多肽物质分子量检测技术

多肽物质分子量检测技术

随着分子生物学和生物技术的飞速发展，具有高生物活性的多肽类化合物的分离、纯化和分析已显得尤为突出。许多分离、纯化和分析技术都是以分子量的大小为手段的，现将我们采用的几种主要的技术介绍如下：凝胶过滤测相对分子量该技术即凝胶过滤层析，也称分子排阻层析或凝胶渗透。利用凝胶过滤可以把蛋白质多肽类混合物按分子量的大小分离出来。当不同分子大小的蛋白质多肽类混合物流经凝胶层析柱时，由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离，大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。

该方法简单，不要求复杂的仪器就可较准确地测出蛋白质多肽的相对分子量。另外，利用该技术测Mr（相对分子量）还有一个优点，即待测物可以不纯。

该技术一般采用交联葡聚糖为基质，其商业名称为Sephadex。根据需要可选用SephadexG－25（分级分离的Mr范围5000以下）、SephadexG－75（Mr范围3000～80000）、SephadexG－100(Mr范围4000～150000)。实验时，以蛋白质标准的分子量对数值为纵坐标、洗脱体积为横坐标作标准曲线。根据待测品的洗脱体积从标准曲线上查出它的Mr。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测相对分子量在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，蛋白质多肽类混合物的电泳迁移率将主要取决于它们的相对分子量，而与电荷和形状无关。

目前，对于小分子多肽的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，选择合适的系统及合适的分离胶、浓缩胶甚至是间隙胶的浓度和交联度一直是人们研究的热点。另外，应选择合适的蛋白质标准分子量范围，使得待测品的分子量能落在此范围内。

实验测定时，以各种标准蛋白质的Mr的对数值为纵坐标，其μR（相对迁移率）为横坐标作标准曲线。根据待测品的μR从标准曲线上查出它们的Mr。高效凝胶排阻色谱（HPSEC）技术测相对分子量HPSEC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，该技术快速、灵敏、高效，对于实验结果的处理与凝胶过滤一样。

固定相的孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。固定相原材料主要有Sw和Pw两种，但一般情况下，仍首先考虑采用Sw型。主要规格有TSK－2000Sw(适合于5000～100000的蛋白多肽)、TSK－4000Sw(适合50000～1000000)等。流动相一般为缓冲液（常用磷酸或醋酸缓冲液），也可含有机溶剂（甲醇或乙腈）和变性剂（尿素、胍、SDS）。

以上简要介绍了多肽类分子量测定的几种常用技术。随着科学技术水平的不断发展，会有许多更新的技术不断涌现，因此这一领域的研究具有广阔的前景。

多肽的常见问题汇总与解答（上） 干货满满

根据以往客户对于多肽如何保存使用等等的常见问题，我们在这里进行了汇总整理，希望对各位有所帮助

01

我该如何处理和保存多肽？

冻干粉形式的多肽，经密封包装可在常温条件下稳定运输，溶解状态的多肽不宜长期保存。

昂拓莱司多肽保存指南：需要长期保存的多肽，应以冻干粉形式存放在含有干燥剂的密封容器内，置于-20°C保存，-80°C效果更好，可以最大限度地避免多肽降解。这种储存方式可以使多肽可保存数年，避免了被细菌降解和氧化，也可以避免二级结构的形成。

打开包装： 在打开包装和称重前，请先将多肽在干燥器中平衡至室温。因多肽往往具有吸湿性，未经平衡到室温的多肽在打开盖子后易凝结，从而降低了多肽产品的稳定性。

称重： 迅速称取您所需的多肽，并将剩余多肽继续储存在-20°C或更低温度。与其他多肽相比，含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短。

02

如何溶解多肽？

昂拓莱司生产的多肽的溶解性很大程度上取决于多肽的极性。酸性的蛋白溶解于碱性溶液，而碱性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不带电荷的极性氨基酸残基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有机溶剂中，如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇，然后加水（蒸馏水）稀释。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因为DMSO可能造成侧链氧化。

多肽溶解测试：在多肽溶解之前先取小部分进行多肽溶解测试，您需要测试几种不同的溶剂，直到找到最适当的一种。超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。（注意: 超声处理会引起溶液发热和多肽降解。）

将每个酸性氨基酸赋值为－1，包括天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、以及羧基末端-COOH。每个碱性氨基酸赋值为＋1，包括精氨酸（R）、赖氨酸（K）、组氨酸（H）以及氨基末端-NH2。然后计算整个多肽的电荷数。

