巨噬细胞泡沫化抑制剂研究快步进行

巨噬细胞泡沫化抑制剂研究快步进行

动脉粥样硬化（AS）是一个复杂的病理生理过程，由动脉管壁上胆固醇累积的斑块形成引起。胆固醇酯蓄积的巨噬细胞（泡沫细胞）是早期动脉粥样硬化斑块的主要组成和特征。它通过其细胞表面的多种受体无限制地摄取变性（氧化的或乙酰化）的低密度脂蛋白(LDL)颗粒及其他配体，结果在巨噬细胞内有大量的胆固醇酯和甘油三酯蓄积，使巨噬细胞发展成为泡沫细胞。因此，通过各种途径抑制这种在巨噬细胞的过量脂质蓄积，可以起到预防和治疗动脉粥样硬化的作用。而通过各种途径抑制泡沫细胞形成的各个环节以预防AS，受到研究人员广泛的关注。目前，巨噬细胞泡沫化抑制剂的研究也在快速进行之中，以期能在防治AS上产生突破性的进展。

抗氧化剂 已有许多证据说明，LDL被氧化后转变为氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），这种ox-LDL与AS有关。当LDL在血液中蓄积时，被不明因素氧化，巨噬细胞对这种ox-LDL有极强的亲和力且能无休止地摄取，导致巨噬细胞泡沫化。

20世纪70年代初普罗布考（probucol）作为降胆固醇药引入临床，后来却意外发现它能阻止AS的发生和发展。究其原因，主要是它的抗氧化作用——可以防止ox-LDL的形成。其他一些天然的抗氧化剂包括β-胡萝卜素、番茄红素、维生素E、红酒中的类黄酮、甘草等等，也在进一步研究中。最近，国外研究发现了一种具有抗AS作用的磷脂相关酶——血小板活化因子-乙酰水解酶(PAF-AH)。PAF-AH由巨噬细胞产生，并和脂蛋白结合存在于血浆中。研究表明：发生AS时，血浆PAF-AH的活性改变。除了分解血小板活化因子(PAF)，血浆PAF-AH蛋白还能够结合到所有的脂蛋白，防止发生氧化作用。一方面，PAF-AH阻止高密度脂蛋白（HDL）的氧化，从而加强了HDL防止LDL脂质过氧化的抗AS作用；另一方面，PAF-AH也阻止了LDL发生氧化。

ACAT抑制剂 脂酰辅酶A胆固醇酯酰转移酶(ACAT)催化胆固醇的3位羟基，由长链酯酰辅酶A将酯酰基转入后，生成胆固醇酯的酶，它在胆固醇的代谢中起重要作用。由于ACAT抑制剂与巨噬细胞泡沫化过程直接相关，间接和直接对抗AS，因而具有强大的发展潜力。

研究表明：抑制体内的ACAT，可减少食物中的胆固醇及随胆汁排泄的胆固醇在小肠的吸收，减少肝中胆固醇酯的生成及极低密度脂蛋白的分泌，有效降低血浆胆固醇及LDL水平，并且直接抑制斑块中巨噬细胞泡沫化过程。同时，ACAT抑制剂并不降低血浆胆固醇水平。目前从结构上看，ACAT抑制剂主要包含两类化合物：一类是酰胺类，如日本住友株式会社研究开发的新药Molinamide和山道士公司研究开发的50-035；另一类是脲类，如美国氰胺公司研究开发的CL-277032和CL-283546。此外，还有苯基咪唑类等其他类型。

激素敏感脂肪酶（HSL） 在泡沫细胞中，ACAT和中性胆固醇酯水解酶共同调节胆固醇酯的形成，除了抑制ACAT的活性外，还可通过阻止胆固醇酯的合成或刺激胆固醇酯的水解来减少泡沫细胞中胆固醇酯的积累。实验证明，用孕酮抑制A-CAT的活性，可以促进小鼠腹膜泡沫细胞中胆固醇酯的水解。而且，自由胆固醇的胞外受体如HDL可通过刺激自由胆固醇的转运而促进胆固醇酯的水解。

