Nature：神秘lncRNA让免疫无过无不及

Nature：神秘lncRNA让免疫无过无不及

2016年08月27日讯 根据宾夕法尼亚大学Perelman医学院病理学和实验医学助理教授Jorge Henao-Mejia博士领导的一项研究，称作长链非编码（lncRNAs）的特殊RNA分子是维持免疫健康的关键控制因子。这一研究发现为以一组白细胞异常寿命为特征的一些炎症性疾病提供了一个潜在药物靶点。研究论文发布在《自然》（Nature）杂志上。

2013年，当Henao-Mejia还在当前研究共同作者、耶鲁大学Richard Flavell的实验室做博士后研究员时，发现了称作Morrbid的一种lncRNA的编码基因。在2014年于Perelman医学院建立自己的实验室后，Henao-Mejia和他的学生们领导这一研究小组最终鉴别出了表达Morrbid的免疫细胞，并阐明了Morrbid的作用以及它调控免疫细胞寿命的机制。

长链非编码RNAs是由一些基因转录生成，在细胞中通常含量丰富，但它们不编码蛋白质。人类基因组包含大约2万个蛋白质编码基因，占据基因组不到2%，而70%的人类基因组积极地生成了大约1万种lncRNAs，其中大多数lncRNAs的功能未知。

研究小组发现Morrbid控制了循环骨髓细胞的寿命，这些细胞对于维持抗感染与炎症之间的适当平衡至关重要。Morrbid编码基因在包括小鼠和人类在内的不同物种间非常保守，为某些免疫细胞--中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞所特有。

这些细胞类型构成了70%的循环白细胞，但它们能非常强有力地做出反应，有时甚至强烈到可以对周围健康的组织造成损伤。那么身体是如何控制这一最初过分狂热的看门狗反应的呢？身体如何知道何时告知细胞退却？其机制为何？

Henao-Mejia说：“这些细胞极其短寿--不到一天，它们的寿命受到严格地调控以满足生物体的需求。如果我们了解了它们的寿命受到严格调控的分子机制，当这种控制出错或升级，当有需要时，或许我们可以纠正它。”

Morrbid通过控制邻近基因Bim的表达调控了细胞的寿命。Bim可响应细胞外周围环境中丰富的促生存细胞因子和代谢物控制程序性细胞死亡。Morrbid实际上压倒了阻止免疫细胞过早死亡的一个信号机制。

通过删除小鼠的Morrbid，研究小组促使大幅度减少了正常表达Morrbid的免疫细胞频率。因此，小鼠对抗感染的能力降低，但获得了对炎症的抵抗力。

在嗜酸性粒细胞增多症（hypereosinophilic syndrome）患者中，人类版本的基因MORRBID表达受损，一些免疫细胞的寿命不受限制，会导致炎症和器官受损。Henao-Mejia说：“知道了这一点，Morrbid或许是这一少见病一个极好的药物靶点，甚至可能对哮喘、炎性肠病、肥胖或癌症一类的慢性疾病具有潜在的作用，所有这些疾病都对应它们的症状具有一个错误的炎症元件。在不久的将来，我们希望集中精力开发出一些策略来调节人类细胞中的MORRBID功能，作为对抗炎症疾病的一种有效治疗工具。”

炎症小体是在细胞感染或压力情况下激活的分子平台，其能够触动激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1，导致促炎症细胞因子IL-1β和IL-18成熟与分泌。来自中山大学、休斯顿卫理公会医院研究所等机构的研究人员证实，TRIM11通过p62依赖性的选择性自噬降解AIM2抑制了AIM2炎症小体。

麻省大学医学院的一个科学家小组发现了，负责调控天然免疫的一种长链非编码RNA：lincRNA-EPS。这项研究发布在2016年6月的Cell杂志上。在巨噬细胞中大量表达的lincRNA-EPS，将触发炎症的一些基因维持在关闭状态直至遭遇到病原体。这一研究发现指出了lincRNAs在免疫系统中从前未知的一种作用，有可能促成对失控性免疫反应引起的一些炎症疾病，如红斑狼疮或炎症性肠病的新认识（Cell文章揭示重要的lincRNA ）。

急性炎症是对组织损伤或感染做出的一种生理反应，其具有自限性，通常对宿主有益；然而，不受控制的炎症高度有害，是许多广泛发生的疾病如动脉粥样硬化、肥胖症和癌症的基础。来自第三军医大学的研究人员证实，吞噬细胞呼吸爆发激活了巨噬细胞促红细胞生成素（erythropoietin）信号，促进了急性炎症消退。

