Nature：利用CRISPR/Cas9鉴定出线粒体疾病背后的遗传秘密

Nature：利用CRISPR/Cas9鉴定出线粒体疾病背后的遗传秘密

2016年09月17日讯 在一项新的研究中，来自澳大利亚莫纳什大学莫纳什生物医学发现研究所等机构的研究人员鉴定出两个新的基因与线粒体疾病的一种主要病因相关联。他们的研究为更好地对线粒体疾病进行遗传诊断铺平道路，而且也可能有助于鉴定出用于治疗的潜在治疗靶标。相关研究结果于2016年9月14日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I”。论文通信作者为来自莫纳什生物医学发现研究所的David Stroud博士和Mike Ryan教授。

线粒体疾病是一种让患者缺乏能量、损伤肌肉和诸如大脑和心脏之类的主要器官的疾病。在澳大利亚，每5000名婴儿当中大约就有一人---或者说每周就有1名出生的澳大利亚婴儿---在出生时患有一种严重的线粒体疾病，这种疾病经常能够导致早逝。

Ryan教授说，他们不仅鉴定出两个新的基因ATP5SL和DMAC1与线粒体疾病的一种主要病因相关联，而且也发现30种蛋白组分在驱动线粒体运转的呼吸链酶复合体I 中发挥着重要作用。

Ryan教授说，“如此多不同的基因促进我们的线粒体发挥功能的事实解释着为何如此多的病人仍然未被确诊---它是一种复杂的疾病。”

线粒体是我们的细胞的能量工厂，从我们吃的食物中获得糖和蛋白，并将它们转化为我们的身体能够使用的能量。这一过程给我们提供我们的身体正常运转所需的90%以上的能量。

在患有线粒体疾病的病人当中，线粒体不能够产生这种能量，这能够导致器官功能衰竭，而且潜在地导致死亡。

为了揭示线粒体疾病的一种主要病因背后的遗传秘密，研究人员研究了呼吸链酶复合体I，即协助驱动线粒体的引擎之一。Ryan教授说，相比于细菌呼吸链酶复合体I，人呼吸链酶复合体I是由30多种蛋白组分组成的。

Ryan教授说，“这总是一个秘密，这是因为细菌呼吸链酶复合体I和人呼吸链酶复合体I具有相同的总体功能。”

“我们的研究表明几乎所有附加的蛋白组分对人健康是至关重要的。”

利用一种前沿的被称作CRISPR/Cas9的基因编辑技术，研究人员对一系列细胞进行修饰而让它们具有一种不同的遗传组分---每个细胞类型缺乏一个独特的与仅在人类中发现的呼吸链酶复合体I蛋白相关联的基因。他们开发的这种方法可能能够在全世界的实验室中被用来研究更多的导致线粒体疾病的基因。

Ryan教授说，人类拥有的额外的蛋白组分可能让人呼吸链酶复合体I要比在细菌中发现的呼吸链酶复合体I更加稳定。

“这可能是必需的，这是因为我们的细胞要比每20分钟发生分裂的细菌存活更长的时间。”

研究人员发现的这两个新的基因参与组装呼吸链酶复合体I。Stroud博士说，他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术证实让他们鉴定出的这两个新的基因中的任何一个发生突变都会破坏呼吸链酶复合体I和线粒体功能。

Stroud博士说，“如今在全世界，这两个新的基因能够被加入到遗传筛查清单中，这将导致更早地诊断出更多的患有这种疾病的人。”

基于CRISPR/Case9全基因组敲除文库筛选功能基因

1. 文库构建：针对某个物种，每个基因设计3个或以上的sgRNA，高通量合成sgRNA，然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒载体中。

2. 慢病毒转导：包装GeCKO慢病毒文库，并以低MOI（一般标准<0.3）感染靶细胞，保证一个病毒颗粒感染一个细胞，筛选同时表达sgRNA和Cas9的细胞；每个细胞都只会敲除自身携带的sgRNA对应的一个基因，细胞文库中包含的细胞的数量一般为细胞文库中全部sgRNA数量的100-1000倍。