国外有研究人员将小鼠巨噬细胞链中胆固醇酯的水解活性归结于HSL的作用。而另有研究证明，泡沫细胞中HSL mRNA的低水平表达和细胞质中性胆固醇酯水解酶（NCEH）的活力降低同时存在，因而推测低水平表达的HSL可能部分导致了NC-EH的活力减低，说明HSL在胆固醇代谢中的作用。过量表达的HSL可以在很大程度上阻止泡沫细胞内胆固醇酯的聚集。而在ACAT抑制剂同时存在时，相比于对照组，HSL的过量表达可以将泡沫细胞中胆固醇酯的水解速度提高2~3倍，导致细胞内胆固醇酯的快速耗尽。因此，巨噬细胞中HSL的过量表达或者有ACAT抑制剂的同时存在，可以阻止AS斑块泡沫细胞内胆固醇酯的积聚。

LXR/RXR活化剂 肝X受体/视黄醇类X受体（LXR/RXR）是核受体，其转录因子直接调控胆固醇转运途径中多种基因的转录，ATP结合的转运盒A1(ABCA1)基因就是LXR/RXR调控基因之一。ABCA1是一种较大的膜蛋白，可促进磷脂和胆固醇转运到HDL，形成前β-HDL微粒。

由于核受体LXR/RXR调控多种细胞内胆固醇及脂肪酸的代谢，激活这些受体可促进巨噬细胞内胆固醇的外流、肝脏中胆汁酸的合成和阻止小肠中胆固醇的吸收。国外研究发现，用RXR激活剂LG100364处理载脂蛋白E和低密度脂蛋白受体缺失的小鼠时，ABCA1mRNA表达增加，促进了胆固醇流入载脂蛋白A-I。而且，用LXR活化剂来处理载脂蛋白E敲除的小鼠时，在AS斑块内，ABCA1和ATP结合的转运盒G1(ABCG1)mRNA的表达均增加。因此认为，LXR/RXR可调控全身的胆固醇清除过程，激活LXR信号途径能上调巨噬细胞内AB鄄CA1基因的表达，通过HDL将胆固醇转运进入肝脏，并减少胆固醇的吸收，从而抑制巨噬细胞泡沫化过程。

PPARγ抑制剂 泡沫细胞中，脂肪细胞脂质结合蛋白（ALBP）基因和环氧酶增生激活受体γ（PPARγ）均呈高表达，通过巨噬细胞清道夫受体介导的无限制摄取ox-LDL可刺激PPARγ基因表达。ALBP基因是核受体PPARγ的调控基因之一，ALBP的过量表达会加速胆固醇酯的累积，从而促进泡沫细胞的形成，因此，PPA-Rγ抑制剂的研究也是一个有效预防泡沫细胞产生的方法。

相关基因的研究 载脂蛋白E具有多种生理功能，对血浆脂蛋白的清除具有重要作用。在泡沫细胞形成早期，动脉血管壁上巨噬细胞载脂蛋白E的分泌还可以抑制巨噬细胞泡沫化的发展，因此，通过载脂蛋白E转基因在动脉血管巨噬细胞上的表达是一条有效的抑制途径。

此外，巨噬细胞清道夫受体也是泡沫化过程的一个重要靶点。MSRAI/AII是导致泡沫细胞形成的主要受体之一。最近，国外研究人员构建了一个分泌型三聚体融合蛋白，包含人MSRAI细胞外部分。此分泌型三聚体融合蛋白是跨膜受体，并且和MSR具有相同的胞外部分，可以竞争性地结合ox-LDL颗粒及其他配体，从而阻止这些配体结合到人MSR上。

另一类巨噬细胞清道夫受体MSR-B包括MSR-BI和CD36，在泡沫化的形成过程中也有重要的作用。MSR-BI是一种选择性摄取受体，能选择性地摄取HDL胆固醇酯。此外，MSR-B可阻碍游离胆固醇和胆固醇酯在动脉壁的聚集，因而有抗泡沫化形成作用。CD36是另一个MSR-B亚型，研究表明，CD36缺乏的小鼠，动脉斑块的面积减少了70%～80%，其巨噬细胞摄取的氧化LDL减少了50%，不易形成泡沫细胞，因此认为，CD36参与了泡沫细胞的形成过程。虽然尚未有关于这两种清道夫受体的应用的报道，MSR-BI和CD36无疑具有潜在的发展前景。

