基因增殖和分析芯片提高检查的效率

基因增殖和分析芯片提高检查的效率

日本荣研化学公司日前宣布，该公司和德岛大学马场嘉信合作，开发出用名片一样大的芯片增殖、分析基因的技术，医疗机构用它可提高检查基因的效率。

据《日经产业新闻》２２日报道，这一技术使用了该公司开发的基因殖专用塑料芯片，先在芯片上搭载要检查的基因试样，然后用专用装置加热到摄氏６０度左右，约经过１０分钟，基因就会大幅增殖。分析基因时，芯片在增殖的基因中自动提取足够的量，然后芯片放入电泳装置，用一两分钟就可以分析出来。

芯片加上萤光剂，可以区别试样基因和增幅基因，分析基因在每个阶段的变化。现在问题是使用芯片使基因增殖和分析基因成本还相对较高，如何降低成本是需要解决的课题。

DNA芯片技术、基因芯片、蛋白质芯片的制作方法、原理和检测方法

生物芯片技术都包含四个基本要点： 芯片的制作、杂交或反应、测定或扫描、数据处理 。

具体而言，比较典型的DNA芯片制备方法有4种：
第一种方法 是Affymetrix公司开发的光引导原位合成法，该方法是微加工技术中光刻工艺与光化学合成法相结合的产物。
第二种方法 是Incyte Pharmaceutical公司采用的化学喷射法，该方法是将合成好的核昔酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来制作DNA芯片。
第三种方法 是斯坦福大学研制的接触式点涂法。在DNA芯片制备中通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触，而将DNA探针涂敷在芯片上。
第四种方法 是通过使用4支分别装有A，T，G，C核苷的压电喷头在芯片上并行地合成出DNA探针。根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、cDNA芯片，目前制备芯片的方法基本上可分为两大类： 一类是原位合成(in situ Synthesis) ； 一类是合成后交联(post-synthesis attachment) 。它包括化学喷射法、接触式点涂法。合成点样法虽然芯片上探针的密度相对较低，每个样品都要预合成、纯化，在芯片制备前还需妥善保存合成的探针，但是它的最大优点是操作简便。其中，接触式点涂法的优点是探针密度比较高，缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长；缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。

其基本原理和检测方法如下：
采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记（荧光、地高辛、生物素）的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析。
基本原理： DNA与DNA，蛋白质与蛋白质，DNA与蛋白质之间的相互作用。

产检基因芯片技术是检查什么

基因芯片就是利用点样技术、现代探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术等微电子技术在有限的空间内，有序的集成一系列的可寻址识别的基因片段，以用于高通量、高速度、低成本的一种分子生物学工具
在国外现有白血病诊断用芯片、高血压诊断用芯片等等。国内也有人在研究致病 菌分析用芯片
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基因芯片技术

“微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌 ”。

一、生物芯片与基因芯片
生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。鉴于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进会将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一，认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。
目前,最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列(microarray)”,也被称为基因芯片(Gene chip)DNA芯片(DNA chip)。按照载体上点的DNA种类的不同，基因芯片可分为寡核苷酸和cDNA两种芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等等。早在八十年代初期,Bains等人就用杂交的方法对固定在支持物上的短DNA片段进行序列测定。基因芯片技术从实验阶段走向工业化是得益于其他技术的引入，如激光共聚焦显微技术、探针固相原位合成技术与照相平板印刷技术的结合和双色荧光探针杂交系统的建立。90年代初期人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）和分子生物学相关学科的发展也为基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。

