中药基因功能调控获突破(二十一世纪基因技术的几个重大突破)

中药基因功能调控获突破

最近，一项关于“中药与基因功能调控的研究”取得初步成果，引起了有关方面的关注。

据中新社报道，开展该项研究的北京朝阳安苑中医医院院长种连进称，目前人类发现和证实的分子生物学最主要的功能，在于它可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动，而某些中药具有类似的功能。1987年，他提出中药具有人体器官再造功能的假设，并藉此研制出治疗糖尿病的药物----愈消散。其后，他带领研究组赴美国斯坦福大学进行基因领域的研究，证实愈消散对2型糖尿病和胰岛素依赖型糖尿病均有明显效果，现时已在十多个国家上市。

中药具双向调节作用

种氏的研究发现，中药具有双向调节作用，而西药虽然作用明确和见效快，但作用单一。例如，治疗血压病的药物只能降压或升压，不能同时又升又降；但同一种中药却可以对血压高的人降压、对血压低的人升压。他认为，这对解决人类“基因功能调控”的问题至关重要。

减少患者盲目用药

他又说，采用能够作用于疾病基因靶点的天然植物活性蛋白化合物，对糖尿病进行对症治疗研究，可有效地修正病理细胞蛋白结构，增殖生理结构细胞，恢复器官生理功能。医生可以根据病人的不同情况，预见治疗效果，缩短病程，减少患者盲目用药。他强调，中国是中药的发祥地，故应该让古老的中药与最前沿的基因学说成功结合，对世界医学作出贡献。

二十一世纪基因技术的几个重大突破

1生物多样性

自然界蕴藏着巨大的微生物资源，但是人类至今对极端环境微生物(extremophiles)和未培养微生物(unculturable microorganisms)两个资源宝库涉足不深，所以研究开发潜力极大。

可以预期，人们能从嗜酸、嗜碱、嗜冷、嗜热、嗜盐、嗜压等等极端微生物中获得许多有价值的酶、蛋白质以及其他活性物质。在过去几年中，随着重组酶生产技术的开发，使人们有可能从更广泛的来源获取更廉价的酶。近年在这方面取得的进展在一定程度上得益于极端微生物培养技术的进步，更得益于把极端微生物的基因转移到常用受体微生物宿主能力的提高。如此一来，人们有理由相信：在温和、便宜的生长条件下就可以生产出对极端环境具有耐受性能的生物催化剂来。

另外据知，能够在实验室培养的微生物的种类仅占自然界中微生物总数的不到1％!也就是说，还有99％的不可培养的微生物等待着我们用非常规手段加以研究。作为微生物资源研究和开发领域里的一个重大探索，可以采用最新的分子生物学方法，绕过菌种分离纯化这一步骤，直接在自然界中寻找有开发价值的微生物基因。把来源于未经培养的微生物的DNA克隆到业经培养驯化的宿主生物体中，然后用高通量筛选技术从重组的克隆里筛选为新酶编码的基因。

微生物世界展示给人类如此巨大的机会使我们兴奋不已，一些有识之士指出：未知的微生物世界或许是地球上最大的未开发的自然资源，能充分利用这个微生物资源宝库的国家必将取得发展的先机。

2．2基因组测序

随着DNA测序能力的提高，对序列的分析能力也得到加强，于是可以发现许多新的基因。通过同已知基因序列进行比较来推断新基因表达产物的基本酶活性。当然目前的技术水平还不足以推断出这些酶性质的许多细节。因此必须表达这些新发现的基因，以确定它们在一个特定的过程中是否确实有用。假定，从一种生物体来源的所有的酶在它的正常生长温度下都有功能，那么来自超级嗜热微生物的DNA序列就能成为寻找在沸点附近仍然有功能的酶的合理起点；同样可以认为，嗜冷微生物的基因则可能成为在零度仍然具有功能的酶的可能来源。

因特网最新资料表明：大约60种微生物的基因组序列已经完成，另外还有近200种微生物基因组预期很快就可以完成。测序工作的努力已经揭示了数万个新基因，主要的是编码酶的一些基因，其中大约三分之一可以被归到“有功能”的家族里，这是一个十分丰富、而且每天都在增加的新工业酶后选者的来源。相信随着基因组时代的到来，将会有大量新的工业酶被人类发现。

2．3定向性进化

在以发现工业酶为主要目标的所有技术中，定向进化(directed evolution简称DE)可能是最强有力的一种。DE是一种快速而廉价的发现各种新酶的方法。这类新酶在特定的条件下应该比天然酶工作得更好。DE模拟自然进化，这种进化取决于从多样性群体中选择合适“个体”，这里的“个体”就是酶。DE是定向的，意思是研究者通过一步步改进使选择的各种酶要符合一定预期的标准。DE从克隆拟改进的酶的基因起始。分离到的基因通过体外突变使其多样性得到加强。然后，克隆这些突变株的DNA，并且在通常的受体中表达，分析表达产物的酶活力，选择最好的变异株克隆。它的基因又作为下一轮筛选的新起点。使用这一方法需要掌握两项重要的支撑技术，即DNA重排(DNA shaffling)和高通量筛选技术。

