Mol,Cell：科学家揭示DNA断裂被修复的分子机制

Mol,Cell：科学家揭示DNA断裂被修复的分子机制

2017年2月5日 讯 /生物谷BIOON/ --日前，一项刊登在国际杂志Molecular Cell上的研究报告中，来自达姆施塔特工业大学的研究人员通过研究发现，修复DNA损伤的过程或许远比我们想象之中要复杂得多，DNA双链破碎的末端结构或许并不仅仅是加入进去那么简单，其首先会发生一种精细化地改变以便原来的遗传信息能够被储存起来。

DNA作为携带遗传信息的载体，其容易发生持续性地损伤，其中最严重的损伤就是DNA双链断裂，双螺旋结构就会被一分为二，如果细胞中类似的DNA损伤不能够被有消修复的话，重要的遗传信息就会出现缺失，这时候就会伴随细胞死亡的发生，或者诱发永久性的遗传改变以及细胞转化；随着人类机体进化，机体中修复DNA损伤的方法也会不断革新，在DNA损伤修复过程中很多酶类都会一起发挥作用来最大限度地恢复DNA中的遗传信息。

目前有两种修复DNA双链破碎的方法，其在精确性和复杂性上存在一定差异，其中一种最简单的方法就是非同源性末端接合（non-homologous end joining），即尽可能快速地将两个断裂的末端进行连接，但这种方法并不会注重准确性地恢复损伤的遗传信息；而第二种方法就是同源重组，这种修复方法能够利用姊妹拷贝中精确同一的遗传信息来以较高的准确率修复损伤的DNA。然而诸如这样的子代拷贝仅会在分裂的细胞中存在，在细胞分裂之前遗传信息就会被复制。

研究者Markus Lobrich教授表示，我们很难理解在非同源性末端接合修复过程中重要的遗传信息如何发生会发生丢失，随后我们在进行连接修复之前检测了在末端破碎发生过程中的酶类过程，相比此前研究者的认知而言，破碎的末端似乎并不容易连接上，而且破碎断裂处还会被特殊的酶类所改变，因此缺失的遗传信息往往就会作为DNA破碎出现地结果，而在另一个拷贝的帮助下就可以对损伤的DNA进行修复。

破碎末端发生的改变往往会让研究者想起同源重组过程，也就是姊妹拷贝会扮演一种用于精确修复的基质；在不分裂的细胞中并没有DNA的姊妹拷贝，研究人员并不清楚用于精确修复的遗传信息拷贝来自哪里；本文研究同时也提供了一些清晰的证据，即不发生分裂的细胞或许能够作为遗传信息的拷贝来进行DNA双链断裂的修复过程；同时本文研究对于科学家们开发新型基因疗法来治疗多种遗传性疾病也提供了新的线索和希望。

CRISPR-Cas9基因编辑技术简介

CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。

一、什么是CRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。

C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。

1、CRISPR（/'kr?sp?r/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）

CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。

①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。

②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。

③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。

2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。

Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。

依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。

第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。

第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。

目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。

二、CRISPR-Cas9的作用原理

对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。

1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ）

CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。

新间隔序列的获得可能分为三步：

第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。

第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。

第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。

2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）

CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。

crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。

3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰）

crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。

随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。

三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用…

tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。

CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

CRISPR-Cas9的广泛应用

1、基因敲除（Knock-out）

Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除

2、基因敲入（Knock-in）

当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率

3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）

Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。

4、多重编辑（Multiplex Editing）

将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。

5、功能基因组筛选

利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

有关DNA的资料

DNA（脱氧核糖核酸）是核酸的一类，因分子中含有脱氧核糖而得名。

DNA分子极为庞大（分子量一般至少在百万以上），主要组成成分是腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。DNA存在于细胞核、线粒体、叶绿体中，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。大多数已知噬菌体、部分动物病毒和少数植物病毒中也含有DNA。

