靶向蛋白酶：成功、失败与前景（完）

靶向蛋白酶：成功、失败与前景（完）

许多新的蛋白酶抑制剂目前正在开发之中，至少有50种不同的蛋白酶被考虑作为潜在的靶标。许多靶标是采用动物模型确定的，尤其是啮齿动物基因敲除模型，然后用于筛选抑制剂。

肾素抑制剂治疗高血压

肾素是与激活血管紧张素原产生血管紧张素I有关的天冬氨酸蛋白酶。肾素抑制可能优于肾素-血管紧张素转化酶（ACE）抑制，因为肾素对单一底物具有特异性，因此可能引起的副作用较少。

不过，早期的肾素抑制剂是底物类似物，易于很快降解，生物利用度较低。Zankiren属于肽转换态类似物抑制剂，首次在一些动物模型中显示能改善蛋白分解的稳定性和生物利用度，并且在人体也显示很好的疗效。但是，最新一代的肾素抑制剂是非肽类的。目前，美国Speedel公司与诺华公司已经共同开发出Alkanecarboxamide Aliskiren（SPP100）。Aliskiren作为单一治疗或联合治疗药物的III期试验数据早在2005年9月就已透露，可有效阻滞肾素-血管紧张素原系统使得血压降低，安全性与终末器官保护的结果亦显示出很好效果。诺华公司已于今年4月向美国FDA递交了Aliskiren的新药申请书。

Speedel公司还从罗氏公司获得了另一个肾素研究计划。罗氏公司过去集中研究过3-烷氧基-4-芳基-哌啶及其进一步的最优化，其中一种化合物——3,4,5-三元哌啶Ro66-1132能有效地降低表达人肾素和血管紧张素原基因的双转基因工程实验鼠的血压，减轻终末器官损害。2005年10月，Speedel公司宣称，两种抑制剂（SPP630和SPP635）对上述的双转基因工程实验鼠模型的临床前研究和志愿者的微剂量试验已获成功，显示出很好的生物利用度和半衰期。SPP635在2005年10月进入I期临床试验。

DPPIV抑制剂用于2型糖尿病

2型糖尿病是一种重要的消耗性疾病，由葡萄糖动态平衡异常引起。在20世纪80年代后期，肠促胰岛素（Incretins），包括胰高血糖素样肽1（GLP1）和糖依赖性胰岛素释放肽（GIP）被确定为能降低血糖水平的激素，成为糖尿病治疗的潜在靶标。人们也发现，在试管中和体内GLP1和相关肽能迅速被丝氨酸氨基肽酶DPPIV（CD26）降解，这提示DPPIV抑制剂具有潜在的治疗价值。

最近，有一些DPPIV抑制剂处于后期临床试验之中。维格列汀（Vildagliptin，LAF237）的III期临床试验显示，患者耐受性很好，没有体重增加，血糖明显降低。今年3月，诺华公司已经递交了维格列汀的新药申请书。

目前在开发的其他DPPIV抑制剂包括默克公司的西他列汀（Sitagliptin，MK-0431）。在临床前研究中，人们发现这种非共价的可逆抑制剂能选择性地拮抗其他相关的蛋白酶，显示出良好疗效。该药2004年进入III期试验，今年2月，默克公司递交了西他列汀的新药申请书。正在研究的另一种可逆非共价抑制剂是Probiodrug公司开发的一些化合物，其中一种（P93/01）处于II期临床试验之中。此外，共价可逆的DPPIV抑制剂Saxagliptin也正在进行III期临床试验，II期临床研究显示良好的选择性和口服生物利用度。

组织蛋白酶K与骨质疏松症

组织蛋白酶K是一种溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶，主要位于破骨细胞，是涉及骨质再吸收的主要酶。最近的临床数据表明，组织蛋白酶K抑制剂优于现有的骨质疏松症治疗药物（包括二磷酸盐），因为它们不仅能防止骨质丢失，而且还允许骨再生。组织蛋白酶K抑制剂的开发较早，但非常困难，因为在涉及底物和抑制剂识别的关键残基中种类特异性变异，导致这类化合物对啮齿动物和人体中靶标的亲和力有极大的不同。鉴于人组织蛋白酶K与灵长类动物之间的高度类似，葛兰素史克公司的研究人员研究出一种猕猴模型，用于组织蛋白酶K抑制剂的实验。

