业快速发展。利用基因编辑技术在新品种培育中具有诸多优势，如育种周期短、靶向性强、比转基因技术安全性高等，有着广阔的应用前景。
2019年，Kim等将肌生成抑制素（PoMSTN）基因相关基因编辑组件通过显微注射导入牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎中，经过筛选，得到了杂合双等位基因突变体，表现为身体增厚，肉质更加肥满。

与野生型（左）相比，PoMSTN基因杂合突变的牙鲆（右）的肥满度增加（图片来自Kim等，2019）

今年，来自河北大学的研究者们利用CRISPR/Cas9技术敲除了脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）的类胡萝卜素异构加氧酶（EcNinaB-X1）基因，发现突变体在受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻击时存活率明显高于野生型；又敲除了另一个类胡萝卜素加氧酶基因EcBCO2，突变体具有更高的抗病性。这些研究发现为培育抗病抗逆对虾新品种提供了新思路。

解析海洋生物基因功能
解密基因的功能是解读生命这部“天书”的先决条件，基因编辑技术为科学家们提供了一个解密的绝妙手段。2014 年，Nakanishi等人将CRISPR 技术首次运用于甲壳动物，失活了大型溞（Daphnia magna）的pax6 基因，证明了该基因在眼发育中的关键作用。2019年，Liu等人成功敲除海胆的聚酮化合物合酶1基因（Psk1），突变个体从表现为白化。

野生型（左）与Pks1基因敲除的白化海胆（右）（从3个月至成年）

需要承认，基因编辑技术在海洋生物的应用仍处于初级阶段，受到海洋生物材料本身问题（如显微注射后的受精卵孵化率有待提高、海洋生物细胞系数目较少等）、CRISPR系统脱靶问题等方面的制约。但毫无疑问，海洋生物基因编辑领域的前途是光明的，我们有理由相信科研工作者们会不断创新，成功解决上述问题，取得海洋生物基因编辑领域的一个又一个成就！

参考文献
Doudna J A, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science, 2014, 346(6213): 1258096.
Kim J, Cho J Y, Kim J W, et al. CRISPR/Cas9-mediated myostatin disruption enhances muscle mass in the olive flounder Paralichthys olivaceus[J]. Aquaculture, 2019, 512: 734336.
Liu D, Awazu A, Sakuma T, et al. Establishment of knockout adult sea urchins by using a CRISPR‐Cas9 system[J]. Development, Growth & Differentiation, 2019, 61(6): 378-388.

对基因编辑的理解

你好，很高兴为你解答：

基因编辑什么意思
基因编辑，又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。

基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂（DSB），诱导生物体通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。

?

基因编辑已经开始应用于基础理论研究和生产应用中，这些研究和应用，有助于生命科学的许多领域，从研究植物和动物的基因功能到人类的基因治疗。下面主要介绍基因编辑在动植物上的应用。

动物基因的靶向修饰

基因编辑和牛体外胚胎培养等繁殖技术结合，允许使用合成的高度特异性的内切核酸酶直接在受精卵母细胞中进行基因组编辑。 CRISPR -Cas9进一步增加了基因编辑在动物基因靶向修饰的应用范围。CRISPR-Cas9允许通过细胞质直接注射（CDI）从而实现对哺乳动物受精卵多个靶标的一次性同时敲除（KO）。

单细胞基因表达分析已经解决了人类发育的转录路线图，从中发现了关键候选基因用于功能研究。使用全基因组转录组学数据指导实验，基于CRISPR的基因组编辑工具使得干扰或删除关键基因以阐明其功能成为可能。

植物基因的靶向修饰

植物基因的靶向修饰是基因编辑应用最广泛的领域。首先可以通过修饰内源基因来帮助设计所需的植物性状。例如，可以通过基因编辑将重要的性状基因添加到主要农作物的特定位点，通过物理连接确保它们在育种过程中的共分离，这又称为“性状堆积”。其次，可以产生耐除草剂作物。比如，使用ZFN辅助的基因打靶，将两种除草剂抗性基因（烟草乙酰乳酸合成酶SuRA和SuRB）引入作物 。再次，可以用来防治各种病害如香蕉的条纹病毒。

此外，基因编辑技术还被应用于改良农产品质量，比如改良豆油品质和增加马铃薯的储存潜力。

基因编辑技术形式有哪些

基因编辑技术形式有：

1、同源重组

同源重组（Homologous recombination）是最早用来编辑细胞基因组的技术方法。同源重组是在DNA的两条相似（同源）链之间遗传信息的交换（重组）。

2、核酸酶

基因编辑的关键是在基因组内特定位点创建DSB。常用的限制酶在切割DNA方面是有效的，但它们通常在多个位点进行识别和切割，特异性较差。为了克服这一问题并创建特定位点的DSB。