除了RNA（核糖核酸）和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。1953年，詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克描述了DNA的结构：由一对多核苷酸链相互盘绕组成双螺旋。他们因此与伦敦国家工学院的物理学家弗雷德里克·威尔金斯共享了1962年的诺贝尔生理学或医学奖。

50年前发现DNA双螺旋结构的功臣

新华网 （ 2003-04-23 16:34:41 ） 稿件来源： 北京日报

1953年2月28日中午，剑桥大学的两位年轻的科学家弗朗西斯·克里克和詹姆斯·沃森步入老鹰酒吧，宣布他们的发现：DNA是由两条核苷酸链组成的双螺旋结构。

这家著名的酒吧位于剑桥大学国王学院斜对面，酒吧的标志是一只展开翅膀的老鹰，英文名字就叫The Eagle Pub。现在酒吧门口专门有一个介绍这段历史的牌子。当时沃森和克里克在剑桥大学非常普通，甚至有些不得志，沃森才25岁，克里克也不过37岁。他们甚至连一
个正式宣布成果的场合都很难找到，到酒吧宣布如此伟大的一项发现总给人一种滑稽的感觉，幸好剑桥人的素质很高，当时并没有人把他们当成疯子轰走。沃森和克里克成名后，他们出场做报告都受到隆重接待，只不过他们讲解和宣布的内容再没有像发现DNA双螺旋结构这么重大。

物理学家的小册子《生命是什么》开拓了生命科学研究的广阔领域

DNA双螺旋结构的发现得益于一本科普小册子《生命是什么》，它的作者是量子力学奠基人之一奥地利物理学家薛定谔(1887年-1961年)。

长期以来，人们从许多初步实验中发现生物体之间的遗传性是由一个因子决定的，但一直不知道究竟是什么因子在决定这一现象。在20世纪上半叶，很多物理学家把目光投向了生命现象，希望能从物质层次揭示生命的奥秘。1944年薛定谔出版了《生命是什么》的小册子，用通俗的语言阐明了用物理学的新观点研究生命现象的重要性，他从生物学已有的研究成果中引申出许多新的课题，如遗传信息是怎样编码等，认为最终要靠物理学和化学方法研究解决。

《生命是什么》的出版，在年轻的科学家中产生了巨大的影响，被誉为从思想上唤起生物学革命的小册子。正在剑桥大学攻读物理学博士学位的克里克深读了这本小册子之后，从中品味到生物学广阔的领域需要物理学家参与共同开拓，他深信用自己掌握的物理学知识有助于生物学的研究，便毅然转向了生物学。无独有偶。美国青年学者沃森(1928年-)也受《生命是什么》的影响，从书中悟出联结原子、分子与生命本质之间的关键因素是基因，预言能解开基因携带遗传信息的化学物理密码的人将成为有卓越贡献的科学家。

当时，生物学家开始自由地用基因这个词，表示基因学信息的最小单位这个概念，但他们还不知道基因究竟是什么。1951年的秋天，沃森在剑桥大学首次遇见了克里克。他们两个一拍即合，相见恨晚，立即开始合作，决心搞清楚什么是DNA。1953年初，沃森和克里克受到伦敦大国王学院科学家成果的启发，沃森回忆道：“突然间，我脉搏加快，思如泉涌，眼前出现了一幅画面：DNA的结构要比许多人想象的简单许多，它应该是螺旋型的。”

不过，DNA的双螺旋结构这一发现在公众中并没有引起重视。1953年4月25日英国《自然》杂志发表了这一成果。20天后，他们所在的剑桥大学卡文迪研究室主任劳伦斯布拉格爵士在一个演讲中提到了这个发现，被媒体报道，这才引起公众的关注。在这一成果问世50周年之际，很多国家在举办各种纪念活动，媒体也利用这一机会开展科普工作。