3. 表型筛选：将全基因组敲除细胞库分成两份，其中一份作为实验组施加筛选压力，如：病毒侵染，药物治疗等；另一份作为对照组。根据耐药性、增殖能力、存活能力等表型筛选细胞。

4. 候选基因的分析：将实验组和对照组的细胞分别抽提基因组，PCR扩增sgRNA片段，高通量测序，并进行生物信息学分析。

根据筛选目的的不同，分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选是对已成功整合sgRNA的细胞文库施加一定的筛选压力，仅使少数目的表型的细胞能够存活，达到富集关键基因的目的。阴性筛选与之相反，存活的细胞并不是目的表型细胞，需要比较不同时间点sgRNA的丰度找出差异sgRNA来确定关键基因，阴性筛选可以鉴定出引起细胞某些功能缺失的基因，如筛选时间较长，可以筛选到细胞生存所必需的基因。

个人理解：阳性、阴性筛选或者正向、负向筛选听起来容易混淆，其实在英文中就2个词，positive selection和negative selection，无论怎么选择，最后都是看sgRNA的计数情况，然后根据实验目的确定候选基因。如果最后选出的细胞内富集的sgRNA所靶向的基因就是我们要的目的基因，那么这种选择我们称其为positive selection。相反，如果最后富集的sgRNA并不是我们实验想要的，我们通过比较不同时间点的sgRNA变化进而推断候选基因，这样的选择称之为negative selection。举个例子，我们要筛选细胞生长的必需基因，如果把这个基因敲除了（这个基因由其对应的sgRNA作为标记，每个细胞内都敲除了一个基因），那么细胞肯定不能存活了，对应的sgRNA肯定也不会富集。所以存活的细胞意味着没有敲除必需基因，随着细胞的增值，整合到其基因组上的sgRNA大量富集，我们最终测到了这些sgRNA，但其靶向的基因敲除了并不影响细胞生长，所以这些基因不是目的基因。因此我们比较不同时间点sgRNA的消耗情况，那些sgRNA明显减少的，其靶向的基因才是必需基因。

那么什么情况下是positive selection？我们知道，这两者是反的，所以假如我们想筛选细胞生长的抑制基因（和必需基因相反），这种情况就属于positive selection（和negative selection相反）。如果敲除了抑制基因，显然细胞可以正常增值，抑制基因对应的sgRNA也能不断富集，这两个方向是相同的。

如果富集sgRNA靶向的基因就是目的候选基因，则为positive selection，否则为negative selection。

①筛选炭疽毒素使细胞中毒所必需的宿主基因

由于毒素的强选择性压力，大多数细胞都会死亡，只有少量的细胞存活和增殖，这些存活的细胞内富集了大量sgRNA，而这些sgRNA靶向的基因是被敲除的，这些基因就是使细胞中毒所必需的宿主基因，正是由于这些目的基因被敲除，细胞才得以存活。

Zhou等（2014）利用敲除文库筛选，在初步确定的291个基因中成功鉴定出炭疽和白喉毒素致细胞中毒所必需的宿主基因，并通过功能验证得到了证实。

②筛选药物敏感基因

细胞若含有药物敏感基因将失去抗药性。若敲除了敏感基因，则可以存活，最终富集的sgRNA正是实验目的需要的sgRNA。

①鉴定细胞生长必需的基因

一个时间段内的连续生长，减少的细胞中往往携带靶向细胞增殖所必需基因的sgRNA。这些基因可以通过比较每个sgRNA的相对频率来找到。阴性筛选的一个重要应用是鉴定癌细胞生长所必需的基因，而这些基因可能成为治疗癌症的新靶标。

2014年，Shalem等首次利用GeCKO文库鉴定出人黑色素瘤细胞和多能干细胞存活的关键基因，研究结果与RNAi筛选结果高度一致。

②筛选药物抗性基因

若敲除了抗药性基因，细胞在药物压力下不能存活，存活的细胞内并没有敲除目的基因，最终富集的sgRNA不是目的sgRNA，需要通过与对照组比较sgRNA消耗情况（或不同时间点的sgRNA丰度）来确定目的基因。