2021-02-21--文献阅读--人食管鳞癌微环境中的免疫抑制景观

单细胞测序分析CD45+的细胞（免疫细胞）→利用经典标记对免疫细胞注释，研究免疫细胞的成分差异→阐明免疫细胞改变的分子机制→研究免疫细胞TCR序列的变化，克隆性，说明起源问题→研究髓系细胞，TAMs（肿瘤相关巨噬细胞），WCGNA研究细胞分子特征→细胞间相互作用（scTHI）

我们获得了一个详细的单细胞分辨率的食管鳞状细胞癌（ESCC）免疫细胞图谱。阐述了哪些免疫细胞处于休眠状态，哪些免疫细胞处于增值状态，以及这些细胞与免疫抑制之间的关系。

①食管癌在组织学上可分为两个亚型：腺癌（EAC）和鳞状细胞癌（ESCC）。食管鳞癌是食管癌的主要亚型，约占全世界食管癌的90%
②最近，PD-1抗体用于晚期食管癌一线化疗失败的患者显示，与化疗相比，总体生存率只有中度的改善。
③我们用高维（high-dimensional）scRNA序列分析了从七个切除的食管鳞癌肿瘤及其邻近组织中分离的总免疫细胞。同时进行T细胞受体（TCR）测序，以获得T细胞克隆性的信息
④相较于癌旁正常组织，肿瘤组织T细胞明显扩增。
⑤我们在这些肿瘤中发现了耗尽的T细胞、耗尽的NK细胞、调节性T（Treg）细胞、交替激活的巨噬细胞（M2）和耐受性树突状细胞（tDCs），表明ESCC中 存在炎症但免疫抑制的TME 。
⑥我们鉴定出了一个与预后相关的基因集

①我们分析了从7对新鲜、手术切除的肿瘤和ESCC邻近组织中分离出CD45+细胞进行单细胞测序。过滤后，共80787个细胞（每个样品3248-9078），中位基因数1170个。
②我们将所有样本的单细胞数据进行标准化和汇总，并进行无监督聚类以识别可区分的群体，用的是Seuratv3.0
③我们利用典型标记对这些细胞进行了注释；这些细胞类型的经典标记物的表达与注释一致

④我们发现肿瘤中的t细胞和单核/巨噬细胞增多。与此相反，B细胞和NK细胞的百分率降低

（S133、S134和S150）--在这些肿瘤中，T细胞所占的比例不到总细胞的2%。
（S135、S149、S158、S159）--这些肿瘤中，免疫谱在PCA中呈现显著变化，其中6–12%的细胞是T细胞。

①T细胞和NK细胞是TME中主要的细胞毒性免疫细胞，我们对来自所有样本的T细胞和NK细胞进行无监督聚类，我们鉴定了6个CD4 T细胞簇，7个CD8 T细胞簇，1个CD4和CD8双阴性T细胞簇和3个NK细胞簇

②在T细胞中，我们使用已知的功能性标记来提示CD4 T细胞群，包括天真、记忆、效应、耗尽的T细胞和Tregs。这些标记物还鉴定了CD8T细胞群，包括记忆、效应、细胞毒性和耗尽的T细胞。

④我们进一步分析了与GFBP2、LAG3和FOXP37表达高度相关的基因。前50个基因用于细胞毒性、衰竭和Treg的分配。然后我们使用这些特征分析T细胞簇，发现富集分数与公布的特征一致。
⑤CD4群体中存在着谱系联系，exhaustion和Treg评分的可视化证实了这两个簇之间的重叠
⑥细胞毒性和耗尽的CD8 T细胞都表达许多效应分子，如GnY和GZMH，而耗尽的DCD8 T细胞表达的IFNG水平高于细胞毒性细胞（图2f），这表明耗尽的T细胞仍表达高水平的某些效应分子并试图对肿瘤细胞作出反应；
这些结果提示CD8-C5-CCL5处于衰竭早期，CD8-C7-TIGIT处于衰竭期，CD8-C6-STMN1可能是CD8-C5-CCL5与CD8-C7-TIGIT的过渡期。