Nature子刊综述帮你总结知识点：癌症中的RNA，每个都是研究热点

基因表达紊乱是癌症的一个主要标志。事实上，转录因子活动的改变已被证明是一些癌症最常见亚型的驱动因素。RNA对基因表达至关重要，无论是以蛋白编码RNA（mRNAs）的形式，还是以参与和调节转录的非编码RNA形式（lncRNAs或snRNA）、剪接（snRNAs）和翻译（核糖体RNAs、tRNAs和microRNAs）。 最近的证据表明，RNA的加工在癌症中被系统改变，证明RNA对肿瘤发生、生长和进展的重要影响。

2020年10月，来自澳大利亚的研究人员在《 Nature Reviews Cancer 》发表题为“RNA in cancer”的综述， 讨论了编码和非编码RNA的加工或活性改变如何促进肿瘤的发生、生长和进展，强调了RNA在癌症中的既定角色（miRNA和lncRNA）和新兴角色（选择性mRNA加工和circRNA）以及它们对癌症的作用机制。

一旦RNA聚合酶II合成了 mRNA ，它必须首先剪接并进一步加工成成熟的转录物，然后从细胞核输出到细胞质，转化为蛋白质。这些相互连接的处理步骤是由许多大分子复合物完成的，例如剪接体和转录-输出复合物TREX和TREX2。

在生理条件下，基因表达也可以通过一些 非编码RNA ，包括miRNAs、lncRNAs和circRNAs来调节。通常，miRNAs通过加速靶基因的去乙酰化和降解来负调控基因的表达，而lncRNAs则通过作为调节蛋白复合物的支架、定位到基因组DNA或改变基因组结构来调节顺式或反式的基因表达。

许多miRNAs被发现与癌症相关，要么作为肿瘤抑制因子，要么作为癌基因。

miRNA的作用： 人类细胞中大多数蛋白质的表达水平受到一个或多个miRNA的某种程度的调控。单个miRNA可以具有许多mRNA靶标，而单个mRNA可以被多个miRNA靶向。尽管miRNA可以共同作用，以抑制在3'非翻译区（UTR）中具有多个miRNA结合位点的靶标的表达，仅一种类型的miRNA与靶标mRNA的结合导致相对温和减少靶基因表达。通过RNA测序已经检测到1000多种不同的miRNA。一些miRNAs，如肿瘤抑制因子let-7，在几乎每种细胞类型中都有大量表达，而另一些miRNAs具有高度的细胞类型特异性表达，或者在某些细胞类型中以非常低的水平存在或不存在。因此在检测低表达的miRNAs的可能影响时，需要谨慎。

致癌和抑癌的miRNA：

1. 靶向致癌途径负调控因子的miRNAs在失调时可能通过多个靶点抑制RAS-MEK-ERK信号和miR-155/miR-221，它们分别针对SHIP1（也称为INPP5D）和PTEN，这两个都是AKT信号的负调节器。

2. 在癌症中最常见减少的miRNA是let-7 miRNA突变体，它通过靶向强效癌基因，包括MYC、KRAS和HMGA2作为主要的肿瘤抑制因子。因此，let-7 miRNAs被认为是一个重要的治疗靶标。

3. 大量miRNAs也被报道通过限制或逆转上皮-间质转化（EMT）来限制转移和/或化疗耐药，其中最有效的是miR-200家族。

miRNA失调的机制： miRNA基因由RNA聚合酶II转录，因此受到与蛋白质编码基因相同类型的表观遗传调控。事实上，许多miRNA基因都来自于蛋白质编码基因的内含子。在癌症中有许多关于miRNAs表观遗传失调的报道。 癌症中miRNA表达水平广泛下调的一种模式是源于缺氧诱导的癌细胞中Drosha和Dicer表达水平的降低 ，以及AGO2的磷酸化 ，进而降低了Dicer与AGO2并抑制miRNA从前体到成熟miRNA的加工。 然而，并不是所有的miRNAs都会受到缺氧的下调， 例如，miR-210的转录诱导可以覆盖缺氧诱导的加工减少，并且可以抑制免疫缺陷小鼠肿瘤生长的启动，但也可以促进细胞在肿瘤缺氧的应激环境中的适应和生存。 miRNAs下调的另一个机制可能是由于基因突变或前miRNAs转运蛋白exportin 5（XPO5）磷酸化水平的变化而减少核的输出。