二、制备基因芯片的必要条件
1、靶基因 用于芯片点样的是靶基因。靶基因可分为染色体DNA（或基因组DNA）、cDNA（或人工合成DNA）。目前，以cDNA的研究为主，因为cDNA是染色体上编码蛋白质的DNA序列，有医疗和其他领域的研究价值和商业价值。
2、制备技术 基因芯片的制备综合了生命科学、化学染料、微电子技术、激光、统计学等领域的前沿技术，主要包括芯片的制备（选择点样仪和玻片、靶基因的扩增和固定）、杂交探针的制备（mRNA的抽提、mRNA的逆转录、PCR和探针荧光标记）、杂交条件的优化技术（杂交液、杂交条件和洗涤条件的选择）和数据分析技术。其中，基因芯片的制备主要依赖于微细加工（microfabrication）、自动化（automatism）及化学合成技术。通常比较典型的DNA芯片制备方法有3种：（1）原位合成法（in situ synthesis） 以Affymetrix公司开发的光引导原位合成法为代表（2）合成点样法 又根据是否与芯片的表面接触分为化学喷射法和接触式点涂法，分别以Incyte Pharmaceutical公司和Stanford大学为代表（3）压电法 通过使用4支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上作原位DNA探针合成。

三、基因芯片技术简介
基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。
1、芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。
3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。
4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micro total analytical system）或称缩微芯片实验室（laboratory on a chip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。

四、基因芯片的应用及其商业价值
目前，基因芯片技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。另外基因芯片在农业、食品监督、环境保护、司法鉴定等方面都将作出重大贡献。 基因芯片的飞速发展引起世界各国的广泛关注和重视。
鉴于基因芯片的巨大潜力和诱人的前景，基因芯片已成为各国学术界和工业界研究和开发的热点。尤其在美国，正处于人类基因组计划以来的第二次浪潮之中，美国总统克林顿在1998年1月的国情咨文中指出：“在未来的12年内，基因芯片将为我们一生的疾病预防指点迷津”。1998年6月29日美国宣布正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入，以基因芯片为核心的相关产业正在全球崛起，目前美国已有8家生物芯片公司股票上市，平均每年股票上涨75％，专家今统计：全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右，预计今后5年之内，生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。美国财富杂志载文：在20世纪科技史上有两件事影响深远，一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。鉴于生物芯片技术具有巨大理论意义和实际价值，基因芯片研究在国内也有了很快的发展，例如，复旦大学、中科院上海冶金所、清华大学、联合基因有限公司、军事医学科学院、中科院上海细胞所等单位已在生物芯片技术方面取得了较大突破，相信不久将有我国生产的生物芯片产品投放市场。
总之，以基因芯片为代表的生物芯片技术的深入研究和广泛应用，将对21世纪人类生活和健康产生极其深远的影响。

基因芯片信号检测与数据处理（详细版）

来回顾一下基因芯片分析的步骤，首先在布满探针的玻璃平板上加入不同荧光标记（Cy3和Cy5）的对照组和实验组mRNA样品，与芯片上探针杂交后，再用计算机扫描荧光信号，最后进行数据处理，分析。

?生物芯片在荧光标记的样本和探针结合后, 必须用扫读装置将芯片测定结果转变成可供分析处理的图像数据。

1.图像分析

2.数据预处理

具体过程：

1.激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光

2.激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号

3.软件进行图象分析和数据处理

?生物芯片检测的目的是将不可见的生物分子的微弱变化通过生物、化学、光学、电子和软件等多学科交叉技术的综合处理，转换成可见的数字图像信号，实现信号的放大、增强和可视化，以便进行科学研究。