现在有几种组织蛋白酶抑制剂处于临床试验之中：一种是由诺华公司开发的AAE581和AFG-495；一种是由葛兰素史克公司开发的SB-462795；另一种是由默克公司与Celeraw公司联合开发的未泄露名称的抑制剂，可能与CRA-013783化合物相似。其中最新的药物是AAE581，为一种肽腈，在试管中对人组织蛋白酶K高度特异，对组织蛋白酶K的选择性比其他组织蛋白酶大1000倍。在140例每天一次接受治疗的绝经后妇女中进行的II期临床试验表明，AAE581成功地降低了胶原的分解和骨的再吸收，未报告副作用。诺华公司最近正在为今年开始的III期临床试验征集患者。

MMP抑制剂开发新策略

开发金属蛋白酶（MMP）抑制剂治疗癌症和关节炎早期的失败意味着大多数公司对新MMP抑制剂的开发兴趣受到严重挫伤，他们开始转向靶向MMP用于其他适应证的可能性。

CollaGenex制药公司已经集中研究改良的非抗生素强力霉素衍生物。Perios-tat（多西环素）是MMP的一种广谱抑制剂，美国FDA1998年批准将其用于治疗牙周疾病，目前正在进行III期临床试验用于慢性成人牙周炎。CollaGenex公司最近已经递交了另一种强力霉素衍生物Oracea的新药申请书，这是口服、全身释药治疗红斑痤疮的首个药物。CollaGenex公司还宣称，另一项Incyclinide治疗痤疮的II期临床研究也获得了肯定结果。

目前，科研人员也正在研究MMP抑制剂用于治疗血管病、心肌梗死、卒中、急性肺损伤和慢性阻塞性肺病（COPD）等其他疾病，但大多处于临床研究前期。

其间，癌症的治疗并未完全被忘记。法国圣母玛利亚大学的一个小组已经开发出一种新的对白明胶酶（MMP2和MMP9）特异的基于环硫乙烷型机制的MMP抑制剂。该药虽然具有较低的水溶性，但能增加T细胞淋巴瘤侵袭型实验鼠模型的生存，同时也能挽救暂时性大脑局灶性缺血模型的神经元，显示出良好的治疗潜力。最近报告，新的选择性MMP抑制剂的可溶性得到了改进。

蛋白酶作为生物标记物

由于蛋白酶在疾病中的表达不同，所以蛋白酶及其抑制剂可用作早期诊断的标记物，在癌症诊断中尤其如此。例如，丝氨酸蛋白酶血纤维蛋白溶酶原激活剂及其抑制剂PAI1就是与乳腺癌最相关的诊断与预兆标记物，现在也应用于一些其他类型的癌症。另一个是丝氨酸蛋白酶血管舒缓素3，即PSA（前列腺特异性抗原），其作为前列腺癌的主要诊断标记物已经有数年时间了。

新近，半胱氨酸组蛋白酶也显示可作为癌症相关的生物标记物。此外，人们还发现蛋白酶可作为寄生虫感染的诊断标记物，例如发现半胱氨酸蛋白酶克鲁兹蛋白酶（Cruzipain，蛋白质CA族的一员），是查格斯病枯氏锥虫的主要免疫原蛋白。

从目前进行后期临床试验的新化合物和到2006年为止递交美国FDA针对蛋白酶靶标的新药申请数量来判断，预期在未来的几年中，以蛋白酶为靶标的抑制剂将迅速增长，治疗的主要领域可能仍然是心血管、炎症和传染病领域，另外，针对癌症和神经退变性疾病的应用将可能增加。