不过，关于这一成果的生日是1953年2月28日还是4月25日仍有争论。按照国际学术界惯例，一项成果必须经过同行评审后在学术杂志上正式发表才能被视为正式宣布，这样做为的是防止有人钻空子随便宣布获得重大成果造成混乱。因此，尽管沃森和克里克2月28日就在老鹰酒吧宣布了这一成果，但包括英国官方机构在内的很多机构把今年4月25日作为DNA双螺旋结构发现50周年庆祝日。

双螺旋结构之母是未获诺贝尔奖的女科学家罗莎琳德·富兰克林

1962年，沃森和克里克与莫里斯·威尔金斯一起因为发现DNA双螺旋结构赢得了诺贝尔奖。威尔金斯的贡献在于为沃森和克里克的发现提供了实验证据。不过，今年3月我在剑桥国王学院参加活动时，主办方的英国文化委员会一位新闻官正式发表了演讲，在介绍到DNA双螺旋结构发现50周年纪念活动时，她激动起来，大声地说：“我们不能忘记罗西，她在发现DNA双螺旋结构过程中做出了主要贡献，应当获得诺贝尔奖！”
女科学家罗莎琳德·富兰克林

这是科学史上的一桩著名公案。罗西是英国伦敦大学国王学院的一名女科学家，全称为罗莎琳德·富兰克林(1920年-1958年)。在发现DNA双螺旋结构过程中，沃森所说受到的最关键的启发就是基于富兰克林的成果。

富兰克林是一位非常优秀的实验科学家。她用X射线衍射DNA晶体得到了影像，从而分辨出了这种分子的维度、角度和形状。她发现DNA是螺旋结构，至少有两股，其化学信息面朝里。这已经非常接近真理。不过，富兰克林非常有个性，经常对人进行直言不讳地尖锐批评，沃森和克里克也尝过她的苦头。此外，在20世纪50年代，英国学术界排外思想严重，因此富兰克林作为一名犹太人，一个女人，再加上脾气率直，自然不被学术界所包容。因此，1962年，沃森和克里克获得诺贝尔奖时发表演说根本没有提到她。而本应属于她的荣誉落到了她在伦敦大学国王学院的对手威尔金斯身上。

沃森在1968年出版的《双螺旋》一书中，透露了威尔金斯曾偷偷复制富兰克林的研究成果并提供给他，其中就包括了现在众所周知的她证明螺旋结构的X射线图像。如果没有富兰克林的X射线成果，要确定DNA的螺旋结构几乎是不可能的。

由于长期受X射线的影响，1958年富兰克林因卵巢癌去世，享年37岁。沃森和克里克早先一直没有承认她对DNA贡献的真正原因是，他们根本没有告诉她，他们用了她的研究成果。沃森最后满怀感情地写道：“现在有必要阐述一下她所取得的成就……我与克里克都极为赞赏她那正直的品格和宽宏大量的秉性。只是在多年之后，我们才逐渐理解了这位才华横溢的妇女。她为了取得科学界的承认进行了长期的奋斗，而这个世界往往把妇女仅仅看作是研究工作之余的一种消遣玩物。在意识到自己的生命垂危时，她没有叹息和抱怨。直到去世前的几个星期，她还在不遗余力地从事着高水平的工作。富兰克林这种勇敢的精神和高贵的品质是值得我们学习的。”

沃森今天说：基因隐私和基因歧视是基因研究和应用面临的两个严重问题

沃森和克里克现在很少露面。今年4月14日中午，在美国华盛顿人类基因组序列图完成发布会现场，美国联邦国家人类基因组研究项目负责人弗朗西斯·柯林斯博士隆重宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。当DNA双螺旋结构发现者之一詹姆斯·沃森来到华盛顿发布会现场时，这位头发花白的资深科学家立即引起与会者的关注和欢迎。沃森在发布会上回顾了基因研究的历史，并指出基因隐私和基因歧视是当前基因研究和应用领域面临的两个严重问题。

