刘澎涛博士Nature：单细胞RNA-seq新成果

刘澎涛博士Nature：单细胞RNA-seq新成果

2016年09月26日讯 在国际顶级学术期刊《Nature》发表的一项研究中，来自英国威康信托基金会桑格研究所、香港中文大学、上海农科院、上海交通大学、剑桥大学和墨尔本大学等处的研究人员，通过对骨髓（BM）先天淋巴细胞（ILCs）进行单细胞RNA测序（scRNAseq），确定了不同的ILC前体细胞亚群，描述了不同的ILC发育阶段和途径，并发现PD-1可以作为先天淋巴祖细胞和效应物ILCs的一个新型标记。这提供了新的治疗机会，来操纵ILCs实现最佳的免疫反应。

英国威康信托基金会桑格研究所资深研究员刘澎涛（Pentao Liu）博士是这篇文章的资深作者。刘博士早年毕业于河南师范大学，1998年博士毕业于美国贝勒医学院，之后在马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所工作。2003年加盟英国威康信托基金会桑格研究所研究员，2010年晋升为资深研究员和课题组长，2011年起在剑桥大学干细胞研究所兼职。2005年至今担任过包括辉瑞在内多家生物医药公司之科学顾问，擅长化学基因组研究，先后发表学术论文70多篇。

2015年1月，刘澎涛博士带领的一项新研究，确定了一个基因在侵袭性的乳腺癌亚型中尤其活跃。该研究表明，这一过度活化的BCL11A基因驱动了三阴性乳腺癌的形成和发展。相关论文发表在《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。

2015年9月，在国际著名学术期刊《Genome Biology》发表的一项研究中，刘澎涛博士联手剑桥大学、上海交通大学等处的研究人员，采用单细胞转录组分析来解析造血干细胞（HSCs）的分子异质性。这项研究论证了单细胞转录学用于解析干细胞区室中的细胞过程和谱系异构性的效用。

这项新研究指出，先天淋巴细胞（ILCs）在细胞毒性和细胞因子生产方面与T淋巴细胞功能相似，但缺乏抗原特异性受体，是免疫反应和组织体内平衡中重要的调节因子。ILC是由常见的淋巴系祖细胞（CLPs）生成的，它们后来定向分化为α淋巴祖细胞（αLP）中的先天淋巴细胞谱系、早期先天性淋巴祖细胞（EILP）、一般辅助型先天淋巴样祖细胞（CHILP）和先天淋巴样细胞祖细胞（ILCP）。ILCs由常规的NK（cNK）和辅助样细胞组成：ILC1、ILC2和ILC3。尽管最近的进展，细胞的异质性、生长轨迹和ILC祖细胞的信号依赖性，仍然没有得到全面的理解。

在这项研究中，研究人员通过对骨髓（BM）祖细胞进行单细胞RNA测序（scRNAseq），来揭示先天淋巴细胞（ILCs）前体细胞亚群，描述不同的ILC发育阶段和途径，并发现程序性死亡1高表达（PD-1hi）标志着一个基本上与ILCP相同的定向ILC祖细胞。这些数据将PD-1hiIL-25Rhi定义为ILC2发育中一个早期检查点，可通过Bcl11b-缺陷抑制，但是可通过IL-25R过表达而得以恢复。类似于T淋巴细胞，PD-1在激活的ILCs上是上调的。施用PD-1抗体可减少PD-1hi ILCs，并减少感冒病毒感染模型中的细胞因子水平，并阻断木瓜蛋白酶诱导的急性肺部炎症。这些结果为探索免疫疗法中的PD-1/PD-L1提供了新的视角，并使科学家能够对疾病预防和治疗的免疫系统进行有效的操作。

CITE-seq：同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序

单细胞测序方法和原理系列：

CITE-seq是一种能够同时测定数千个细胞的无偏差转录图谱和基于抗体检测的蛋白标记物的技术。研究发现，这种方法可以同时适用于两种不同的高通量单细胞测序，并通过实例显示出，该方法比单独的单细胞测序数据能够得到更加详细的细胞表型特征。
CITE-seq这个方法在2017年的时候发表在nature methods上。作者还建了一个网站： www.cite-seq.com

ADT (antibody derived tags) 概念：被测序测到的“从抗体衍生出来的标签”的数量。可以近似地认为， ADT就是抗体所对应的蛋白在一个细胞上的表达量 。但要注意的是，这里只是一个近似值，因为不同抗体对抗原的亲和力是不一样的。

CITE-seq由mRNA测序和对带标签的抗体测序组成。单细胞测序的部分和10X的原理是一样的，参考： 单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics 。只是CITE-seq在原有单细胞测序的基础上加了抗体，抗体可以结合到细胞表面相应的蛋白上，抗体上带有特殊的DNA标签。

带有DNA标签的抗体：
抗体的设计使得它1）能够被基于寡聚dT建库的RNA文库所捕获；2）含有用于区分抗体条形码序列；3）能够进行后续的PCR特异扩增。
使用链霉素-生物素亲和反应将抗体与寡核苷酸的5’端连接起来，同时还包含了一个二硫键，于是在还原条件下寡核苷酸便能够从抗体上释放出来。

首先将抗体和单细胞悬液一起孵育（和流式类似），抗体和细胞结合后洗去未结合的抗体，随后样本即可对接10x技术被分成油包水小液滴。

细胞裂解后，mRNA和与抗体结合的寡核苷酸通过它们3’端的polyA尾巴，同时与含有polyT的微珠发生退火而结合在一起。在反转录时，与微珠结合的一段特殊的条形码序列能够区分来自于不同细胞的mRNA和与抗体结合的寡核苷酸序列。而扩增了的来源于抗体的序列（ADTs）和cDNA分子能够通过大小区分开，并将其构建为独立的Illumina测序文库。

需要注意的是，两个文库类型是可以同时进行测序的，但考虑到测序深度问题，由于它们是单独构建的，因此可以将它们合并在单一泳道中并调整它们的相对比例，以确保每个文库都能获得适当的测序深度。
文库制备好之后就可以进行测序了

1. 同时测mRNA+蛋白信息，数据更丰富，对细胞的注释更准确，有助于发现新的细胞类型。
2. 由于barcode的存在，CITE-seq检出的mRNA+蛋白是可以对应的，可就是说是可以同时得到每个细胞的mRNA+蛋白表达量。
3. 与流式细胞相比，CITE-seq又可以不受抗体之间信号干扰的影响，大大增加了表面蛋白标记的数量(一次可以检出多达100个的蛋白)，从而可以一次性获得多种由抗体蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果关注点在细胞蛋白上，ADTs可以独立于细胞的mRNA而单独测序、分析，即已报到的Abseq。
4. CITE-seq能够与10X Genomics无缝衔接，方便易操作。

参考：
CITE-seq可以同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序
Total-seq的前世今生——前世：CITE-seq

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