沈阳药大开展中药指纹图谱信息化研究

沈阳药科大学药学院孙国祥副教授、毕开顺教授、董鸿晔教授等联合申请的“中药指纹图谱在线专家系统研究”课题日前获国家自然科学基金重大研究计划面上项目资助。该项目是国家自然科学基金重大研究计划“以网络为基础的科学活动环境研究”的子课题，将建立我国自主知识产权的中药指纹图谱在线专家系统技术平台，使中药指纹图谱研究建立在网络信息高速公路上，聚合中药指纹图谱研究成果，整合分析仪器设备，开发服务资源以节约人力、物力，避免重复性研究，提升中药现代化速度。

该项目具体完成的指标是：中药HPLC指纹图谱在线专家系统；中药气相色谱指纹图谱在线专家系统；中药HPCE指纹图谱在线专家系统；中药TLC指纹图谱在线专家系统；中药光谱指纹图谱在线专家系统；中药X射线衍射指纹图谱在线专家系统；中药DNA指纹图谱在线专家系统和中药GAP基地在线专家系统的研究。

目前，孙国祥副教授和毕开顺教授等已开发出“中药指纹图谱超信息特征数字化评价系统”软件，初步解决了中药指纹图谱定性评价和定量评价的关键性技术，并且他们所承担的艾迪注射液、复方苦参注射液、射干抗病毒注射液、清热解毒注射液指纹图谱研究和中药指纹图谱相似度评价软件等课题，已经顺利通过国家药典委员会中药注射剂指纹图谱研究项目验收工作，为率先进入中药指纹图谱信息化研究领域奠定了坚实的基础。

中药指纹图谱的构建方法

目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和高效毛细管电泳法（HPCE）等色谱法以及紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC— MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。
1 薄层色谱法（TLC） 薄层色谱具有选用范围广,重现性好等优点，常用于中药各种成分的鉴别。用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更好的指纹鉴别意义。但由于受薄层板的质量和开放式层析系统等外界因素的影响，易引起一定的实验误差。
2 气相色谱法 (GC) 气相色谱是封闭性色谱，受外界影响较少，具有高性能、高选择性、高灵敏度等优点，适合于药材及制剂中挥发性成分指纹图谱的研究。一般使用质量型检测器-氢火焰离子化检测器（FID）。钱浩泉等[5]用气相色谱法建立了高良姜及其边缘植物挥发油成分的指纹图谱。具体应用中多与质谱联用，不仅具有 GC 的高分离效能，而且兼备了质谱鉴定的高灵敏度和准确性。
3 高效液相色谱法 (HPLC) 高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法应用范围更广，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。在考察条件时，要对指标成分和非指标成分都予以考虑，由于药材中各种成分的吸收波长及对不同检测器的响应不同，在构建指纹图谱时也需要加以考虑。实际应用中多使用多种联用技术，充分利用各检测器的互补性，从不同角度反映药材及制剂的全貌，从各种图谱中得到结构信息。
4 高速逆流色谱法 (HSCCC) 它是目前国际上较新型的液－液分配色谱技术，利用相对移动的两种互不相溶溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的组分分离。已有报道[6]将 HSCCC应用于生物碱、黄酮、木脂素、蒽醌等天然产物的分离分析。具有分离效率高，溶剂用量少，无吸附，样品回收率高,重现性好和适用范围广等优点。
5 高效毛细管电泳法 (HPCE) 高效毛细管电泳技术是以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现高效快速分离的新型电泳技术。毛细管电泳的广泛应用取决于其多变的分离模式，几乎涉及分析化学中所有的分离对象，小到无机离子，大到蛋白质和高分子聚合物，也能够分析不带电荷的中性物质[7]。具有所需样品少、溶剂消耗少、抗污染能力强、可直接分析水溶液等优点。其中毛细管区带电泳 (CZE) 和胶束电动毛细管电泳色谱 (MECC) 是中草药分析中最常见的两种模式。但该方法的重现性有待提高。
6 紫外可见光谱 (UV) 紫外可见光谱反映不同化学物质的电子共扼体系特征，具有加和性，对于混合物的鉴别专属性差，分辨率低，故紫外光谱很少用于指纹图谱的构建。
7 红外光谱和近红外光谱 (IR) 红外光谱是由分子的振动－转动能级跃迁产生的光谱，红外光谱具有高度的特征性。近红外光谱法在中药质量控制方面有较好的应用前景。
8 核磁共振法 (NMR) 从纯有机化合物的核磁共振氢谱上可获得结构信息，包括各类质子的化学位移、数量核偶合关系。核磁共振谱具有高度的重现性和特征性，易于解析和进一步研究，可评价药材和中成药质量的均一性和稳定性。
9 质谱法 (MS) 将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取液中化学成分的质谱指纹谱，不同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步，裂解碎片峰不一致，可供鉴别。
10 X射线衍射法 物质被X射线照射可产生不同程度的衍射现象，只要某一混合物的组成是恒定的，其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。该法具有图谱指纹专属性强，信息量大,所需样品量小等诸多优点，X射线衍射法在动物类药材鉴定与辨别中有独特的优势[8]。
11 分子生物学法 (DNA) 利用聚合酶链反应从不同生物样品中人工合成 DNA片断，而这种 DNA片断的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为 DNA指纹图谱。该技术具有重复性好、灵敏度高的优点。限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）是最常用的构建 DNA指纹图谱的方法，但该法费时费力，应用受到限制。随机扩增多态 DNA（RAPD）标记，可以在特异 DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。 罗志勇等[9]采用 RFLP技术,分析了人参、西洋参基因 DNA指纹图谱。

