CRISPR先驱Cell子刊发表新成果

2016年09月05日讯 细菌利用CRISPR RNA（crRNAs）指导的监视复合体，来靶定要破坏的外源核酸。虽然大多数I型和III型CRISPR系统需要四个或更多的不同蛋白质，才能形成多亚基的监视复合体，但是，I-C型系统只使用三个蛋白质来实现crRNA成熟和双链DNA的靶标识别。

9月1日，Cell子刊《Molecular Cell》在线发表的一项研究中，加州大学伯克利分校的研究团队表明，上述每个蛋白质都发挥着多重的功能和结构作用：Cas5c切割pre-crRNAs并招募Cas7定位RNA向导，以用于经由Cas8c的DNA结合和解旋。研究人员采用冷冻电子显微镜技术，获得了Cascade/I-C 监视复合体的自由形式和DNA结合形式的重建结构，所揭示的构象变化可使得形成R环，每一条DNA链都有不同的定位。这种精简的I-C型系统解释了CRISPR通路如何可能进化出结构紧凑，保留其作为RNA引导性DNA捕获平台的全部功能。

这篇论文的通讯作者是基因组编辑技术变革的先驱之一Jennifer A. Doudna教授，她曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（ Breakthrough Prize）（欲戴王冠，必承其重：追寻CRISPR奥秘的女科学家），同时也是CRISPR专利的有力竞争者（CRISPR发明专利究竟花落谁手？）。

Doudna带领的研究团队取得了诸多令人侧目的CRISPR研究成果。去年十月，Doudna及其同事在Nature杂志上发表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶结构域构象状态直接控制了DNA切割活性。他们通过分子内荧光共振能量转移（FRET）实验，鉴定了HNH核酸酶结构域的一种激活构象。研究还证实，一个α-螺旋将HNH的构象改变传达给RuvC结构域，激活它实现DNA切割。

今年年初，Doudna团队揭示了CRISPR-Cas9准备剪切DNA时的关键分子结构。在CRISPR-Cas系统中，Cas蛋白与小CRISPR RNA（crRNA）形成复合体，切割与RNA互补的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一个典型特征，基因组编辑常用的sgRNA就会和Cas9形成R-loop。为了阐明R-loop的作用，研究人员通过冷冻电镜获得了酿脓链球菌Cas9 R-loop的高分辨率结构。

四月份，Doudna团队在细菌中发现了一种CRISPR相关的非经典Argonaute。Argonaute蛋白是真核生物RNAi的关键效应子，它也参与了原核生物的基因组防御。Doudna及其同事证实，CRISPR相关Argonaute具有与众不同的特异性。

五月份，Doudna团队在Molecular Cell杂志上发表文章，揭示了CRISPR介导免疫记忆的一个重要机制。已知CRISPR-Cas的外源序列插入受到严格调控，整合在CRISPR前导序列（富含AT）的末尾。Doudna及其同事发现，大肠杆菌E. coli获取外源序列需要蛋白IHF（integration host factor）。IHF结合前导序列并且诱导DNA弯曲，允许Cas1-Cas2整合酶催化外源序列插入。这项研究表明，CRISPR前导序列在外源序列捕获中起到了重要的作用。

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