1. 测序数据质控，去除低质量的reads，使用clean reads data进行后续分析。

2.比对分析：将测序数据中拼接reads与sgRNA 文库序列比对，并对sgRNA 文库中完全匹配的sgRNA 数目、丢失sgRNA、基尼指数等进行统计。

?Reads: Total number reads in the fastq file. (Recommended: 100~300 times the number of sgRNAs)

? Mapped: Reads that can be mapped to gRNA library

? Percentage: The percentage of mapped reads (Recommended: at least 60%)

? TotalsgRNAs: The number of sgRNAs in the library

? ZeroCounts: The number of sgRNA with 0 read counts(Recommended: no more than 1%)

? GiniIndex: The Gini Index of the read count distribution. Gini index can be used to measure the evenness of the read counts, and a smaller value means a more even distribution of the read counts. (Recommended: around 0.1 for plasmid or initial state samples, and around 0.2-0.3 for negative selection samples )

3.sgRNA 及基因的read counts 统计

CRISPR全基因组筛选的主要内容便是统计sgRNA在不同样本间的消耗和富集情况，进而推断候选基因。

4.主成分分析和样品相关性聚类分析

有助于考察样本间的相似性和差异，评估实验设计的合理性以及对后续数据分析起到一定指导作用。对于有重复的实验来说，样本同一处理不同重复应该尽可能聚在一起，若存在个别重复样本明显偏离，可以考虑剔除该样本。样品聚类还可用于判断数据处理中是否剔除了批次效应。

5.候选基因筛选

MAGeCK-RRA算法根据测序结果中sgRNA的富集情况产生对应基因位点的RRA得分，RRA得分代表基因的必要性，RRA得分越小表明其重要性越高。MAGeCK返回RRA lo value（neg|score、pos|score）检验统计显著性，并据此对基因进行了排序，按照实验目的的不同，候选基因筛选可分为正向筛选和负向筛选，筛选指标一般参考lfc（log2 fold change）和FDR（adjusted-pvalue），比如：根据lfc<-2且FDR<0.05进行负向筛选，lfc>2且FDR<0.05进行正向筛选。

6.GSEA富集分析

对CRISPR筛选得到的候选基因进行富集分析以了解基因的更多功能，同时也可以对CRISPR筛选结果进行验证，以便对潜在候选基因开展进一步研究。

参考文献：

[1]刘燕飞. 基于CRISPR/Cas9技术的HeLa细胞全基因组敲除文库的建立及初步应用[D].中国农业科学院,2020.

[2]Shalem,Ophir, et al. “Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.”Science, vol. 343, no. 6166, 2014, pp. 84–87.

[3]Zhou, Yuexin, et al. “High-Throughput Screening of a CRISPR/Cas9 Library for Functional Genomics in Human Cells.” Nature, vol. 509, no. 7501, 2014, pp. 487–491.

[4]Kweon, Jiyeon, and Yongsub Kim. “High-Throughput Genetic Screens Using CRISPR-Cas9 System.” Archives of Pharmacal Research, vol. 41, no. 9, 2018, pp. 875–884.

[5]Li, Wei, et al. “Quality Control, Modeling, and Visualization of CRISPR Screens with MAGeCK-VISPR.” Genome Biology, vol. 16, no. 1, 2015, pp. 281–281.

[6]Wang, Binbin, et al. “Integrative Analysis of Pooled CRISPR Genetic Screens Using MAGeCKFlute.” Nature Protocols, vol. 14, no. 3, 2019, pp. 756–780.

人类有没有可能是外星人？

外星人的最终形态很可能完全与人类不同，甚至不能称之为“人”，是我们无法想象的生命形态。
外星人是人类对假象中的地球以外类人生命的统称。
古今中外一直有关于外星人的遐想，但现今人类还无法实际探查是否有外星人存在，虽然一直以来，很多人声称自己见证外星人造访地球，甚至与自己发生接触，但是大多数学者专家相信，人类与外星人所谓不同程度的接触，其实都是心理作用，人类发现"外星人"的机会很小，即使发现有外星人的存在，也几乎很难与它们发生任何接触。

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