①我们比较了肿瘤和邻近组织中的T细胞簇。CD45+细胞中的 （Treg cluster CD4-C6-FOXP3） and （exhausted CD4 T cells CD4-C5-STMN1 ）的百分比与匹配的邻近组织相比显著增加；
流式细胞术也证实了在ESCC肿瘤中Tregs的富集。
同样，耗尽的cd8t细胞在肿瘤中富集。

②在ESCC中，PD1在CD8 T细胞中的表达一直较高（图3f）。肿瘤组织中Tregs和耗尽的DCD4和CD8 T细胞显著增加表明存在免疫抑制环境
③我们还观察到，与匹配的邻近组织相比，肿瘤组织中的NK细胞显著减少；
NK-C1-NCR3表达高水平的NCR3、CD266、NKG7和LAMP1（图3h）。
相反，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1簇高水平表达KLRC1和ITGA1抑制性受体（图3h）。
流式细胞术分析证实，与邻近组织相比，ESCC中NKG2A（KLRC1）在NK细胞中的表达增加（图3i）。事实上，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1的细胞毒性分数极低；相反，衰竭分数升高（图3j），这表明在ESCC中NK细胞不足，功能受损

①根据TCR结果我们共观察到15654个独特的tcr序列。观察到克隆扩展，克隆大小从2到2600（图4a）。
如预期的那样，患者之间没有发现共享克隆。与其他癌症类型的研究一致，大多数TCR是独特的。然而，TCR基因型的组成在患者中是高度可变的

②S149和S150肿瘤中有65%和68%的T细胞具有两个以上细胞共用的TCR，这表明这些肿瘤中T细胞的高度克隆性扩增（图4b）。与匹配的邻近组织相比，7名患者的肿瘤中有4人的扩增克隆数增加。

④CD8 T细胞的克隆性细胞明显多于CD4 T细胞，并且幼稚的CD4-C1-CCR7簇显示出非常有限的克隆性扩增（图4d）。
⑤CD8-C1-NKG7是CD8 T细胞中的细胞毒性簇，在邻近组织中具有较高的频率，在邻近组织中也显示出比肿瘤组织中更高的克隆扩增（图4e）。

⑥然而，与邻近组织相比，肿瘤中的Tregs克隆数增加（图4f），这表明特异性克隆细胞的扩张可能是肿瘤中Tregs高百分比的原因。
⑦我们在CD4细胞的所有簇（包括Tregs）和CD8细胞的所有簇（C2除外）中发现了TCR序列的共享（图4g，h）
⑧CD8-C7-TIGIT与CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1共有的克隆数分别为166（9.0%）和156（8.4%）（图4i）。
⑨Treg簇CD4-C6-FOXP3在肿瘤中也有相同的趋势，与CD4-C1-CCR7共有的克隆型占14.4%，在邻近组织中占40.7%（图4j和补充图8c）

①接下来，我们对髓系细胞进行无监督聚类。十四个簇被鉴定，包括9簇单细胞/巨噬细胞和5簇树突状细胞（图5a）。
②利用已发表的信号特征：单核细胞（Mono）、经典活化巨噬细胞（M1）、交替活化巨噬细胞（M2）和髓源性抑制细胞（MDSCs）；
③我们使用Monocle，一种无监督的推断方法，来构建细胞转化的潜在发展轨迹。另一种算法Slingshot的结果（s9b）；
巨噬细胞中M1和M2信号之间的显著相关性（补充图。9c），表明ESCC中存在一个复杂的巨噬细胞极化过程，这与其他研究一致
Mono-C1-VCAN显示出强大的单核细胞信号（图5b）。

④我们用wgcna对单核/巨噬细胞进行加权相关网络分析
我们发现绿松石模块与单核细胞簇、单核细胞C1-VCAN和单核细胞C2-IL1B正相关，与M2簇宏C3-CSF1和MDSC簇MDSC-C1-C1QC、MDSC-C2-APOE负相关（图5d，e）;我们进一步分析了这个模块中的基因以及它们与Mono-C1-VCAN的关联（图5f），以选择最相关的前50个基因，形成一个特征集；
有趣的是，这一特征与ESCC（图5g）以及宫颈鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌（补充图9g）的高无进展生存率密切相关，这表明这一特征可作为ESCC和其他组织鳞状细胞癌的预后生物标志物。

