核酸突变分析方法抉择:,PCR、杂交、NGS？

核酸突变分析方法抉择:,PCR、杂交、NGS？

2016年10月20日讯 日前，以"精细管理、精准医疗"为主题的2016届CSCO学术年会在厦门落下帷幕，精准检测作为临床实践中实施精准医学的第一步，成为本届CSCO学术年会的热点话题。来自不同企业的分子诊断技术百花齐放百家争鸣，面对新技术与成熟技术的较量，在"精准医学"时代下，如何选择合适的检测技术，实现精准治疗成为新医学形态下人们亟需解决的问题。

近期，美国莱斯大学DmitriyKhodakov教授在国际知名期刊《Advanced Drug Delivery Reviews》（IF=15.606）发表的综述文章，也许能给我们一个答案。该文对精准医学关键的基因检测技术手段进行了梳理，作者认为目前实现临床转化的核酸检测技术可以分为三大类：PCR技术、杂交技术和测序技术，介绍了这三类技术，并对其临床应用发表了自己的见解。以下是对该文主要内容的介绍。

一、PCR技术

PCR技术是目前应用最广泛的DNA分子检测技术。与杂交技术和测序技术相比，PCR技术优势主要在于、高敏感度、易于推广。其主要局限在于多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限。

1、ARMS

扩增阻滞突变系统（ARMS）是使用广泛的一种核酸变异检测技术，已有多家公司开发出基于此技术的肿瘤突变基因检测试剂盒产品，如Qiagentherascreen、Roche Cobas、BiomerieuxTHxID以及中国的AmoyDx等。

2、Blocker PCR

Blocker PCR技术通过引入blocker序列来抑制野生型基因扩增从而达到检测核酸变异位点的目的。目前已有基于此技术的肿瘤基因突变检测试剂盒产品问世，如PNA Bio开发的PNAClamp试剂盒。

3、多重PCR

多重PCR技术需要解决扩增抑制、荧光基团的数量限制、引物二聚体等问题，其工程学解决方案主要通过开发设备和一次性芯片等来解决。Biofire Diagnostics（现被Biomerieux收购）和Cepheid都开发出用于感染性疾病诊断的多重PCR试剂和仪器。

4、数字PCR

数字PCR技术通过将一个样本分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子（DNA模板），在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，从而实现高灵敏的绝对定量检测。目前数字PCR主要用于科研及临床研究，也有开发LDT方法用于临床，如Trovagene PCMBRAFV600E试验。

二、杂交

杂交是一种将合成的DNA探针或引物与目标序列结合的过程。与PCR技术和NGS技术相比，杂交的主要优点在于操作简单、可多重检测、结果可靠，其缺点主要在于该方法不能进行序列扩增，因此必须依赖于信号放大技术或者高灵敏的检测设备。

1、微矩阵

微矩阵通过靶基因与固定在芯片上的探针发生特异性杂交，结合在芯片上不同位置的探针对应不同突变，荧光强度代表浓度，从而实现一次检测多种基因突变或者基因表达水平的目的。因此，其检测灵敏度取决于靶基因和探针的杂交效率及荧光显微镜的分辩能力。FDA已批准多个微矩阵技术产品，如Agendia开发的用于乳腺癌检测的MammaPrint试剂盒等。

2、荧光条形码单分子检测技术

荧光条形码单分子检测技术是一种高通量检测技术。可分为两大类：intensity barcodes和geometric barcodes，intensity barcodes在二氧化硅颗粒上标记不同密度的荧光标记，通过捕获有目标基因的颗粒的荧光信号来检测突变类型；而geometric barcodes是利用光谱上不同的荧光基团的组合来检测不同序列。其中Luminex开发的基于intensity barcodes方法的呼吸道疾病诊断技术已获得FDA批准。

3、原位杂交（ISH）

原位杂交不仅提供目标基因的序列和浓度信息，而且可实现目标基因的细胞定位，尤其适用于异质性细胞及组织样本的基因扩增检测。原位杂交技术有荧光原位杂交（FISH）、显色原位杂交（CISH）或者银染原位杂交（SISH）等，原位杂交技术可应用于DNA和RNA的检测，目前，FISH主要用于DNA扩增检测，如Roche和Abbot开发的HER2扩增检测试剂盒。

