重大喜讯！Bio-Rad公司微滴数字PCR系统QX200获得欧盟CE,IVD认证

重大喜讯！Bio-Rad公司微滴数字PCR系统QX200获得欧盟CE,IVD认证

2016年3月1日讯 美国伯乐公司（Bio-Rad Laboratories Inc., 以下称Bio-Rad公司）上周四宣布它的微滴数字PCR产品，QX200? Droplet Digital? PCR （ddPCR?） 系统，获得欧盟体外诊断产品CE认证（CE IVD marking），这也是欧盟体外诊断（in vitro diagnostic, IVD）领域首个获得CE认证的数字PCR系统。

因为获得CE认证，欧盟的执业医师就能够使用这种QX200系统进行高准确地定性和定量检测核酸，从而有助于在治疗包括从癌症到移植排斥和病毒感染在内的疾病时作出临床决策。

Bio-Rad公司数字生物学部门执行副总裁Annette Tumolo说，“作为一种诊断工具，我们的系统检测速度比较快，而且是有成本效益的，这就使得它非常适合将人们对精准医疗的期望变成现实。”

QX200 ddPCR系统将会快速影响癌症精准医疗的一个方面是液体活检（Liquid Biopsy），即一种越来越流行的用于非侵入式检测肿瘤基因型、追踪治疗效果和预测癌症复发的技术。这种液体活检技术大有希望用于指导治疗决策。前瞻性试验当前正在开展以便评估液体活检技术在临床上的有效性，特别是，与微滴数字PCR和下一代测序技术结合使用在分析基因组变异上的实用性。

自从2011年以来，微滴数字PCR技术仅供研究使用。这种技术将DNA或RNA样品划分为20,000个微滴，然后对每个微滴内的靶序列进行扩增，从而允许科学家们精确地定性和定量检测低浓度的靶DNA或RNA序列。它具有一系列重要的基因组应用，包括癌症突变检测、基因拷贝数确定、病毒载量监控和基因编辑检测。

关于Bio-Rad公司

Bio-Rad公司开发、制造和销售范围广泛的创新产品和用于生命科学研究和临床诊断市场的解决方案。该公司因对质量和顾客服务的承诺而在大学、研究所、医院、公共卫生和商业实验室以及生物技术、制药、食品安全行业闻名于世。创建于1952年的Bio-Rad公司总部位于美国加州赫苦斯市（Hercules, California），通过它的全球运营网络给100,000多个研究领域和健康医疗领域的客户提供服务。该公司在全世界拥有7,700多名员工，2015年收入超过20亿美元。

数字PCR（二）— Bio-rad ddPCR

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变

A：最低微滴上样量是和您的实验的突变比例灵敏度需求相关的，人类cfDNA的具体上样需求，可见下表

A：按照泊松分布原理，小于等于5 copies/droplet（100000copies/20ul）的核酸浓度，都能保证总体内有空余微滴存在，通过统计学换算，都可以保证结果稳定，并非必须要求每个微滴单拷贝。20,000个微滴对应的是100,000个拷贝的核酸。即使总微滴数有损失，一般15,000个微滴对应的检测上限也应该是75,000个拷贝。
理论上讲只要有还有1个阴性微滴，ddPCR基于Possion分布都能计算出样本的含量，但是CV%会非常大。可以接受的动态范围是CV%<5%的样本含量范围。对于任何dPCR平台，最佳样本浓度都是λ=0.16时对应的浓度，这个时候CV%是最小的（~1.5%），对应就是最佳上样量了。不过在实际测试中，样本浓度在平台要求的动态范围之内都是OK 的
对于20000个微滴，样本浓度的上限（理论上λ=5.5），对应的阳性微滴比例为99.6%，阴性微滴的比例为0.4%，对应阴性微滴的数量是80个。也就是阴性微滴数超过80个是OK的。其实理论上还可以更少，但是考虑到其他不确定度，这个数比较接近实测结果