①五个DC簇表达热图（图6a）;DC-C3-LAMP3癌旁组织中富集（图6b）。

②发现LAMP3+DC与其他树突状细胞亚群相比具有更高的活性和迁移能力，同时其还富集到了耐受性特征（图6c）

④流式显示：LAMP3+DC表达的CD83、CCR7和PDL1明显高于LAMP3 DC（图6e，f）、提示LAMP3+DCs的成熟、迁移和调控能力。
⑤多色ihc染色也证实了肿瘤组织中CD11C+LAMP3+PDL1+IDO+DCs的存在（图6g）。
⑥我们进一步用IFNγ和LPS治疗dc。有趣的是，我们发现IFNγ和lps刺激诱导dc表达PDL1和IDO（图6h）；
当DCs与CD4+CD45RA+幼稚T细胞共培养时，诱导FOXP3表达的能力增强（图6i）。
提示IFNγ和LPS可能在体外诱导耐受性DCs

①我们基于已知配体-受体对在任何两种肿瘤浸润性免疫细胞中的共同表达，对潜在的细胞-细胞相互作用进行了系统分析
scTHI--另一种广泛使用的方法--分析巨噬细胞和Tregs的相互作用
②我们发现巨噬细胞和Tregs之间TNF-TNFSF1B、CCL4-CCR8和IL-1β-IL1R2的相互作用具有较高的相互作用得分，并且Tregs在肿瘤中表达高水平的TNFSF1B、CCR8和IL1R2（图7a–c）

③肿瘤中分离的树突状细胞中IL1R2的表达高于癌旁组织，多色IHC也证实了IL1R2在Tregs中的表达。（图7d）

通过scrna-seq分析巨噬细胞中LILRB1的表达，并通过FACS进一步验证。我们发现，与邻近组织相比，ESCC中巨噬细胞中LILRB1的表达增加（图7h，i和补充图7）。