指纹图谱的技术

如前所述，中药指纹图谱的研究以反映中药的整体化学特征为立论依据，提出以解决两个关键技术为突破口，实现指纹图谱技术在中药质量控制方面的应用。它的特色主要表现在三个方面：1、用规范化的程序获得中药特征性总成分提取物，并用1HNMR、HPLC、UV、IR等多种手段表征其组成和结构。不同的表征手段间的区别主要表现在所得到的信息多少不同和操作上的方便程度不同。同此，核心的问题在于这种特征性总成分提取物要有真正的特征性，它的组成和结构要能真正代表这种中药。
2、由于同时采用多种检测手段来表征中药特征总提物的结构和相对组成方式，因此，方便了各部门在质量控制方面可以根据自己的实际情况选择应用。其中，由于1HNMR具有操作简便、快速、检测成本低、重现性好和信息量大等优点，更是中药指纹图谱研究的主要特色之一。
3、中药指纹图谱的解析研究以及中药特征总提物和各单体成分的生理活性研究体现了这一技术的科学性。
中药指纹图谱的研究将近代分离手段和仪器分析技术应用于中药的质量控制，目的在于建立一种新的质量控制方法，因此，是一种具有创新性的研究工作。另外，每种中药指纹图谱的建立和对其进行的解析也均具有显著的创新性。

中药指纹图谱的不足之处

在实际应用中，中药指纹图谱还面临许多问题，主要有四点：一是中药来源的混乱无序，指纹图谱研究首先需要解决这个源头问题。中药材作为一种天然产物，受品种、产地、生长环境、种植管理、采收期、炮制加工方法等多种因素影响，难以控制，不同药材其指纹图谱有一定的差异，不利于指纹图谱的应用。因此在制定标准指纹图谱时，所选取的药材来源及成药的工艺应相对稳定，有足够的代表性，同时保证质量，才能保持标准指纹图谱的先进性和代表性；二是新技术的应用还不够前沿，对于中药这样一个复杂体系，需要解决分离与检测两大问题，而采用单一分离模式勉为其难，采用传统的检测手段或单一联用技术也易丢失大量信息；三是由于实验室条件，仪器设备的不同造成指纹图谱差异，从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、规范化程度不够，影响实验室之间的重现性，难以推广。应在实验条件和仪器进行规范的条件下建立“标准图谱”；四是对大量信息的化学计量处理方法还不够完善，指纹图谱的特征性不够明确具体，指纹图谱与药理作用的相关性缺乏研究。在药理方面，隋因等用血清指纹图谱研究红花对豚鼠离体心脏的作用，为研究中药复方有效化学成分与药理学之间的联系，提供了思路。

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