蛋白质从哪里产生

蛋白质生物合成过程：
1．氨基酸的活化与搬运：氨基酸的活化以及活化氨基酸与tRNA的结合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。反应完成后，特异的tRNA3’端CCA上的2’或3’位自由羟基与相应的活化氨基酸以酯键相连接，形成氨基酰tRNA。
2．活化氨基酸的缩合——核蛋白体循环：活化氨基酸在核蛋白体上反复翻译mRNA上的密码并缩合生成多肽链的循环反应过程，称为核蛋白体循环。核蛋白体循环过程可分为三个阶段：
⑴起动阶段：①30S起动复合物的形成。在IF促进下，30S小亚基与mRNA的起动部位，起动tRNA（tRNAfmet），和GTP结合，形成复合体。②70S起动前复合体的形成。IF3从30S起动复合体上脱落，50S大亚基与复合体结合，形成70S起动前复合体。③70S起动复合体的形成。GTP被水解，IF1和IF2从复合物上脱落。
⑵肽链延长阶段：①进位：与mRNA下一个密码相对应的氨基酰tRNA进入核蛋白体的受位。此步骤需GTP，Mg2+，和EF参与。②成肽：在转肽酶的催化下，将给位上的tRNA所携带的甲酰蛋氨酰基或肽酰基转移到受位上的氨基酰tRNA上，与其α-氨基缩合形成肽键。给位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA从核蛋白上脱落。③移位：核蛋白体向mRNA的3'- 端滑动相当于一个密码的距离，同时使肽酰基tRNA从受体移到给位。此步骤需EF（EFG）、GTP和Mg2+参与。 此时，核蛋白体的受位留空，与下一个密码相对应的氨基酰tRNA即可再进入，重复以上循环过程，使多肽链不断延长。
⑶肽链终止阶段：核蛋白体沿mRNA链滑动，不断使多肽链延长，直到终止信号进入受位。①识别：RF识别终止密码，进入核蛋白体的受位。②水解：RF使转肽酶变为水解酶，多肽链与tRNA之间的酯键被水解，多肽链释放。③解离：通过水解GTP，使核蛋白体与mRNA分离，tRNA、RF脱落，核蛋白体解离为大、小亚基。
真核生物翻译起始的特点：
1.真核起始甲硫氨酸不需甲酰化。
2.真核mRNA没有S-D序列，但5'端帽子结构与其在核蛋白体就位相关。帽结合蛋白（CBP）可与mRNA帽子结合，促进mRNA与小亚基结合。
3.肽链的延长 ：延长阶段为不断循环进行的过程，也称核蛋白体循环。分为进位、成肽和转位三个步骤。
三、多肽链合成后的加工修饰：
1．一级结构的加工修饰：
⑴N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除。其过程是：① 去甲酰化；② 去蛋氨酰基。
⑵氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化、甲酰化等。
⑶二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。
⑷肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。
2．高级结构的形成：
⑴构象的形成：在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下，形成特定的空间构象。
⑵亚基的聚合。 ⑶辅基的连接。
3．靶向输送：蛋白质合成后，定向地被输送到其执行功能的场所称为靶向输送。大多数情况下，被输送的蛋白质分子需穿过膜性结构，才能到达特定的地点。因此，在这些蛋白质分子的氨基端，一般都带有一段疏水的肽段，称为信号肽。分泌型蛋白质的定向输送，就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合后，将所携带的蛋白质送出细胞。
信号肽假说：信号肽位于新合成的分泌蛋白N端。对分泌蛋白的靶向运输起决定作用。①细胞内的信号肽识别颗粒（SRP）识别信号肽，使肽链合成暂时停止，SRP引导核蛋白体结合粗面内质网膜；②SRP识别、结合内质网膜上的对接蛋白,水解GTP使SRP分离，多肽链继续延长；③信号肽引导延长多肽进入内质网腔后，经信号肽酶切除。分泌蛋白在高尔基体包装成分泌颗粒出胞。

简述真核生物中分泌型蛋白质的转运途径和主要的生理功能.

分泌型蛋白质转运途径:
首先在粗面内质网上,由mRNA和2个核糖体亚基组成复合物,经翻译得到蛋白原,经过内质网的运输(同时,对蛋白质进行多种修饰和加工),到高尔基体后,对蛋白质进行最后的糖基化修饰,并形成膜泡,向细胞膜运输,至膜表面后,膜泡与细胞膜融合,将蛋白质分泌到胞外.
主要的生理功能有:
1.执行抗体功能,如:IgA等分泌型抗体,在支气管的黏液层,执行抗体功能
2.激素功能,如:人生长激素,为蛋白质类激素,由垂体分泌
3.消化酶,如:胰腺的外分泌部,分泌胰蛋白酶原,当运到小肠内后被激活,表现分解蛋白质的活性

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