答：微滴数量低于9000个，从统计学角度来说，抽样量太少，无法使用泊松分布校正，尤其对于高浓度样本来说，定量误差会比较大，检测上限也会降低。如果存在复孔，由于复孔间所有微滴都是独立反应体系，所以可以合并分析复孔数据，将多孔视作一孔。
对于QX200系统来说，如果反应体积是20微升，那么生成的微滴数在20000个左右。实际检测少于20000个，往往来源于系统的死体积、微滴转移时的损失及其他不确定因素。也就是说，微滴制备后，靶标核酸已经随机分布在20000个微滴中，阳性微滴的百分比已经确立，那么后续分析的微滴数量不到20000个，对定量的结果也是无影响的（浓度适合的样本）。实际上我们也遇到过，相同的样本，不同的批次检测，总微滴的数量从4000-20000不等，但是定量的结果无差别。注意，以上的说法前提是“浓度合适的样本”，如果样本浓度太高和太低时，分析的总微滴数偏少，会增加又一个环节的subsampling error,定量的准确性和精度就会受影响了。所以为什么定义8000个微滴，一方面是基于质控的角度。未达到这么多微滴，肯定是有问题的，建议重做；另一方面，对于浓度超高或超低的样本，8000个微滴带来的误差仍小于样本本身取样误差带来影响。

A：样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质，生成微滴时的环境温度，PCR时的等因素会影响微滴数量。血液样本中主要判断为蛋白残留以及提取过程中没有除尽的酒精。

答：引物探针一般都是用水或TE溶解，且在整个20微升反应体系内占比很少，所以对最终反应体系的离子强度或pH影响极低。且ddPCR反应预混合本身就是缓冲液，能维持相对稳定的pH。样本一般也是TE或纯水洗脱，如果提取没有问题的话那对体系也基本没有影响，唯一可能的情况是极高的盐离子浓度提高了微滴渗透压影响了内外相平衡，但一般人血为等渗溶液，不会有这么高的盐浓度，除非提取试剂盒有问题，过柱浓缩时洗不掉样品中过高的离子浓度。相比样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质来讲，离子对微滴的影响微乎其微。

A：最终测得有效微滴数量超过10,000个，1维图中微滴高度没有出现阶梯式排布，即可认为微滴稳定。

A：ddPCR实验有效性需要分几个方面区分：

理论灵敏度为1个拷贝核酸。实际灵敏度针对您的不同Assay及不同提取手段是需要具体分析的，重复性在不同Assay的不同的浓度范围内也是不同的。您需要参考文献、自身实验、或FDA医疗器械注册时的验证数据。
对于一台PCR仪器一般很少有用分析灵敏度的说法，因为每一种不同的序列都可以判断为不同的分析物，同一种方法针对不同分析物的LLD、BLD、AS、FS都是不同的，需要精确到不同的应用方向和应用试剂。

A：Bio-Rad不同的ddPCR supermix产生的微滴体积都有差别，这就是为什么要在setup实验时，要在软件中正确选择对应的supermix种类，软件会自动调用对应试剂的微滴体积进行计算。不同试剂的微滴体积，在研发时已经通过测试获得并应用于quantasoft软件的计算中

A：1.单孔微滴数量不够，2. 单孔样本上样量不够，3. 需要计算技术重复间的平均值和置信区间。如果实验中有perform技术重复，通常情况下建议merge各技术重复的微滴进行分析，可提高数据的精确度

A：双重ddPCR实验中，如果两重反应间互有干扰或竞争（表现形式一般为四团微滴无法处于矩形的线上），则使用索套法划分微滴会更精确。（如有实例，可现场讨论）

这两个定量结果其实并不矛盾。但对于ddPCR开发的mutation detection assays, 到底该用拷贝数还是用突变率作为LOD仍然有待讨论。对于Liquid biopsy来说，可能两个检测结果同时分析才更有实际指导意义。个人倾向于用拷贝数浓度，而野生型的结果是必不可少的IPC。突变比例的测定可能会受样本制备的影响。

如果加入新的荧光标记或者阴性微滴的本底荧光信号出现负值时，需要校正补偿。

数字PCR的技术发展

20 世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
数字PCR技术不断发展，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。
QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，相继推出了QX100、QX200微滴式数字PCR系统。
与其他数字PCR技术不同，Bio-Rad对样品进行微滴化处理。据该公司基因表达部门的销售经理Richard Kurtz介绍，他们的独特优势是能够产生非常均一、重复的1纳升液滴。这样的好处是每个样品形成20,000个液滴，而其他系统只能分成760-3,000个部分。分得越多，则意味着分析越准确。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

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