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用RNA-seq快速绘制大脑图

妙手生春 2024-06-02 12:09:51

2016年09月14日讯 在过去的十年中,DNA和RNA测序技术已迅猛发展并且更加便宜,现在它们被运用到各种新的领域中。最近在《Neuron》发表的一项新研究中,研究人员使用RNA测序技术,在单个神经元水平上绘制小鼠的大脑图。这种新技术被称为Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing (MAPseq),可能比目前的方案更快和更容易。

这项研究的第一作者、冷泉港实验室Anthony Zador教授的研究生Justus Kebschull说:“有了MAPseq,我们试图查明单个神经元最终到达哪里。”Zador的团队积极开发MAPseq,因为缺乏高通量方法来跟踪单个神经元。

在这项新的研究中,研究人员向一个选定的脑区,注射了一种含有大量RNA分子的失活病毒。每个RNA分子都有其独特的“条码”序列,每一个都在一个神经元中结束,并通过轴突。几天之后,研究人员解剖大脑,收集和测定来自不同脑区的RNA条形码。

通过将来自注射脑区与其他脑区的RNA条码进行匹配,研究人员可以追踪单个神经元最终到达哪里。Kebschull说:“这是利用测序和条形码用于高通量神经解剖学的第一个例子。”

快速地映射连接

弄清神经元是如何连接的,是理解大脑如何运作的一个重要组成部分。Kebschull说:“如果你认为大脑就像一台计算机,我们就需要知道什么与什么连接在了一起,比如硬盘是否连接到了处理器。”

在目前的许多脑成像技术中,研究人员都是在神经元中表达一种荧光标记,并用显微镜观察哪些大脑区域发光。但是Kebschull说:“每一个脑区有数千个神经元。”这些“批量跟踪”方法不能区分单个神经元,因此,研究人员无法区分两个源神经元最终到了同一区域,还是不同的区域。这是重要的信息。“不同的神经元可能具有不同的属性,并可能携带不同的信息。”

其他的脑成像技术可以跟踪单个神经元,但这些方法都是劳动密集型的和费时的。Kebschull说:“跟踪一个单一的神经元需要数周的时间。如果你想研究成千上万个神经元,你基本上完蛋了。”相反,MAPseq用了一个星期的时间,就绘制出了一个注射脑区的几千个神经元图,速度发生了一千倍的提升。

Zador和他团队的灵感来自以前的脑成像技术,如Brainbow,研究人员随机表达荧光标记物来标记不同的神经元,具有各种各样多种的颜色。但使用显微镜能够容易区分的颜色数量有限,出于实际的目的,研究人员在这些模型中一次可以至多跟踪10个神经元。

Kebschull说:“有了MapSeq,我们考虑从颜色切换到随机核酸序列。”利用核酸条码序列,将提供更多样化的标志物,使用目前的高通量测序方法,这些可能是非常快速和相对便宜的读数。从30个核酸序列的一段序列开始,研究人员将最终获得1018个可能的序列,是小鼠大脑中神经元数量的10个数量级以上。

在2012年,Zador首次建议使用条码测序用于高通量的大脑映射,那么,研究人员必须弄清技术细节。他们决定使用一种无效的Sindbis病毒--在神经科学中常用的一种工具,来将条码RNA序列运送到小鼠的神经元中。但他们马上遇见了一种并发症。

Kebschull说:“人们认为是非复制型的病毒,其实是复制型的。”因此,病毒粒子传播超越了初级感染的神经元,来标记其他神经元,这将使得映射分析变得复杂化。对于新技术,Kebschull制备了一种重组Sindbis病毒,能感染神经元,但不传播,为进一步改进铺平了道路。

一旦RNA条码进入神经元,研究人员必须确保它们沿轴突运输到它们的终端。为此,他们添加了一种工程化的蛋白质,并表明它能有效地工作。此外,研究人员希望确保每个标记的神经元收到一个独特的条码,并且他们计算了必须注入多少病毒,才能实现这一目标。Kebschull和Zador也弄清了如何用高通量测序准确地识别条形码。

测试技术

Zador的团队在小鼠大脑蓝斑(LC)的一部分中测试了MAPseq,这个脑区是一种激素去甲肾上腺素的来源。去甲肾上腺素可调节警觉性和专注力,来自LC的神经元是否延伸整个皮质或只到达特定区域,尚不明确。Kebschull说:“LC是一个很好的测试案例。”

使用MAPseq,研究人员发现从LC神经元投射出许多各种各样的图案,一些神经元到达一个特定的靶标,其他神经元则伸展的更广泛。因此,来自LC的去甲肾上腺素可以到达整个皮质,以及在特定区域有更严重的影响,这与以前的研究结果一致。

目前的研究只使用一种病毒注射到LC,Zador和他的团队正在努力增加寻找其他病毒。最终,他们希望利用MAPseq同时跟踪整个皮层的神经元。Kebschull说:“我们正在扩大这种方法,以开展更多的高通量神经解剖学。”研究人员还计划在不同疾病的小鼠模型中使用MAPseq。“我们可以研究不同的自闭症或发育疾病小鼠模型,以探析大脑的连接是如何错误的。”

本文地址:http://dadaojiayuan.com/jiankang/298625.html.

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