lncRNAs已经被发现具有致癌或肿瘤抑制功能。

lncRNAs的作用： lncRNAs是指长度超过200个核苷酸不编码蛋白质的RNA。与mRNAs一样，它们由RNA聚合酶II转录，但与mRNAs不同， 许多lncRNAs优先定位于细胞核。它们具有不同的功能，包括核作用，如调节顺式或反式中的基因表达，调节剪接以及亚单位透明结构域的成核。2010年，lncRNA HOTAIR通过参与染色质重塑促进乳腺癌转移，随后发现许多lncRNA具有影响癌症发展或进展的功能。一些lncRNAs可能具有多种看似不相关的功能。 例如，lincRNA-p21最初被鉴定为p53诱导的肿瘤抑制因子lncRNA80，并被证明介导异质性核糖核蛋白K（HNRNPK）与其邻近基因CDKN1A（编码p21）的结合并增加其转录。

致癌和抑癌的lncRNA：

1. 最近的一项研究揭示了lncRNA-REG1CP在结直肠癌中的表达经常上调。REG1CP通过将解旋酶FANJ与相邻基因REG3A86的启动子连接，促进结直肠癌异种移植瘤的生长。

2. PCAT19是一种致癌的lncRNA，它激活反式基因，促进前列腺癌的生长、侵袭和转移。

3. 细胞质lncRNAs也可能是癌基因。在MYCN扩增的神经母细胞瘤中过度表达的lncRNA linc0255，通过与核糖体蛋白RPL35的相互作用特别激活E2F1的翻译。

4. lncRNAs也可以作为肿瘤抑制剂。核lncRNA DIRC3影响局部染色质结构，激活编码肿瘤抑制因子IGFBP5的邻近基因的转录。

5. lncRNAs也可以通过调节细胞质中的信号来抑制肿瘤。细胞质lncRNA-DRAIC在去势抵抗的晚期前列腺癌中下调，并通过干扰NF-κB激酶（IKK）活性抑制剂抑制核因子-κB（NF-κB）激活来抑制其进展。

6. 一些lncRNAs仍然有可能编码小蛋白。事实上，lncRNA LINC00908可以产生一种60个氨基酸的多肽，与正常组织样本相比，该多肽在三阴性乳腺癌组织中下调，并且与整体生存率差有关。

lncRNAs的多重对立效应： 关于lncRNA基因在癌症中的影响，最能说明问题的一个例子是考虑lncRNA基因在强效癌基因表达中的作用，也可能反映了MYC在驱动对增殖和生长信号的转录反应中所起的关键作用，MYC基因的转录受多个邻近lncRNA基因转录的调控。这也凸显了lncRNA基因座可以产生具有不同甚至相反功能的RNA。通过对小鼠体内大量MALAT1 lncRNA进行基因缺失研究的对比解释，进一步强调了lncRNA对基因表达影响的复杂性。

circRNA的新角色： circRNAs基本上在所有细胞和组织中都有表达，并且在癌症中可能被错误调节。circRNA主要是反向剪接事件的产物，它将外显子拼接到前一个外显子而不是下游外显子上，从而形成共价闭合的circRNA分子。有报道称， 一些circRNA位于细胞核内并调节转录，但大多数circRNAs位于细胞质中。 单个细胞可以表达数千个circRNAs，通过对患者肿瘤和癌细胞系RNA的深度测序，总共检测到超过200000个不同的circRNAs。 一些circRNAs被发现在癌症中与相应的正常组织相比过度表达，增加了它们作为疾病生物标志物的可能性。 circRNAs有可能作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用， 可能是通过充当miRNAs的海绵，而一项敲除筛选表明，前列腺癌细胞中一些高度丰富的circRNAs对细胞的最大增殖至关重要，虽然还需要更多的工作来确定致癌或肿瘤抑制circRNAs。 circRNA可能还充当多蛋白复合物的核因子或组分。

失调的circRNAs： 什么导致癌症中的细胞周期失调？基因拷贝数或circRNA前体转录的改变无疑改变了它们在某些癌症中的水平。然而，由于大多数circRNAs是来自蛋白质编码基因的选择性剪接产物，因此需要仔细区分这些变化的影响与同源蛋白水平变化的影响。circRNA水平变化的另一种方式是通过参与circRNA生物合成的剪接因子水平的改变。

mRNA前体的剪接以去除内含子并以不同的方式连接外显子是基因表达的基础。事实上，选择性剪接可以通过产生选择性蛋白质亚型来促进转录组和蛋白质组的多样性。这个过程是由主要的剪接体完成的，它执行大多数的RNA剪接反应，并且与300多种不同的蛋白质相关。