回顾历史，我们看到，DNA双螺旋结构的发现，使分子生物学得以诞生。50年来，生命科学和生物技术迅速发展，人类基因组图谱和水稻基因组图谱先后绘制成功，继1996年克隆羊多利问世后，各种克隆动物纷纷诞生，而一些转基因动植物也已经走进寻常百姓家。这一系列重大成果是人类献给新世纪的一份厚礼，标志着生命科学又向纵深迈进一步，它将推动基因组测序工作、功能基因的研究和基因技术的应用，从而推动整个生物技术的发展，也将对科技发展、经济发展以及整个社会产生深远影响。此外，以包括人自身为对象的生命科学研究，给人类的未来展示了美好的前景，在迎接生命科学不断取得的新突破的同时，如何充分考虑到这些突破可能带来的负面影响、让它们最大限度地造福人类，已成为新世纪之初摆在我们面前的一项迫切课题。

生命科学新的里程碑:DNA双螺旋结构发现前前后后

新华网 （ 2003-04-23 16:43:30 ） 稿件来源： 科技日报

丰富多彩、引人入胜的生命现象，历来是人们最为关注的课题之一。在探索生物之谜的历史长河中，一批批生物学家为之奋斗、献身，以卓越的贡献扬起生物学“长风破浪”的航帆。今天，当我们翻开群星璀璨的生物学史册时，不能不对J·沃森（JinWatson）、F·克里克（FrancisCrick）的杰出贡献，予以格外关注。50年前，正是这两位科学巨匠提出了DNA双螺旋结构模型的惊世发现，揭开了分子生物学的新篇章。如果说十九世纪达尔文进化论在揭示生物进化发展规律、推动生物学发展方面，具有里程碑意义的话，那么，DNA双螺旋结构模型的提出，则是开启生命科学新阶段的又一座里程碑。由此，人类开始进入改造、设计生命的征程。
诚然，生物科学的每一次突破都是其自身发展到一定阶段的产物，是不同学科新理论、新技术相互渗透融合的结果，但勿庸置疑，它首先是科学家个人创造性劳动的宝贵结晶。今天，了解DNA双螺旋结构模型产生的背景、条件，以及对生物学发展产生的积极影响，对我们深刻认识这一重大发现的科学价值，正确把握现代生命科学发展的规律和方向，是大有裨益的。正是基于这一认识，笔者撰写了这篇短文，权作对DNA双螺旋结构模型提出50周年的纪念。

浩繁纷杂的生物尽管千差万别，但不论囊桓鲋掷啵?幼钚〉牟《局敝链笮偷牟溉槎?铮?己廖蘩?獾乜梢园炎约旱男宰匆淮?淮?卮?氯ィ欢?蘼矍状?胱哟??故亲哟?鞲鎏逯?洌?侄嗌僮芑嵊行┎畋穑?幢闶撬??ヒ膊焕?狻H嗣窃?谩爸止系霉希?侄沟枚埂焙汀耙荒干?抛樱?抛痈鞅稹保???蜗蟮馗爬?舜嬖谟谝磺猩?镏械恼庖蛔匀幌窒螅?⑽?铱?糯?⒈湟熘?战?辛瞬恍傅呐?Α?

17世纪末，有人提出了“预成论”的观点，认为生物之所以能把自己的性状特征传给后代，主要是由于在性细胞（精子或卵细胞）中，预先包含着一个微小的新的个体雏形。精原论者认为这种“微生体”存在于精子之中；卵原论者则认为这种“微生体”存在于卵子之中。但是这种观点很快为事实所推翻。因为，无论在精子还是卵子之中，人们根本见不到这种“雏形”。代之而来的是德国胚胎学家沃尔夫提出的“渐成论”。他认为，生物体的任何组织和器官都是在个体发育过程中逐渐形成的。但遗传变异的操纵者究竟是何物？仍然是一个谜。

直到1865年，奥地利遗传学家孟德尔在阐述他所发现的分离法则和自由组合法则时，才第一次提出了“遗传因子”（后来被称作为基因）的概念，并认为，它存在于细胞之内，是决定遗传性状的物质基础。