①在这里，我们结合了深链RNA序列和TCR序列，并阐明了整个免疫景观，包括ESCC和邻近组织中固有的和适应性的免疫细胞图谱；描述了ESCC免疫细胞的分类、比例、功能变化及机制、细胞间相互作用
②ESCC富含免疫抑制细胞：Tregs, exhausted CD8 T,CD4 T and NK cells, M2 macrophages, and tDCs；促进免疫逃避和肿瘤进展
③我们证明耗尽的CD4、CD8 T细胞和NK细胞是主要的肿瘤内增殖免疫细胞室，尽管这些细胞富含耗尽基因。
与耗尽簇（CD8-C7-TIGIT）相比，预耗尽簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1可能是更好的免疫治疗靶点，因为耗尽簇处于永久性和不易逆转的耗尽阶段，由于其表观遗传变化，使其更耐检查点抑制。
④发现肿瘤浸润的NK细胞不仅在ESCC中普遍减少，而且还表达高水平的检查点分子，包括NKG2A和CD49d，提示处于耗尽状态；据报道，抗NKG2A和抗CD49d是促进抗肿瘤活性的检查点抑制剂
⑤T细胞的TCR序列共享，提示T细胞启动后有着广泛的分化。
⑥衰竭的CD8 T细胞（CD8-C7-TIGIT）与其他CD8簇具有更高比例的共享克隆，尤其是衰竭前簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1，这与这些簇的相关状态和多步衰竭假说相一致。
相反，CD8-C1-NKG7是细胞毒性最强的CD8 T细胞簇，在肿瘤中克隆性T细胞明显减少
最近在膀胱癌中也有类似的发现，细胞毒性cd8t细胞（FGFBP2+clusterin）在正常组织中的克隆性比在膀胱癌中的克隆性强。
另一方面，食管细胞毒性细胞的克隆扩增可能是由于食管中的非肿瘤抗原的偶然暴露，并且相邻组织中的大多数CD8-C1-NKG7细胞表达低水平的CD39，这表明它们是旁观者CD8 T细胞。
幼稚的CD8 T细胞可能不常渗入食管或被局部环境激活，因此不太可能被检测为独立的群体。
⑦单核细胞/巨噬细胞在肿瘤中的关键作用已经在肝癌、乳腺癌和肺癌中用scRNA-seq进行了描述；
通常，巨噬细胞的活化分为炎症前M1状态或与炎症溶解相关的M2状态；
我们的分析显示单核细胞/巨噬细胞存在于单核细胞、M1和M2状态的光谱中；M1相关基因和M2相关基因经常在同一细胞中共同表达；M1和M2信号的共存表明TAMs比经典的M1/M2模型更复杂，这种现象在乳腺癌和肝癌中也有发现
当使用WGCNA分析单核/巨噬细胞的基因相关性时，我们发现一组基因与单核细胞呈正相关，在ESCC和其它类似的病理类型肿瘤有着较好的预测预后能力
⑧cDC2特别参与MHCⅡ类介导的抗原提呈和cd4t的活化和扩增细胞.cDC1也是抗肿瘤免疫所必需的。最近，一些文献报道了TME中的DCs，发现大多数与我们的数据一致。
比较了不同癌肿之间的这种差异，对分析出来的细胞做了些功能分析。
⑨我们的工作进一步证实了树突状细胞与巨噬细胞之间的相互作用；
在Treg上表达的IL1R2可能通过阻断IL1β依赖性效应T细胞的活化而增强Treg的功能;
IL1R2在活化的肿瘤树突状细胞上表达，并与肺腺癌的预后不良相关。
我们的研究还表明，Tregs可能通过hhla-A、B、C和LILRB1相互作用调节巨噬细胞的功能。
研究TAMs中这种免疫抑制MHC类I-LILRB1信号轴的机制将有助于开发恢复巨噬细胞功能的疗法。
总之，我们的ESCC和邻近组织免疫细胞的转录图谱提供了一个了解免疫状态的框架，并揭示了ESCC环境中免疫细胞的动态特性。此外，我们还从多个方面阐述了食管鳞癌的免疫抑制状态，这些都是食管鳞癌及其他癌症免疫治疗的潜在新靶点

TCR测序方法简介
TCR测序干货
WGCNA

非因推荐 | 肿瘤微环境研究大剖析——肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤微环境研究大剖析——肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤免疫微环境是肿瘤与宿主免疫系统之间竞争博弈的主战场，肿瘤微环境（TME）中各种细胞之间的相互作用造成免疫细胞具有依赖于TME的双重作用，并决定肿瘤相关免疫反应的结果——即免疫系统对肿瘤细胞的攻击或耐受。

肿瘤内的免疫细胞包括介导适应性免疫反应的细胞（如T细胞、B细胞等），以及介导天然免疫反应的效应细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞等），而肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 是肿瘤微环境研究中最为热门的免疫细胞亚群。越来越多的研究表明TAM具有支持肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列促进肿瘤发展的功能，与肿瘤患者的不良预后呈高度相关性。由不同巨噬细胞表型定义的亚型（M1促炎型和M2型抗炎型），与肿瘤预后的关联也有着广泛的研究，在结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌食管癌、乳腺癌、胰腺癌等癌种中，均有大量研究报道，并证实两个亚型在预后关联上的负相关性。然而如何精准的找出不同组间TAM的表达谱差异、诠释机理并结合现有的免疫疗法，实现冷热肿瘤的转换将成为抗肿瘤治疗的研究新方向。

巨噬细胞广泛分布于各种组织中。通过对不同组间巨噬细胞表达谱的对比，存在于特定组织中的巨噬细胞按其组织位置可分为肝脏中的Kupffer细胞、脑中的小胶质细胞、骨组织中的破骨细胞、肺中的肺泡巨噬细胞、肾脏中的系膜细胞和淋巴中的被膜下巨噬细胞等。不同组织中的巨噬细胞具有不同的转录和表达谱。

根据表型和功能，巨噬细胞可以分为M1(促炎，经典激活的巨噬细胞)和M2(抗炎，交替激活的巨噬细胞)两种主要类型(图1)，此外还发现其他三种巨噬细胞：肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、CD169+巨噬细胞和TCR+巨噬细胞。