一旦mRNAs被剪接和多聚腺苷酸化，它们必须从细胞核中的转录和加工部位输出到细胞质中进行翻译。有效的mRNA输出是通过将基因表达途径中的上游过程（即转录、剪接和多聚腺苷酸化）与mRNA输出耦合来实现的。mRNA不断地通过核孔复合体的内部通道运输，使蛋白质和分子能够穿过核膜。 转录、RNA剪接和多聚腺苷酸化与mRNA输出之间存在广泛的耦合，对肿瘤的发生具有重要意义。

mRNA剪接的新角色： mRNA剪接在历史上被认为是一个内控过程，对多外显子基因的表达至关重要，但最近的研究结果显示了RNA剪接机制的调控潜力。改变的mRNA剪接机制如何促进肿瘤的发生？SRSF2、SF3B1和U2AF1的突变都不同程度地影响3′剪接位点识别。这种改变的剪接可能会影响编码促进转化的蛋白质转录物的稳定性。

选择性裂解和聚腺苷酸化： 在肿瘤中也广泛观察到下游mRNA处理步骤的改变，如前体mRNAs的裂解和多聚腺苷酸化。例如，3′UTR区在肿瘤细胞系和肿瘤标本中均发生缩短。

选择性mRNA输出的新兴作用： 基因表达途径的末端步骤之一，mRNA的核输出，在癌症中也发生了改变。虽然mRNA输出被认为是基因表达中的一个普遍的、默认的途径，但是特定的生物途径可以通过选择性的mRNA输出来调节，使某些mRNAs优先于其他的。选择性mRNA输出可以调节对癌症发展至关重要的生物学过程，如细胞增殖和基因组完整性。这种mRNA输出机制的调节潜力可被癌细胞利用以维持增殖。

在过去的几年里，大量的研究已经非常详细地揭示了RNA在癌症中发生系统性改变的程度。癌症中编码和非编码RNA的广泛改变影响了肿瘤发生的多个方面。

这些不同的RNA亚型和处理它们的蛋白质参与癌症发生的机制特性，为治疗干预提供机会。例如，一些以核心剪接体机制为靶点的化合物，如与SF3B复合物结合的E7107，在体内影响RNA剪接，但在I期临床试验中静脉注射时表现出显著的毒性。最近的研究表明，在具有剪接体突变的晚期血液恶性肿瘤中，使用SF3B复合物H3B-8800的可口服调节剂，在耐受剂量良好的小鼠模型中显示了优先抗肿瘤活性。其他研究试图通过使用介导其蛋白酶体降解的化合物作为干扰剪接的替代药理学手段来调节选择性和调节性剪接因子，如RBM39，在小鼠急性髓系白血病模型中获得成功。RNA在癌症中的广泛改变将为治疗提供大量的新机会。进一步阐明RNA加工改变促进肿瘤发生、生长和进展的基本机制，对于确保癌症疗法专门针对RNA加工过程且对正常细胞的影响最小至关重要。

首发公号：国家基因库大数据平台

参考文献

Goodall, G.J., Wickramasinghe, V.O. RNA in cancer.?Nat Rev Cancer?(2020). https://doi.org/10.1038/s41568-020-00306-0.

什么是外泌体？

什么是外泌体 人到中年，最难以启齿的矛盾便是脸上越来越多的皱纹和内心与日俱增的
“抗老需求”之间的矛盾。为了今天的容颜不被明天改变，什么玻尿酸、水光针甚至是干细胞美容，我都勇于“尝鲜”。而作为美容界的后起之秀——“外泌体”，我更是不愿错过。毕竟它虽然是近两年兴起的美容模式，但其发展历史也已经有40多年了，而它的美容功效更是有口皆碑，比干细胞美容有过之而无不及，一时间，关于外泌体美容的宣传铺天盖地，可谓是风头无两，颇有“江湖大佬”的地位。但也正因为如此，我们更要科学严谨的对待外泌体美容，了解它的原理，才能更好的应用它。

外泌体，从字面上看，就是细胞向外分泌的物体。科学释义是：细胞所分泌的直径为30~150nm的双层磷脂囊泡，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。