基因编辑技术的应用：

基因编辑和牛体外胚胎培养等繁殖技术结合，允许使用合成的高度特异性的内切核酸酶直接在受精卵母细胞中进行基因组编辑。
CRISPR
-Cas9进一步增加了基因编辑在动物基因靶向修饰的应用范围。CRISPR-Cas9允许通过细胞质直接注射从而实现对哺乳动物受精卵多个靶标的一次性同时敲除（KO）。

单细胞基因表达分析已经解决了人类发育的转录路线图，从中发现了关键候选基因用于功能研究。使用全基因组转录组学数据指导实验，基于CRISPR的基因组编辑工具使得干扰或删除关键基因以阐明其功能成为可能。

以上内容参考：百度百科—基因编辑技术

基于CRISPR/Case9全基因组敲除文库筛选功能基因

1. 文库构建：针对某个物种，每个基因设计3个或以上的sgRNA，高通量合成sgRNA，然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒载体中。

2. 慢病毒转导：包装GeCKO慢病毒文库，并以低MOI（一般标准<0.3）感染靶细胞，保证一个病毒颗粒感染一个细胞，筛选同时表达sgRNA和Cas9的细胞；每个细胞都只会敲除自身携带的sgRNA对应的一个基因，细胞文库中包含的细胞的数量一般为细胞文库中全部sgRNA数量的100-1000倍。

3. 表型筛选：将全基因组敲除细胞库分成两份，其中一份作为实验组施加筛选压力，如：病毒侵染，药物治疗等；另一份作为对照组。根据耐药性、增殖能力、存活能力等表型筛选细胞。

4. 候选基因的分析：将实验组和对照组的细胞分别抽提基因组，PCR扩增sgRNA片段，高通量测序，并进行生物信息学分析。

根据筛选目的的不同，分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选是对已成功整合sgRNA的细胞文库施加一定的筛选压力，仅使少数目的表型的细胞能够存活，达到富集关键基因的目的。阴性筛选与之相反，存活的细胞并不是目的表型细胞，需要比较不同时间点sgRNA的丰度找出差异sgRNA来确定关键基因，阴性筛选可以鉴定出引起细胞某些功能缺失的基因，如筛选时间较长，可以筛选到细胞生存所必需的基因。

个人理解：阳性、阴性筛选或者正向、负向筛选听起来容易混淆，其实在英文中就2个词，positive selection和negative selection，无论怎么选择，最后都是看sgRNA的计数情况，然后根据实验目的确定候选基因。如果最后选出的细胞内富集的sgRNA所靶向的基因就是我们要的目的基因，那么这种选择我们称其为positive selection。相反，如果最后富集的sgRNA并不是我们实验想要的，我们通过比较不同时间点的sgRNA变化进而推断候选基因，这样的选择称之为negative selection。举个例子，我们要筛选细胞生长的必需基因，如果把这个基因敲除了（这个基因由其对应的sgRNA作为标记，每个细胞内都敲除了一个基因），那么细胞肯定不能存活了，对应的sgRNA肯定也不会富集。所以存活的细胞意味着没有敲除必需基因，随着细胞的增值，整合到其基因组上的sgRNA大量富集，我们最终测到了这些sgRNA，但其靶向的基因敲除了并不影响细胞生长，所以这些基因不是目的基因。因此我们比较不同时间点sgRNA的消耗情况，那些sgRNA明显减少的，其靶向的基因才是必需基因。

那么什么情况下是positive selection？我们知道，这两者是反的，所以假如我们想筛选细胞生长的抑制基因（和必需基因相反），这种情况就属于positive selection（和negative selection相反）。如果敲除了抑制基因，显然细胞可以正常增值，抑制基因对应的sgRNA也能不断富集，这两个方向是相同的。

如果富集sgRNA靶向的基因就是目的候选基因，则为positive selection，否则为negative selection。

①筛选炭疽毒素使细胞中毒所必需的宿主基因

由于毒素的强选择性压力，大多数细胞都会死亡，只有少量的细胞存活和增殖，这些存活的细胞内富集了大量sgRNA，而这些sgRNA靶向的基因是被敲除的，这些基因就是使细胞中毒所必需的宿主基因，正是由于这些目的基因被敲除，细胞才得以存活。

Zhou等（2014）利用敲除文库筛选，在初步确定的291个基因中成功鉴定出炭疽和白喉毒素致细胞中毒所必需的宿主基因，并通过功能验证得到了证实。

②筛选药物敏感基因

细胞若含有药物敏感基因将失去抗药性。若敲除了敏感基因，则可以存活，最终富集的sgRNA正是实验目的需要的sgRNA。

①鉴定细胞生长必需的基因

一个时间段内的连续生长，减少的细胞中往往携带靶向细胞增殖所必需基因的sgRNA。这些基因可以通过比较每个sgRNA的相对频率来找到。阴性筛选的一个重要应用是鉴定癌细胞生长所必需的基因，而这些基因可能成为治疗癌症的新靶标。