三、新一代测序技术（NGS）

NGS是一种高通量检测DNA和RNA变异的方法，与Sanger测序不同，NGS可检测多种样本，且可以同步提供大量的基因变异信息，因此该方法非常适合于并行检测和分析多种基因和变异信息。

没有一种方法是完美的，由于背景信号干扰、酶的扩增错误率、化学反应不彻底等问题，所有的NGS平台都有一定的内在错误率。而测序过程中的错误会增加突变检测的难度，特别是低频突变。

1、主流NGS平台

主流NGS平台有Illumina和IonTorrent的的NGS系统，Illumina在序列错误率和成本控制上处于领先地位。在诊断应用方面，Illumina开发有Miseq和NextSeq两个平台，其中MiseqDx是首个获得FDA许可用于IVD的NGS平台。

2、其他平台

其他平台还有：适用于长序列检测的SMRT NGS平台（Pacific Bioscience），以及Nanopores NGS平台（Oxford、Genia Technologies）等。

四、作者观点

NGS实验操作复杂且成本高，由于其高通量的序列分析能力，已经成为许多序列变异分析与科研应用的主要选择。然而，从临床诊断应用的角度，检测的目标位点必须具有明确的临床价值，因此相对于NGS技术而言，PCR技术的简便性、稳定性和使用的广泛程度意味着在未来一段时间内PCR技术依然是核酸突变位点检测的不二选择。

在可预见的未来里，技术的发展将扮演重要的角色。虽然NGS技术单位通量价格在近10年极大地降低，但是依然离整个基因组或转录水平的全面深度测序至少6个数量级的差距。DNA序列变异分析的优化和创新将主要集中在价格，准确性，运行周期，操作复杂度和实验室的规范化等方面。

核酸分子杂交的主要实验方法有哪些？主要用途是什么

1.分类：根据杂交对象的不同可分为：DNA与DNA；RNA与DNA。另外，根据杂交对象位置的不同可分为：固相杂交,液相杂交,原位杂交。
2.用途：可通过特定序列的探针检测样品中是否含有与之同源的核酸序列.基因克隆的筛选,酶切图谱制作,基因组中特定基因序列的定量和定性检测,基因突变分析,疾病的诊断、微生物病原体检测.

PCR的原理是什么

PCR原理：

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

扩展资料：

特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

参考资料：百度百科——PCR扩增

数字PCR检测方法如何选择？

数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

在定量PCR时，我们常常纠结一个问题，究竟是相对定量还是绝对定量呢？如今，你无需纠结了，因为数字PCR（digital PCR）来了。尽管这两种技术有些类似，都是估计起始样品中的核酸量，但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

原理

PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。

数字PCR可以实现更高准确性、灵敏度和绝对定量

数字PCR是一种核酸检测和定量分析的新方法，可以作为传统实时定量PCR的替代方法，以实现绝对定量及稀有等位基因的检测。数字PCR的工作原理在于将DNA或cDNA样品分割为许多单独、平行的PCR反应，部分这些反应包含了靶标分子（阳性），而其他不包含（阴性）。单个分子可以被扩增一百万倍或更多。在扩增期间，TaqMan化学试剂及染料标记探针可用于检测特定序列的靶标。当不存在任何靶标序列时，没有信号累积。PCR分析后，阴性反应片段用于生成样品中靶标分子的绝对计数，而无需标准品或内标。??

纳流芯片的使用提供了便捷和直观的机制来同时平行运行上千个PCR反应。每个孔都加入了样品、扩增混合物和 TaqMan测定试剂的混合物，然后进行单独分析以检测存在（阳性）或不存在（阴性）终点信号。考虑到孔可能接收到多个靶标序列分子，使用泊松模型应用了一个校正因子。

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以上来自网络。

核酸检测具体步骤

1、核酸提取使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。

2、逆转录合成cDNA。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。

3、PCR扩增反应PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法。

4、扩增产物定性分析；扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。

5、结果判定和完成报告单：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。

扩展资料：

检测新型冠状病毒特异序列的方法最常见的是荧光定量PCR。因PCR反应模板仅为DNA，因此在进行PCR反应前，应将新型冠状病毒核酸逆转录为DNA。在PCR反应体系中，

包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；

如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。

每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高， Ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。

参考资料： ? 百度百科——核酸检测法

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