美发现肺癌化疗药物产生耐药性机制

美发现肺癌化疗药物产生耐药性机制

据中国医药报讯 美国约翰·霍普金斯大学的研究人员日前发现了抑制人体NRF2基因等“脱毒”基因、进而导致肺癌化疗抗性的机制。这项研究的结果刊登在10月3日出版的《公共科学图书馆·医学》(PLoSMedicine)杂志上。

约翰·霍普金斯Bloomberg公共卫生学院和Kimmel癌症中心的助理教授Shyam Biswal博士等人发现，由NRF2基因编码的产物通常能够保护细胞不受环境污染物如香烟烟雾和油烟侵害，它能吸收并将这些物质“泵”出细胞。它还能促使细胞排出有害化合物。另外一个被称为KEAP1的基因编码的产物能够中止这种清理过程。但是肺癌细胞能破坏后者的表达，从而产生抵抗化疗药物攻击肿瘤细胞的作用。

这项研究探索了肺癌细胞如何破坏KEAP1的表达来帮助肿瘤细胞逃避化疗药物对其攻击的过程。他们发现，NRF2基因能够编码一种启动蛋白质——它能启动另外一些能清除毒素的蛋白质和酶的制造。为了中止脱毒过程，由KEAP1基因编码的蛋白质能够与NRF2基因制造的这种启动蛋白质结合，并将它们标记成需要摧毁的蛋白质。在肺癌细胞中，NRF2基因的活性异常活跃，它能将所有细胞毒素清除掉，包括化疗药物。Biswal表示，抑制NRF2基因的活性可能改善现有化疗药物的疗效，尤其是广泛用于治疗肺癌的含铂化合物。

在Biswal的研究中，6个肺癌细胞系和54个非小细胞肺癌患者组织样本中的10个样本都携带突变的KEAP1基因。这种突变使该基因失活，使其无法控制NRF2基因产生的脱毒过程。另外，其中一半的组织样本中丢失了KEAP1基因的一个拷贝，而这些患者的正常肺脏组织中没有出现基因拷贝的丢失或突变。NRF2的活性和它编码的“清毒”蛋白和酶的活性在肿瘤样本中要比正常的细胞中高。细胞培养检测也显示，携带突变的KEAP1基因的癌细胞对化疗药物的抵抗性比正常肺细胞的要强。而携带正常KEAP1基因的肿瘤样本也表现出NRF2基因表达增强了，这表明了存在分解KEAP1基因的其他途径，如对该基因进行拼接来产生较短的、无活性的蛋白质。

接下来，研究人员打算在更大的样本分析试验中验证这些发现，然后筛选合适的抗癌新药物。

肿瘤细胞对产生烷化剂耐药性的可能机制有

【答案】：A、B、C、D、E
本题考查烷化剂的作用特点。肿瘤细胞对此类药的耐药性产生，是由于自身DNA修复功能、限制化疗药进入细胞、增加化疗药从细胞中排出、细胞内灭活药物和DNA受损后缺乏细胞凋亡机制等原因所致。故正确答案为ABCDE。

如何构建耐药细胞株？

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是肿瘤治疗失败的重要因素之一，成为目前阻碍肿瘤治疗的绊脚石。因此，探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点和难点。

肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程，它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科，这就决定了肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制是复杂的，因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。

一种药物长期作用于某类细胞，杀死其中没有抗性的细胞，而对这类细胞中具有抗性的细胞不能杀死，即进行了选择。具有抗性的细胞大量繁殖产生很多抗性后代，但再用这种药物时表现出的药效大大下降的现象就是细胞的耐药性，采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对特定药物产生耐药性，从而构建出对特定药物产生耐药性的肿瘤细胞株。

细胞与低剂量的药物长期接触，引起细胞本身药物化学过程的改变，细胞膜上出现Pgp糖蛋白，使细胞逐渐对药物耐受，随着药物浓度的递增，其耐受程度逐渐加强。

耐药细胞株构建方法

A.检测亲本细胞株的IC50

IC50(half maximal inhibitory concentration),即半抑制浓度,指某一种物质对某些生物程序抑制达到50%抑制效果时的浓度。对细胞增殖方面,可以理解为对细胞增殖的抑制效果达到细胞正常增殖水平50%时的药物浓度。通常用IC50来衡量药物对细胞的毒性或者细胞对药物的耐受能力,在药物实验中,常用IC50来评估实验中使用的药物浓度。IC50的计算方法很多,常用的有Excel、graphpad prism、SPSS等。

B.药物浓度递增法/大剂量药物冲击法

1) 大剂量药物冲击法： 将处于对数生长期的肿瘤细胞（汇合度60%-80%）置于含有浓度的药物浓度的培养液中培养，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基，常规培养，待细胞恢复生长，培养一段时间后重复上述操作，将筛选出的细胞在一定浓度的药物浓度培养液中继续培养依这样不断改变作用时间，共经过1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10个作用时间段，约6-8个月的培养，最终使得细胞能够在一定浓度的药物的培养液中持续稳定生长并传代，然后脱药培养1个月在检测细胞的生物特性及耐药指标。

大剂量药物冲击法优点是与临床上大剂量化疗药物冲击的治疗方式相接近，但是缺点在于大剂量药物冲击法的药物浓度很高，细胞培养由于外环境骤变，细胞可能难以耐受，细胞状态较难控制，且耐药性能不稳定。

2) 药物浓度递增法： 取处于对数生长期的肿瘤细胞（汇合度60%-80%），加入起始浓度为低浓度（建议为亲本细胞株的IC50的1/10-1/5）的药物作用24h，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物培养基，细胞恢复生长后，消化传代复以低浓度作用细胞24h，待细胞增殖至正常形态后，重复上述药物冲击，每种浓度冲击6-8次。待细胞在此浓度稳定生长后，提高药物浓度继续培养，药物依次递增浓度加药。药物诱导历时6-8个月，直到细胞能够在浓度的药物中稳定生长。

药物浓度递增法优点在于诱导耐药细胞的药物剂量循序渐进，细胞培养的外环境逐渐改变，细胞较易耐受，状态较好，缺点在于诱导耐药过程耗时很长，且其化疗药物的作用方式与临床上化疗药物大剂量短疗程的化疗原则存在一定的差异；

C.检测耐药细胞株的IC50　 　

检测耐药细胞株的IC50，根据IC50值计算出耐药指数（resistanceindex, RI），RI=耐药细胞系的IC50/亲代细胞系的IC50，RI>5则认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。

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