如果整段肽所带电荷是阳性的，说明该肽是碱性的。可先尝试用蒸馏水来溶解；如果不溶于水，接着尝试用少量10%-25%醋酸溶解，如果仍然失败的话，添加一些TFA（10-50微升）来增溶，然后用水稀释至理想浓度。

如果整段肽所带电荷是阴性的，说明该肽是酸性的。酸性的多肽可以尝试用PBS（PH 7.4）来溶解，如果不溶的话，添加少量的碱性溶剂，如0.1 M的碳酸氢铵，然后加水稀释至理想浓度。含有游离半胱氨酸的多肽应溶于脱气的酸性缓冲液中，因为当PH值大于7时，巯基会被迅速氧化成二硫化物。

如果整段肽电荷是零，说明肽是中性的。中性肽通常溶于有机溶剂。首先，昂拓莱司建议您尝试添加少量乙腈、甲醇或异丙醇。对于高度疏水的多肽，可使用少量的二甲基亚砜溶解，然后用水稀释至理想浓度。对于含有自由半胱氨酸的肽，需使用DMF而不是DMSO。对于有聚集倾向的肽，可添加6M盐酸胍或8M尿素，然后进行必要的稀释。

为了防止或尽量减少多肽降解，请将多肽以冻干粉形式保存在-20°C，-80°C更佳。如果需要保存溶液肽，最好分成小样存放，以避免反复冻融。一份样品融冻后未用完，应扔掉。细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦，所以请将肽溶于无菌水或肽溶液过滤除菌。

碱性氨基酸: K, R, H,N-terminus

酸性氨基酸: D, E,C-terminus

极性中性氨基酸: F, I,L, M, V, W, Y

非极性疏水氨基酸: G, A,S, T, C, N, Q, P, 乙酰基，酰胺基

举例说明：

RKDEFILGASRHD:(+5) + (-4) = +1 认为是碱性多肽

EKDEFILGASEHR:(+4) + (-5) = -1 认为是酸性多肽

AKDEFILGASEHR:(+4) + (-4) = 0 认为是中性多肽

03

一个肽段是否可溶能预测吗？

昂拓莱司无法通过研究多肽的结构来预测其在水中的溶解度。然而，赖氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于预测溶解度，尤其是短肽。与此相反，含有天门冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的，但易溶于稀氨水或碱性缓冲液。

04

如何选择适合自己研究的多肽纯度？

昂拓莱司不推荐将粗品肽使用于生物实验。粗肽可能含有大量的非肽类杂质，如残留的有机溶剂、清除剂、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除，通常交付的肽以TFA盐的形式存在。如果残留的TFA影响您的实验，我们推荐其他盐形式，如醋酸盐和盐酸盐等。这些盐通常比常规TFA盐贵20-30%以上。这是由于在转化过程中出现更多的肽损失和需要更多的原材料。

昂拓莱司建议对各种项目采用以下级别的肽纯度：

>70% 肽纯度

肽微阵列

作为制备抗体的抗原

层析法

酶联免疫吸附试验检测抗血清滴度

>80% 肽纯度

免疫印迹法（非定量）

酶底物肽（非定量）

封闭肽（非定量）

亲和纯化

磷酸化检测

蛋白电泳的应用和免疫细胞化学

>95% 肽纯度

标准酶联免疫吸附试验和RIA（定量）

受体配体相互作用（定量）

体内、体外

生物学测定

酶的研究和阻断实验（定量）

NMR研究

质谱分析

其他定量检测

>98% 肽纯度

SAR研究

临床试验

APIs(药物活性成分)

工业品

X-ray晶体研究

其他敏感的实验：酶与底物、受体与配体相互作用、阻断和竞争实验

05

什么是多肽的纯度？

多肽的纯度是指HPLC方法在214nm处检测到的目标多肽的含量(214nm是肽链的吸收波长)，紫外分光光度计检测不到水和残留的盐不。可发现其他的杂质包括：缺失序列（缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列），截断序列（加帽过程中产生的序列）脱保护不完全序列（产生于整个合成过程或最后的裂解过程）。

多肽纯化不涉及水和盐。HPLC纯化会产生少量的TFA，如：游离的氨基末端和其他侧链如Arg、Lys、His都可生成少量TFA杂质。昂拓莱司通常交付的多肽多含有微量TFA和残留水。即使处于冻干状态，水也会因共价结合的能力不同而不同程度地存在着。