1909年，丹麦植物学家约翰逊用“基因”一词取代了孟德尔的“遗传因子”。从此，基因便被看作是生物性状的决定者，生物遗传变异的结构和功能的基本单位。

1926年，美国遗传学家摩尔根发表了著名的《基因论》。他和其他学者用大量实验证明，基因是组成染色体的遗传单位。它在染色体上占有一定的位置和空间，呈直线排列。这样，就使孟德尔提出的关于遗传因子的假说，落到具体的遗传物质———基因上，为后来进一步研究基因的结构和功能奠定了理论基础。

尽管如此，当时人们并不知道基因究竟是一种什么物质。直至本世纪40年代，当科学工作者搞清了核酸，特别是脱氧核糖核酸（简称DNA），是一切生物的遗传物质时，基因一词才有了确切的内容。

1951年，科学家在实验室里得到了DNA结晶；

1952年，得到DNAX射线衍射图谱，发现病毒DNA进入细菌细胞后，可以复制出病毒颗粒……

在此期间，有两件事情是对DNA双螺旋结构发现，起了直接的“催生”作用的。一是美国加州大学森格尔教授发现了蛋白质分子的螺旋结构，给人以重要启示；一是X射线衍射技术在生物大分子结构研究中得到有效应用，提供了决定性的实验依据。

正是在这样的科学背景和研究条件下，美国科学家沃森来到英国剑桥大学与英国科学家克里克合作，致力于研究DNA的结构。他们通过大量X射线衍射材料的分析研究，提出了DNA的双螺旋结构模型，1953年4月25日在英国《发现》杂志正式发表，并由此建立了遗传密码和模板学说。

之后，科学家们围绕DNA的结构和作用，继续开展研究，取得了一系列重大进展，并于1961年成功破译了遗传密码，以无可辩驳的科学依据证实了DNA双螺旋结构的正确性，从而使沃林、克里克同威尔金斯一道于1962年获得诺贝尔医学生理学奖。

现代生物学研究业已搞清，核酸是由众多核苷酸组成的生物大分子。核苷酸主要有四种类型，它们按不同的顺序排列，构成了含有各种遗传信息的核酸分子。基因就是核酸分子（主要是DNA）中含有特定信息的核苷酸片断。

在对生物的遗传物质进行深入研究，并不断取得进展的同时，自然界中的大量生命现象和实验中的许多实验结果，也给生物学工作者以有益的启示。

比如，大肠杆菌是一个品系繁多的大家族，有上万种不同的类型。有的品系因缺少指导合成某些特殊营养物质的基因，因而必须从培养基中直接摄取这些营养物质方能生活。这些大肠杆菌被称作营养缺陷型。如大肠杆菌K不能合成苏氨酸（T）和亮氨酸（L）；而它的另一个品系则不具备合成生物素（B）和甲硫氨（M）的能力。把这两种大肠杆菌的任何一种单独放在缺少TLBM的培养基上都不能生长。但是，当把这两种大肠杆菌混合在一起，放到缺少上述四种物质的培养基上，却奇迹般地长出了新菌落。这是什么原因呢？前面已经说过，大肠杆菌K中缺少T、L两种基因，却含有B、M两种基因；而另一个品系的DNA上，尽管不具备B和M基因，却含有K中缺少的T、L两种基因。当把它们放在一起大量培养时，前一品系细胞中的DNA有可能通过细胞膜进入后一品系的细胞中，使两种类型的DNA之间进行重新组合，形成同时含有BMTL四种基因的大肠杆菌新类型。其实，上面这种细菌间的杂交现象并不是仅仅在生物学家专门设计的营养缺陷型实验中才能进行，在自然状态下的许多细菌中同样存在，只不过数量太少，一般不易被人们发现罢了。