2．4噬菌体展示

该技术最初是用于鉴定和分离蛋白质的一些结构域，该结构域能够牢固地结合到别的分子上。但是近年这个核心技术又经过进一步设计和发展，致使拟被改良的酶在理论上也可充当被鉴定和分离的靶子。噬菌体展示最简单的形式涉及把小段靶子DNA，(该DNA应该是突变和筛选的靶子)插入噬菌体的基因组中，其插入位置要求其编码的蛋白质结构域能够出现在噬菌体颗粒的表面上。靶子基因的突变导致各种不同的结构域在表面上展示，如果各种不同的结构域的任何一个能足够牢固地结合到一种固定化底物上，则编码这个结构域的颗粒便粘到这一固定相上，借以把它们从未结合的结构域分开。然后把结合的噬菌体从固定化的底物上洗脱下来，收集之，增殖之。重复这一过程则可以增加获得具有优良品质酶的几率。

3两个实例

以下结合本实验室的研究工作举两个实例。一个是酶制剂L—天冬酰胺酶；另一个是氨基酸，L—天冬酸。这两个例子在我们讨论的生物技术第三个浪潮这个主题下有一定的代表性。

3．1L-天冬酰胺酶

作为抗白血病首选药物的L—天冬酰胺酶早就用大肠杆菌发酵的方法生产，但是生产和应用至少存在两个问题。一个问题是细胞形成酶的能力很低；另一个问题是酶在体内半衰期短。这两个问题的存在导致药物生产成本过高，加大了患者的负担。

本实验室借助基因工程技术提高了酶合成能力，首先从大肠杆菌获得编码该酶的基因，体外重组之后再转化到大肠杆菌体内，不同的是强化了上游调控元件，便大大提高了酶合成能力40多倍!

本实验室解决半衰期短和稳定性差的策略是制备L—天冬酰胺酶—抗体的融合蛋白。首先从噬菌体抗体库中筛选得到L—天冬酰胺酶(ASNase)的保护性抗体scFv46，然后构建融合蛋白scFv-ASNase及ASNase—scFv。稳定性测定结果表明：这两种融合蛋白比天然ASNase的抗蛋白酶降解的能力强，并将天然ASNase的体外半衰期由2小时分别提高到9小时和6小时，另外，二者对高温及低pH条件都具有较强的抗性。通过计算机模拟技术，预测了融合蛋白ASNase—scFv及scFv—ASNase的三维结构，并与报道的天然ASNase的三维结构进行比较分析。通过结构分析并结合上述的实验结果，提出scFv的保护机制是scFv的空间阻碍效应(如封闭蛋白酶作用位点)与改变酶分子静电势表面的综合作用结果。

借助完全基因组序列信息进一步提高L—天冬酰胺酶的稳定性的新尝试。通过近年中国科学院一个科学家小组的不懈努力，完成了一种极端嗜热微生物长达2689443 bp全部基因组的测序研究工作。为进一步提高L—天冬酰胺酶的稳定性并延长该药的体内半衰期，我们在这方面作出了的新努力，即试图借助完全基因组序列信息，从一株极端嗜热微生物中寻找稳定性更好的L—天冬酰胺酶。

本实验室已经测知E．coli L—天冬酰胺酶的氨基酸序列及为其编码的基因核苷酸序列。在上述极端嗜热微生物的完全基因组序列数据库中搜寻E．coli L—天冬酰胺酶的结构类似物，结果在No．967号基因编码的蛋白质中，发现了一个一级结构与L—天冬酰胺酶十分相似的蛋白质。其中35％(115／323)的氨基酸完全一样，另有52％(171／323)的氨基酸相似。因此，有理由相信在这株极端嗜热微生物中很有可能存在一个与E．coli L—天冬酰胺酶有类似功能的蛋白质。又鉴于该基因来自极端嗜热微生物，预期这个蛋白质还将会具有更好的热稳定性。当然，一切结论将留待通过对该基因的克隆、表达、产物的分离和功能分析的结果予以最后的证实或澄清。

3．2L—天冬酸

通常的生产方法是用富含L—天冬酸酶的微生物细胞，经过固定化处理后，将底物反丁烯二酸转化为L—天冬酸。本实验室早期也曾作过一些工作并且投入生产应用。在2000年柏林生物技术大会上得知，日本一个公司采取一系列改进措施，使生产工艺水平大大提升了一步。首先为解决酶合成能力低下问题，也是采用基因工程技术，提高合成能力50倍；固定化酶的通透性问题因采用离子交换性质的材料而得以解决；反应热—反应器设计及降低反应温度，从37℃降低到20℃；消除了污染环境的副产物硫酸铵，代之以能重复使用的反丁烯二酸铵；正在开辟L—天冬酸的新用途，用于制造多聚L—天冬酸酶。这个经过改进的新工艺既是先进的、高效的，又是绿色的、环保的。使这一产品的生产工艺几乎达到尽善尽美的地步，代表了21世纪传统产业改造的方向。

4产业结构

我们正处在这样一个时代：社会经济发展所遇到的一些重大障碍有待工业生物技术去解决；科学技术的迅速发展形成了一批先进的技术平台；许许多多实例说明生物技术的第三个浪潮正在向我们走来。我们相信：在这第三个浪潮中，中国和世界工业生物技术产业结构将会发生巨大的变化。

上世纪工业生物技术产业格局大体上包括抗生素、维生素、氨基酸、有机酸、(醋酸、乳酸、柠檬酸、衣康酸、苹果酸、葡萄糖酸等)、酶制剂、单细胞蛋白、溶剂(丙酮、丁醇)、乙醇、核酸、核苷酸等等。传统产业的全面技术改造：向高产、优质、高效、资源节约、环境友好型过度，还肯定诞生一批新产业，包括生物材料产业、生物能源产业、生物化工产业及环境生物技术产业等等。

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