纯化前的多肽中包含的杂质包括多肽和非多肽物质, 纯化后的多肽中包含的杂质除了TFA盐，大多数为序列被修改的多肽。

缺失了一个或多个氨基酸残基的靶序列

为避免缺失序列的产生而进行的加帽操作，截断序列即产生于加帽过程中

产生于整个合成过程或最后的裂解过程

保护基重新附着在多肽的其他位置

06

什么是肽净含量？

肽净含量不同于多肽纯度。肽净含量是指与非肽物质（主要为抗衡离子和水）相比的多肽量。可通过氨基酸分析来确定肽净含量。通常，亲水性多肽即使在严格的冻干状态下，也会吸收微量的水。因纯化和冻干工艺，会导致不同批次的肽净含量有所不同。

07

如何合成多肽？

不同于天然蛋白质的合成，人工合成的方向是从C到N端。昂拓莱司的多肽合成是基于PeptideSyn技术平台的Fmoc或t-Boc法的多肽合成。具体合成由下列几个循环组成：①去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用piperidine去除氨基的保护基团。②激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。③循环：这两步反应反复循环直到合成完成。接着合成的肽从树脂切割和去保护。最后被沉淀、洗脱、冷冻干燥。

08

我应该用什么盐形式？

肽通常以TFA盐的形式传递。如果残留的TFA对您的实验有问题，我们建议其他盐形式，如醋酸盐和盐酸盐。这些盐形式通常比普通的TFA盐贵20-30%，因为在盐转化过程中发生肽损失，并且需要更多的原材料。

09

如何对合成的多肽进行质检？

公司对客户提供的所有材料均严格保密。昂拓莱司是在发送产品时，同时免费提供HPLC和MS检测结果。公司所有多肽均采用反相色谱法纯化。以质谱法测定肽的分子量来确定产品是否正确，MS检测结果还可显示大部份的主要杂质。如果必要，还可提供肽净含量检测，如氨基酸分析或元素分析。这些方法可以证实多肽的氨基酸组成，他们均可作为多肽确认的补充方法。所有交付的肽均达到了客户要求的纯度。没有达到纯度要求的那些多肽均被丢弃。当然如果客户需要，也可以发送给他们。

10

公司对合成的多肽提供分装服务吗？

根据要求，昂拓莱司可以将您的部分或全部订单，免费分装成小份。由于少量分装可以避免多次反复冻融，减少容器的开盖和闭合的次数，减少处理不当或细菌污染的机会，让您的多肽更加稳定。

欢迎各位提问关注，还有什么不清楚的有疑问的，可以随时联系我们！

多肽在环境分析的应用

多肽是由蛋白质水解后得到的一类链状化合物，其分子量较小，具有一定的生物活性和生物学功能。在环境分析领域，多肽具有以下应用：
1. 水环境监测
多肽可以作为水质污染的生物指示物，通过对多肽的检测，可以快速、准确地评估水环境污染的程度和变化趋势。比如，通过检测特定类型的多肽，可以确定水环境中是否存在重金属、有机污染物等物质。
2. 气体环境监测
多肽可以应用于气体环境分析中，如空气质量监测。研究人员可以利用多肽和其它生物标志物等信息，综合分析大气污染物的来源、分布和演化规律。
3. 重金属污染研究
多肽的结构对重金属离子有选择性吸附，具有较好的重金属富集作用。研究人员可以利用具有一定亲和力的多肽结构，研究重金属离子在环境中的转移、迁移和积累规律，进而评估重金属污染的流行和风险。
4. 生物毒性测定
多肽分子具有一定的活性，可以作为生物毒性测定的重要指标。研究人员可以利用多肽的特点，研究微生物、藻类、鱼类、高等植物等生物在不同环境因子下的毒性反应，并对环境因子和毒性关系的研究提供基础性数据。
5. 环境污染物的筛查和监测
多肽具有较强的识别能力和选择性，可以应用于环境污染物的筛查和监测。研究人员可以通过生物分子技术，筛查出环境污染物在不同生物样本中的含量，并对污染源、污染程度等相关问题进行分析和研究。
综上所述，多肽在环境分析中具有广泛应用前景。随着分析技术的不断发展和更新，多肽在环境分析领域的应用也会不断地得到推广和扩展。

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