2014年，Shalem等首次利用GeCKO文库鉴定出人黑色素瘤细胞和多能干细胞存活的关键基因，研究结果与RNAi筛选结果高度一致。

②筛选药物抗性基因

若敲除了抗药性基因，细胞在药物压力下不能存活，存活的细胞内并没有敲除目的基因，最终富集的sgRNA不是目的sgRNA，需要通过与对照组比较sgRNA消耗情况（或不同时间点的sgRNA丰度）来确定目的基因。

1. 测序数据质控，去除低质量的reads，使用clean reads data进行后续分析。

2.比对分析：将测序数据中拼接reads与sgRNA 文库序列比对，并对sgRNA 文库中完全匹配的sgRNA 数目、丢失sgRNA、基尼指数等进行统计。

?Reads: Total number reads in the fastq file. (Recommended: 100~300 times the number of sgRNAs)

? Mapped: Reads that can be mapped to gRNA library

? Percentage: The percentage of mapped reads (Recommended: at least 60%)

? TotalsgRNAs: The number of sgRNAs in the library

? ZeroCounts: The number of sgRNA with 0 read counts(Recommended: no more than 1%)

? GiniIndex: The Gini Index of the read count distribution. Gini index can be used to measure the evenness of the read counts, and a smaller value means a more even distribution of the read counts. (Recommended: around 0.1 for plasmid or initial state samples, and around 0.2-0.3 for negative selection samples )

3.sgRNA 及基因的read counts 统计

CRISPR全基因组筛选的主要内容便是统计sgRNA在不同样本间的消耗和富集情况，进而推断候选基因。

4.主成分分析和样品相关性聚类分析

有助于考察样本间的相似性和差异，评估实验设计的合理性以及对后续数据分析起到一定指导作用。对于有重复的实验来说，样本同一处理不同重复应该尽可能聚在一起，若存在个别重复样本明显偏离，可以考虑剔除该样本。样品聚类还可用于判断数据处理中是否剔除了批次效应。

5.候选基因筛选

MAGeCK-RRA算法根据测序结果中sgRNA的富集情况产生对应基因位点的RRA得分，RRA得分代表基因的必要性，RRA得分越小表明其重要性越高。MAGeCK返回RRA lo value（neg|score、pos|score）检验统计显著性，并据此对基因进行了排序，按照实验目的的不同，候选基因筛选可分为正向筛选和负向筛选，筛选指标一般参考lfc（log2 fold change）和FDR（adjusted-pvalue），比如：根据lfc<-2且FDR<0.05进行负向筛选，lfc>2且FDR<0.05进行正向筛选。

6.GSEA富集分析

对CRISPR筛选得到的候选基因进行富集分析以了解基因的更多功能，同时也可以对CRISPR筛选结果进行验证，以便对潜在候选基因开展进一步研究。

参考文献：

[1]刘燕飞. 基于CRISPR/Cas9技术的HeLa细胞全基因组敲除文库的建立及初步应用[D].中国农业科学院,2020.

[2]Shalem,Ophir, et al. “Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.”Science, vol. 343, no. 6166, 2014, pp. 84–87.

[3]Zhou, Yuexin, et al. “High-Throughput Screening of a CRISPR/Cas9 Library for Functional Genomics in Human Cells.” Nature, vol. 509, no. 7501, 2014, pp. 487–491.

[4]Kweon, Jiyeon, and Yongsub Kim. “High-Throughput Genetic Screens Using CRISPR-Cas9 System.” Archives of Pharmacal Research, vol. 41, no. 9, 2018, pp. 875–884.

[5]Li, Wei, et al. “Quality Control, Modeling, and Visualization of CRISPR Screens with MAGeCK-VISPR.” Genome Biology, vol. 16, no. 1, 2015, pp. 281–281.

[6]Wang, Binbin, et al. “Integrative Analysis of Pooled CRISPR Genetic Screens Using MAGeCKFlute.” Nature Protocols, vol. 14, no. 3, 2019, pp. 756–780.

本文地址:http://www.dadaojiayuan.com/jiankang/252529.html.

声明： 我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本站部分文字与图片资源来自于网络，转载是出于传递更多信息之目的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们(管理员邮箱：602607956@qq.com)，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!

上一篇: 患卵巢结核可以吃鱼肉吗

下一篇: 癌症治疗方法蕴含阿尔茨海默病治疗的新···