上述DNA的转移，主要是靠细胞之间的接触实现的，无需借助外力的帮助。但是，也存在另一种情况，DNA的转移和重组，是在第三者的介入下完成的。如噬菌体的转导就是一个典型的例证。

噬菌体是专门侵染细菌和放线菌的一类病毒。它体积小，结构简单，除六角形头部含有DNA外，周身披有一个起保护作用的外壳和一个蝌蚪状的尾巴。侵染细菌时，先从自身尾部分泌出一种溶菌酶，将菌体某处的细胞壁溶解，然后再把头部的DNA经由这个缺口送入细菌体内。噬菌体侵染细菌的过程有两种类型。一种叫烈性感染，即侵入菌体内的噬菌体DNA立即进行自我复制，产生新的DNA和蛋白质外壳，然后分泌溶菌酶使菌体细胞壁裂解，释放出新的噬菌体；另一种类型叫温和感染，即噬菌体DNA进入菌体细胞后，并不立即进行自我复制，而是插入到被感染菌体细胞的染色体内，潜伏下来。当细菌染色体进行自我复制时，它也跟着复制，并随染色体一同悄悄地进入子细胞内。可是一遇到紫外光照射等外来刺激，温和噬菌体的DNA就会立即脱离细菌染色体，迅速复制，进而使菌体裂解，释放出新的噬菌体。生物学工作者用温和噬菌体去感染有鞭毛的沙门氏杆菌，并通过紫外光照射促使侵入菌体内的噬菌体DNA迅速复制，释放出成熟的噬菌体，然后再用它们去感染无鞭毛的沙门氏菌，结果使无鞭毛细菌长出了鞭毛。其原因在于，当温和噬菌体侵染有鞭毛的沙门氏菌，进行自我复制时，阴差阳错地误把菌体细胞中决定鞭毛性状的DNA片断，也裹进了自己的蛋白质外壳内，而当它们再去感染无鞭毛的沙门氏菌时，就把这种决定鞭毛性状的DNA片断带进了无鞭毛的沙门氏菌中，以至出现了使无鞭毛的菌长出鞭毛的怪事。这种现象叫“转导现象”。这一实验不仅再次证明，生物细胞中的DNA可以从一个细胞转移到另一个细胞，而且表明，在实现这种转移的过程中，噬菌体是一种理想的运载工具。

既然DNA是决定生物性状的主要遗传物质，在自然界中又存在着DNA的转移和重组，并且还有噬菌体等充当基因的运载工具，那么，能不能设法把不同生物细胞中的DNA分子分离出来，进行体外切割，以获得我们需要的某些特定基因；或者人工合成某些基因片断，然后再按照预先设计好的方案，让基因重新组合，通过一定的运载手段，把重组体重新送回到生物体细胞内，并使它的功能表达出来，从而突破远缘杂交的障碍，按照人们的意志改造生物、创造出新的品种呢？

如前所述，大肠杆菌是人类最熟悉的微生物之一。大肠杆菌细胞质中的质粒是一种环状DNA，出入细胞较为容易。加之它结构简单，繁殖快，易于培养，所以大肠杆菌自然就成了基因工程研究的对象和理想的操作工具。1969年，美国生物学家夏皮洛等人首先用生物学方法，从大肠杆菌的质粒环状DNA片断上人工分离出了基因。三年之后，美国科学家科恩，首次把两个大肠杆菌的质粒从细胞中分离出来，在体外让质粒中的DNA分子重新进行组合，然后再送回大肠杆菌中，使其成功地获得表达，从而第一次实现了基因操作。

自此以后，基因工程获得了如火如荼的发展，取得了一个个振奋人心的突破，宛如升起在科学上空的瑰丽明星，令人神往。今天，我们已经可以用基因操作突破种间壁垒，实现各种生物遗传性状的重组，基因工程已成为生物技术的核心技术，广泛应用于医药健康和各个产业部门。放眼未来，它在造福人类中的作用是无可限量的。前景诱人，任重道远，让我们为之奋斗努力吧！ (徐九武)

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