截止到目前的认识，TAM具有从M1到M2样表型的特殊过渡期，这意味着它们在整个肿瘤进展过程中不仅仅属于M1或M2样表型。在肿瘤起始的早期阶段，TAM在转移到M2样型之前为M1样表型。此外，必须指出，类似巨噬细胞的M2还被进一步划分为4个子类型，即M2a、b、c和d，不同子类型的标记也不同。

M1和M2型巨噬细胞标志物分类汇总

表面分子： M2型巨噬细胞表达高水平的CD206、CD163和TGFβR，而M1型巨噬细胞表达高水平的CD40、CD80和CD86。

转录因子： STAT1和STAT3在M1表型中高度激活，STAT6在M2表型中高度激活。IRF3、5和7在M1表型中被激活，而IRF4在M2表型中被激活。

细胞因子和趋化因子： 在M1型巨噬细胞检测到TNFα、IL1β和IL12等因子的高表达，在M2型巨噬细胞检测到IL10、ALOX15和CCL18等因子的高表达。在M1型巨噬细胞当中iNOS高表达，在M2型巨噬细胞当中Arginase 1高表达。

此外，初级TAM可以通过分泌CCL2、CCL5、CCL7、CXCL8和CXCL12等趋化因子招募单核细胞，在IL4、IL6、IL10、IL13以及TGFβ刺激作用下发生极化，具有类似于M2型巨噬细胞的表型，并分泌多种细胞因子（如TGFβ、IL-10等）和趋化因子(招募Th2和调节性T细胞)，介导免疫抑制效应；分泌多种细胞因子、生长因子(如EGF、VEGF、PDGF、FGF和TGFβ）、基质金属蛋白酶(MMPs)、M-CSF等分子，促进慢性炎症、血管新生、肿瘤侵袭和调节免疫反应(图2)。在这个过程中，TAM通过分泌多种因子与肿瘤微环境多种类型细胞发生相互作用和影响，并进而介导复杂的效应(图3)。

用什么方法对肿瘤微环境当中的TAM进行分析和评估呢？

我们通过一篇发表在Cancer Microenviron的研究论文，来介绍一些基础技术。文章中分三步对非小细胞肺癌(NSCLC)患者和非肿瘤患者组织中的TAM进行分析，具体如下：

首先，此研究使用免疫组织化学(IHC)来确定与同一患者的非肿瘤组织相比，非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织当中TAM表型可能发生的表型变化。分别使用CD68（通用巨噬细胞标记）、iNOS（M1）和CD163（M2）抗体测定TAM表型。

然后，作者对不同类型NSCLC患者肿瘤组织及非肿瘤组织当中CD68、iNOS及CD163阳性染色面积占比进行了统计学分析。结果表明，与非肿瘤组织相比，在所有NSCLC亚型肿瘤组织当中CD68和M2型巨噬细胞标记CD163均明显增加(P≤0.0001)。与之相对，与非肿瘤组织相比，在肺腺癌患者和鳞状癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达降低，显著性分别为P≤0.01及P≤0.05，但大细胞癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达与非肿瘤组织相比无明显差异。

接下来，作者利用多因子液相芯片技术(Bio-plex)对不同类型NSCLC患者及正常对照血清当中介导Th1型和Th2型免疫反应相关多种细胞因子进行了检测和分析。结果表明，与正常对照相比，只有大细胞肺癌患者血清当中IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的水平增加，在其他类型的NSCLC患者当中并未发现明显变化。

非因小结

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对肿瘤的生长、转移及耐药起着重要调控作用，使得TAM成为抗肿瘤转移治疗的重要靶点。TAM功能的可塑性，使它能够通过响应于肿瘤微环境的信号分子(如细胞因子、药物)而改变自身的功能状态，因此针对TAM的深入研究具有重要的科学意义和临床价值，为肿瘤的治疗开辟新的思路和途径。