扫描仪组成：包括硬件系统和软件系统

信号 (signal) : 通过检测一 起获得的数字量 输出 ，对应于真实的实验分析数据。

噪声 (noise) : 通过检测仪器的数字量输出， 对应于背景荧光、暗电流、冲击噪声以及其他非实验分析数据。

信噪比（signal-to-noise ratio) : 微阵列检测过程中信号和噪声的比值 。

1.数据的提取

2.对数化

3.探针过滤

4.补缺失值

5.标准化

6.探针注释

7.基因过滤

芯片的荧光扫描图像信号

一般来说，实验组一般为疾病样本，对照组为正常样本

CH1I?实验组信号值

CH1B? 实验组背景值

CH2I?对照组信号值

CH2B? 对照组背景值

表达谱矩阵表达量计算：

Ratio=(CH1I-CH1B)/(CH2I-CH2B）

芯片数据格式

下列为表达谱矩阵的一般格式：每一列为一个样本（sample）的所有基因表达值，每一行为某个基因在所有样本的表达值

原始数据呈偏态分布对数转化后呈近似正态分布

去除表达水平是负值或很小的数据或明显的噪音数据过闪耀现象物理因素导致的信号污染（划伤，指纹等）

原因：杂交效能低，点样问题 ……

实际问题：彗星尾 背景高 粘点问题等

非随机缺失（丰度过高或过低）

随机缺失（与表达水平高低无关）

1.删除相应的行，列

2.简单补缺法 0/1

3.均值 样本均值 基因均值

4.k近邻法

由于会存在系统误差，需要对芯片进行标准化

感兴趣的变异

真正的生物学变异

差异表达基因

混杂变异

实验过程中引入的变异

在样本的染色、芯片的制作、芯片的扫描过程中引入的系统误差

系统误差来源

染料的物理属性

染料的结合效率

探针的制备

探针和样本的杂交过程

数据收集时的扫描过程

不同芯片间的差异

不同芯片杂交条件

标准化过程的参照物稳定表达的基因

持家基因(housekeeping genes)

外源性的或人工合成的控制基因(controls）

芯片上大部分稳定表达的基因(所有基因)

相对稳定基因子集( invariant set）

不存在染料偏倚

不存在不同grid带来的系统误差

主要为不同芯片间的差异

类似于cDNA芯片

Z-score

MAS 5

RMA

Probe ID 第一列

Gene Symbol 第二列

ENTREZ_GENE ID 第三列

删除探针对应不到基因表达谱里的行

多个探针对一个基因，表达值取均值或中值

一个探针对多个基因，删除行

r语言实现

probe_name<rownames(probe_exp)#提取probeid

loc<match(probeid_geneid[,1],probe_name)#probeid进行匹配,30000多个

probe_exp<-probe_exp[loc,]#能匹配上的probe的对应表达值

raw_geneid<-as.numeric(as.matrix(probeid_geneid[,3]))#每个probeid对应的geneid

index<-which(!is.na(raw_geneid))#找出有geneid的probeid并建立索引

geneid<-raw_geneid[index]#提取与geneid匹配的probeid

exp_matrix<-probe_exp[index,]#找到每个geneid的表达值（这里探针对应不到基因的行就删除了）

geneidfactor<-factor(geneid)

gene_exp_matrix<-apply(exp_matrix,2,function(x) tapply(x,geneidfactor,mean))#多个探针对应1个基因的情况，取平均值

rownames(gene_exp_matrix)<-levels(geneidfactor)#geneid作为行名

gene_exp_matrix2<-cbind(geneid,gene_exp_matrix)

write.table(gene_exp_matrix2,file="geneid_exp.txt",sep=" ",row.names=F)#写出geneid表达谱矩阵

＃把gene id转化成gene symbol

loc<match(rownames(gene_exp_matrix),probeid_geneid[,3])#geneid表达谱矩阵和geneid匹配，建立索引

row.names(gene_exp_matrix)<-probeid_geneid[loc,2] ＃行名换成gene symbol

genesymbol<-rownames(gene_exp_matrix)

gene_exp_matrix3<-cbind(genesymbol,gene_exp_matrix#Gene_symbol这列为表达谱的行名，并与表达谱合并

write.table(gene_exp_matrix3,file="genesymbol_exp.txt",sep=" ",row.names=F,quote=F)#写出genesymbol表达谱矩阵

基因过滤

波动筛选方差

最小倍数变化筛选(Minimumfold-change filter) 差异性较小的基因可用该方法去除

此处筛选的标准基于以下条件:满足表达量距其在所有芯片上表达量中位数相差指定倍数的基因的个数，占总基因个数的比例(故在此需要用户指定两个值，比例和倍数)。

少于x%中的表达水平大于等于中值的y倍(20%，1.5）

内容大部分来源于老师PPT和生物信息学第二版，在这里做总结归纳

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