Genome,Res：利用CRISPR-Cas9基因外科手术阻止失明

Genome,Res：利用CRISPR-Cas9基因外科手术阻止失明

2017年2月18日/生物谷BIOON/---据估计，每10名65岁以上的人就将近有1人具有一些年龄相关黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）的症状，而且它的发病率可能由于人口老龄化而发生增加。AMD是一种失明的病因，在白种人中比较常见，导致视觉变形和盲点。在一项新的研究中，来自韩国基础科学研究所（Institute for Basic Science, IBS）基因组工程中心的研究人员报道利用CRISPR-Cas9在支持小鼠视网膜的组织层中开展“基因外科手术（gene surgery）”。相关研究结果于2017年2月16日在线发表在Genome Research期刊上，论文标题为“Genome surgery using Cas9 ribonucleoproteins for the treatment of age-related macular degeneration”。

导致失明的最为常见的视网膜病是儿童的早产儿视网膜病变，以及成年人的糖尿病视网膜病变和AMD。在这些疾病中，异常高水平的血管内皮生长因子（VEGF）分泌出。在AMD中，VEGF导致眼睛中的新血管形成，而且也导致血液和流体泄露进眼睛中，从而破坏视网膜中心的一个被称作黄斑的区域。

注射抗VEGF药物是抵抗AMD的最为常见的疗法，但是每年至少需要注射7次，这是因为VEGF在病变的视网膜色素上皮的细胞中持续地过量表达。IBS研究人员并没有采用这些侵入性疗法。他们认为基于第三代基因编辑工具CRISPR-Cas9的基因疗法可能会改善这种情况。IBS基因组工程中心主任KIM Jin-Soo解释道，“这种注射有效果，但是不能解决这种疾病的主要原因。通过对VEGF基因进行编辑，我们能够实现更为长期的治愈。”

CRISPR-Cas9能够准确地切割和校正基因组靶位点上的DNA。在这项研究中，这种CRISPR-Cas9系统在VEGF基因内部的一个靶位点上进行切割。两年前，IBS研究人员已证实CRISPR-Cas9的一种预组装版本（即Cas9核糖核蛋白）能够被运送到细胞和干细胞中，修饰靶基因。这种预组装复合物快速地发挥作用，并且在身体有时间对它产生免疫反应之前降解掉。尽管存在这些优势和之前取得的成功，运送预组装的CRISPR-Cas9存在的困难限制了它在治疗上的使用。

在这项研究中，IBS研究人员成功地将CRISPR-Cas9复合物注射到湿性AMD模式小鼠的眼睛中，对VEGF基因进行局部修饰。他们首先发现运送预组装的CRISPR-Cas9复合物要比利用质粒运送相同的组分更加高效。其次，这种复合物在注射仅72小时后会消失。他们评估了这些小鼠的整个基因组，结果发现这种CRISPR-Cas9复合物仅修饰VEGF基因，而不影响其他的基因。通过研究脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）监控这种眼睛疾病的进展，他们发现CNV区域下降了58%。CNV指的是在视网膜和巩膜之间形成新的血管，而且它是湿性黄斑变性的一个常见问题。再者，一种可能在这些小鼠体内仅需3天就会出现的副作用，即视锥功能障碍，在治疗一周后并没有发生。

Kim Jin-Soo解释道，“我们开发出的一种疗法通过让VEGF基因失活来抑制CNV。我们展望一下，在未来，外科医生将能够在病人体内编辑致病性的DNA序列。”

尽管CRISPR-Cas9经常被用来校正导致遗传病或癌症的突变，但是这项研究提示着一种治疗非遗传性退行性疾病的新方法。韩国首尔国立大学的KIM Jeong Hun教授指出，“我们认为这是一种治疗非遗传性退行性疾病的新治疗模式。我们证实了这种方法对湿性AMD模式小鼠的治疗效果。如今，我们希望继续开展临床前试验。”

CRISPR/Cas9基因敲除，敲入怎么做，原理

依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。

基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。

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2021-07-04 CRISPR-Cas9 基因编辑原理详解

CRISPR-Cas 系统（The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Cas 系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas 系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。

CRISPR-Cas9 体系的 RNA-DNA 识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个最重要的优势是 Cas9 蛋白可在多个不同的 gRNA 的引导下同时靶向多个基因组位点。

图 1. CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑原理图

在 II 型 CRISPR 系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活 crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。 这个识别复合体可以通过融合 crRNA 与 tracrRNA 序列形成 sgRNA（single-guided RNA）进行简化。基因组的靶序列中有长约 20bp 的片段与 crRNA 或 sgRNA 互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域 PAM（5『-NGG-3』）为 Cas9 识别位点，是实现剪切功能的关键。

图 2. CRISPR-Cas9 介导的基因编辑。（左）：sgRNA 引导 Cas9 核酸酶作用于基因组，形成的 DSBs 被非同源末端连接（NHEJ）机制修复；（右）：sgRNA 引导 Cas9 核酸酶作用于基因组，形成 DSBs，同源重组（HR）作用下，供体质粒上的目标基因及筛选标记（或其他遗传元件）在断裂处被整合进基因组。

图 3: 切口酶在结合链生产单链切口的原理图

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CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 5-15 转染验证

CRISPR-Cas9学习笔记
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记
FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing

CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 1
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 2
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 3
CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 4

这里我不再放详细的实验步骤了，因为我的实验记录本已经详细的记录了实验步骤和条件，没有多余的时间再重新弄一个，可以自行回去查找文献对照protocol

上次我的day 4做完之后，接着就要转293T细胞来验证一下质粒的效果了。简单描述以下前期的思路（其实是我自己在回顾），先准备好需要用的东西：Cas9 backbone质粒，根据基因靶点将sgRNA设计好（顺带设计一下引物），将sgRNA插入到Cas9 backone质粒中，将质粒转入感受态细胞扩增，提取质粒后酶切验证。接着就是293T细胞转染验证了。

使用常规的转染试剂Lipofectamine 3000或者罗氏等其他公司的转染试剂，按照protocol严格操作即可。

昨天和今天都提取了基因组DNA，就酱紫。

感谢师兄DZ

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