非因生物的DSP空间多组学技术可以通过对TAM的精确定位来实现不同空间组定义的巨噬细胞亚群表达谱差异的分析 （图4），从而深化科研人员对肿瘤微环境的研究。非因DSP空间多组学技术通过在单张切片上选择合适的兴趣点（Region of Interest，ROI），来实现基于每个ROI微环境的100重蛋白或＞18,000重全转录组的原位表达谱分析，是针对肿瘤免疫和肿瘤微环境设计的高精度、多维度分析的新一代空间组学技术。目前已经成功开发了针对DSP蛋白组和转录组分析的TAM研究流程，欢迎各位老师前来咨询。

（该文章部分内容转自ABclonal）

Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移

前言

肝细胞癌（HCC）是世界上第五大常见癌症，以及全球癌症死亡的第五大原因。大部分HCC患者出现转移，其中肺转移的总体生存率约5.9月，无转移患者总体生存率约16.2月。肺转移在恶性肿瘤中的发病率约25%-30%，HCC患者发病率约41.6%-43.6%。

肿瘤细胞与相应微环境的相互作用以及基质细胞参与肿瘤进展的重要性。肿瘤的基质细胞有内皮细胞，纤维母细胞，肿瘤浸润的炎症细胞，这些细胞创造微环境，改善肿瘤细胞的特性，调控肿瘤的发展及对治疗的应答。研究表明，肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）可以加速肿瘤的发生、发展。巨噬细胞根据极化特性分为M1和M2型，M1型巨噬细胞能够分泌促炎症和免疫刺激因子，TAMs比较接近M2型巨噬细胞，可以激活产生Th2细胞因子。TAMs加速癌细胞转移以及癌细胞与TAMs对话的潜在机制有待进一步阐明。

外泌体是一种包含蛋白、核酸、脂质的微小囊泡，参与肿瘤微环境中不同类型细胞间的物质运输、信息传递。由于TAMs外泌体与肿瘤的研究是有限的，所以TAMs外泌体对肿瘤的发生发展和转移也需要进一步探索。

最近发表于Hepatology杂志（IF=14.679）的研究指出，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来源的外泌体介导CD11b/CD18蛋白转移到肿瘤细胞，可能增强了肝癌细胞迁移能力，为肿瘤转移机制提供新的见解。

◆ 技术路线 ◆

在这项研究中，研究人员获取120例肝癌vs. 癌旁，转移vs. 非转移临床样本，CD206、CD68在肝癌和HCC非转移组织样本中表达显著升高，且CD206、CD68高表达患者预后较差。

功能上，M2型巨噬细胞/M2型巨噬细胞条件培养基与肝癌细胞共培养，促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

PKH26染色示踪肝癌细胞吞噬外泌体效率；M2型巨噬细胞来源外泌体（M1 exos）介导肝癌细胞迁移和侵袭；GW4869（外泌体抑制剂）逆转迁移和侵袭表型。

体内实验表明，巨噬细胞来源外泌体预处理肝癌细胞，尾静脉接种到小鼠。与对照、M1 exos相比，M2 exos组肺转移显著增强；GW4869可以逆转体内肺转移表型。另外，M2 exos组总体生存时间也显著降低。M2 exos增强HCC细胞侵袭能力，可能是巨噬细胞和肝癌细胞之间的一种新的信息传递模型。

蛋白质组学测序：M2 exos 组显著上调的蛋白有：FGL2，FABP4, CD37, ITGB2 (CD18 or β2 integrin), ITGB5, and ITGAM (CD11b or αM integrin)。体内和体外研究结果表明，CD18 、CD11b在M2 exo中高表达，可通过M2 exo传递到HCC细胞；CD18 、CD11b抗体阻断后迁移和侵袭能力也下调，小鼠存活时间延长。

前期研究结果表明，在肿瘤发生的初期，MMPs降解胞外基质介导肿瘤的侵袭和转移。研究者通过WB、qPCR、ELISA实验发现M2 exo处理的肝癌细胞中MMP-9表达上调，CD18 、CD11b抗体阻断后MMP-9表达量下调；MMP抑制剂（MMPi）或联合M2 exo处理肝癌细胞，其迁移和侵袭力下降；另外MMPi处理的肝癌细胞接种小鼠，肺转移数目显著降低。

总之，本研究阐明了M2 exo传递αMβ2到肝癌细胞，激活受体细胞表达MMP9，从而促进肝癌转移。

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