外泌体的作用机理 外泌体最大的功能便是人体的“通信兵”，它能在细胞间传递物质，从而调控受体细胞的功能及生物学行为。通俗的说，外泌体就好像一辆“细胞货拉拉”，装了自家一堆有用的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，进行“卸货搬家”。

希吉亚外泌体分离方法 外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，希吉亚外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、免疫磁珠法等。

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超速离心法：超速离心法是大家最熟悉的一种分离方法，文献中应用最多且也是目前比较受到认可的方法。超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法耗时耗力，往往需要8-30个小时；且需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。

希吉亚外泌体美容机制 ?
免疫磁珠法：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。

促进细胞再生。外泌体可以有效刺激受体细胞，释放细胞活力，促进其再生和新生。因而可以帮助淡化祛除斑点，促使肌肤光亮细腻。

修复受损细胞。外泌体外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成，从而让帮助修复受损的肌肤屏障。而且它可以提高受损部位的修复能力和愈合能力。

抑制炎症产生。外泌体可以诱导巨噬细胞向M2型极化，从而降低了巨噬细胞诱发炎症反应的能力，从而抑制炎症。我们肌肤的很多问题都与肌底炎症有关，而外泌体可以通过抑制炎症来让肌肤从内而外的健康起来。

干细胞疗法围绕使用完整细胞来替代丢失的组织。相反，外泌体是与细胞分离的囊泡。外泌体促进恢复青春活力的方式是利用外泌体中携带的有效成分来帮助其他细胞。

干细胞和外泌体的另一个主要区别是前者仅从身体的特定部位获得，例如：骨髓、血液、脂肪组织。而外泌体，可以从几乎所有类型的细胞中获得。胎盘中也含有大量的外泌体。

通过上述科普，大家对外泌体美容一定有了更全面的认识

如何高效率转染免疫T细胞？

高效率转染免疫T细胞是大家关心的问题；

一、2020-2-19浙江大学附属第二医院乳腺外科,浙江大学附属第二医院浙江省疗法肿瘤微环境与免疫重点实验室；联合发表标题为Breast cancer-derived exosomes transmit lncRNA SNHG16 to induce CD73+γδ1 Treg cells（乳腺癌衍生的外泌体传递lncRNA SNHG16诱导CD73 +γδ1 Treg细胞）的文章到nature.com/sigtrans杂志，文章已被接受；

二、本研究使用中使用Invigentech（英克）公司INVI DNA RNA 转染试剂转染质粒DNA、siRNA到Vδ1 T?免疫T细胞里面；

三、本文中转染质粒DNA、siRNA，转染细胞数量信息如下：

A.?将全长2435 bp的序列克隆到pCR3.1载体中构建SNHG16过表达载体;

B.?siRNA序列：SNHG16-homo-349，5′GCCUCUGCUGCUAAUUGUUTT-3'; SNHG16-homo-867，?5′-CCAAGGAGGGACUGUUUAATT-3′和SNHG16-homo-2004，5′-CCCAGUGUUGACUCACCAATT-3；

C.?转染细胞用量：6孔板里面1 × 106 cells/well；

四、发表文章部分内容如下：

Breast cancer-derived exosomes transmit lncRNA SNHG16?to induce CD73+γδ1 Treg cells

Plasmid construction and siRNA silencing?A full-length 2435 bp sequence was cloned into the pCR3.1 vector to

construct the SNHG16 overexpression vector. The sequences of?SNHG16-specifific siRNAs were as follows: SNHG16-homo-349, 5′GCCUCUGCUGCUAAUUGUUTT-3′; SNHG16-homo-867, 5′-CCAAGGAGGGACUGUUUAATT-3′ and SNHG16-homo-2004, 5′-CCCAGUGUUGACUCACCAATT-3′. The miR-16–5p mimics, inhibitor and negative

controls were purchased from GenePharma (SupplementaryTable S3).

To manipulate the expression of miR-16–5p in?Vδ1 T cells,?Vδ1T cells were sorted from peripheral blood and seeded into six-wellplates at 1 × 106 cells/well with 1 ml of medium supplementedwith 10% FBS, 10 μg/ml CD3, 10 μg/ml CD28 and 40 U/mL IL-2.Then,?transfection reagent (INVI DNA RNA Transfection Reagent,Invigentech, USA) and miR-16–5p mimics/NC/inhibitor/inhibitor?NC (20 μm) were incubated with the cells for 48 h, after which the?cells were collected for further experiments.

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