纳米孔测序仪发布一系列的更新(第三代基因测序技术)

纳米孔测序仪发布一系列的更新

2016年10月05日讯 英国Oxford Nanopore公司最近又火了一把，因为他家的MinION测序仪上太空了。美国宇航局（NASA）利用这款仪器，在国际空间站首次完成了DNA测序实验。Oxford Nanopore的首席技术官Clive Brown近日谈起这事，也掩不住内心的小激动。同时，他还宣布了MinION、PromethION、SmidgeION硬件和试剂的更新。

MinION更新

据Bio-IT World报道，Brown首先宣布了蛋白孔的更新，新的R9.4版本。更新后的孔将带来更快速、更准确的测序。未来，所有升级都将向后与R9版本兼容。纳米孔测序的酶也将在10月份更新，使得测序速度从250个碱基/秒提高到450个碱基/秒，但准确性不会降低。通过这些更新，MinION的流动槽将在24小时内产生5 Gb以上的数据。

Brown还提到，流动槽本身也有更新，不过没人注意到。如今，纳米孔芯片的上方多了一个输入孔（input pore）。从一开始，设计流动槽的目标就是能够在室温下运输和使用。目前，Oxford Nanopore是通过冷链运输，但新的SpotOn流动槽更容易使用，且保质期也更长。

Brown表示MinION的试剂盒也有更新。尽管Oxford Nanopore继续生产1D和2D试剂盒，但他希望用户转到1D试剂盒，因为它越来越好。新的1D快速版试剂盒将文库制备的时间从10分钟缩短到5分钟，且无需额外的试剂。随着更新，用户的平均准确性能高于90%。

此外，该公司还推出了一些新的试剂盒，包括洗涤试剂盒（将旧的样品从流动槽上冲洗下来）、短片段试剂盒、快速PCR条形码试剂盒、快速PCR试剂盒以及快速扩增子试剂盒。它还计划推出一个直接RNA试剂盒。每个试剂盒都有多重的版本。

在数据分析方面，仪器控制软件MinKNOW也在不断改进。目前有三种实时的碱基检出方式：实时和本地，本地和离线，以及云端。不过，Brown希望淘汰云端的碱基检出，他预计是11月5日。

硬件更新

Brown还着重介绍了一款新设备VolTRAX。这款样品制备仪器适用于诊所、医生办公室和战地医院。它是一个可编程的“基站”，具有集成的加热和冷却功能，可与手提电脑连接，完成标准甚至更复杂的样品制备。

“我们正在调整和优化现有的文库制备操作，以便在VolTRAX上使用。目前的1D和2D文库制备操作，以及1D快速操作，都在VolTRAX上表现良好，”该公司表示。Brown说，VolTRAX的早期试用计划将在10月11日启动。

Brown还分享了SmidgION的第一张照片，这是一款与手机兼容的DNA测序仪。生物通之前报道过，这款设备采用与MinION和PromethIon设备相同的纳米传感技术，但它比MinION更小，每个流动槽中有256个通道。它可通过充电接口与智能手机或其他移动设备连接，运行4-5小时。据介绍，SmidgION将支持R9试剂，测序速度将达到每秒450个碱基。

展望未来

Brown也分享了Oxford Nanopore目前参与的一些项目。他认为，有了便携式设备，你能够将精力集中在低成本、大容量的检测上。纳米孔测序作为平台，可促进检测的开发和转化，包括临床和非临床。“检测食物或环境都没问题。对我们来说是一样的，”他说。

他的第一个例子是MinION的用户发表的。英国诺丁汉大学的Matthew Loose及其同事7月在《Nature Methods》上发文，详细介绍了实时选择性测序。“你可以实时富集感兴趣的片段，然后只测序它们。对于扩增子来说，我认为这很酷，”Brown谈道。

Oxford Nanopore也将纳米孔测序与基因编辑技术相结合，在样品制备中利用Cas9的无活性蛋白来“call down”特定的DNA区域。Brown暗示，公司很快将推出标准化的检测试剂盒。

早前，Oxford Nanopore曾表示，它的Zumbador项目正在开发另一款简单便携的产品，希望将核酸提取和文库制备融合在一个设备中。原始样本（如血液、唾液甚至食品）在一端加入，从另一端出来，可立即用于测序。

据介绍，Zumbador正变得越来越简单。Oxford Nanopore开始利用微珠捕获和导入系统。脱水的微珠位于Zumbador设备的底部。一旦微珠水化，它们直接掉入流动槽中。这有可能需要一个可运输的液相，其中包含细胞裂解液和某种形式的激活物，之后样品制备发生。目前接近流动槽的部分是最成熟的，而样品输入部分仍在开发阶段。

此外，Brown还宣布公司正在开发一种基于场效应晶体管（FET）的传感器。这种FET芯片仍将是一种小型芯片，与MinION或PromethION的芯片大小相同，不过密度非常高。从理论上说，芯片上将有100万个通道，每秒处理1000个碱基。到目前为止，FET芯片表现出很好的信噪比。

Brown认为，FET芯片将是下一个技术革新，不过，尽管概念验证的工作已经完成，但还有许多研究工作要做，产品上市至少还需要两年。

第三代基因测序技术

问题一：第三代测序技术的第三代测序技术原理 第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。

问题二：什么是第三代基因测序技术 go the wrong way

问题三：第三代测序技术的第三代测序技术特点 1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。3、它的精度非常高，达到99.9999%。4、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。5、第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。

问题四：第三代测序技术的介绍 第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。

问题五：DNA 的 1代测序，2代测序，3代测序的区别是什么啊？ 第一代指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列，每次获取数据量少
第二代为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。
第三代特点是单分子测序，多基于纳米科技，无需扩增，对单分链DNA/RNA直接用合成、降解、通过纳米孔等方式直接测序，核心特点是无需扩增所以成本更低

问题六：第三代测序技术的第三代测序平台比较 测序方法/平台 公司 方法/酶 测序长度 每个循环的数据产出量 每个循环耗时 主要错误来源 第三代测序技术 Heliscope/Helicos　　Genetic Analysis　　System Helicos 边合成边测序　　/DNA聚合酶 30-35 bp 21-28 Gb 8 d 替换 SMRT Pacific Biosciences 边合成边测序　　/DNA聚合酶 100000 bp 　　　　　　纳米孔单分子 Oxford Nanopore 电信号测序　　/核酸外切酶 无限长

问题七：基因三代测序是什么？ 三代测序是 DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基(dNTP)，在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要与酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBio SMRT技术的一个关键是将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW(零模波导孔)原理：在一个反应管(SMRTCell：单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔，即 ZMW(零模波导孔)外径 100多纳米，比检测激光波长小(数百纳米)，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。（中源-协-和-基因）

三代测序（Nanopore）

先介绍 Nanopore 测序中的几位主角：

Reader ：在自然界中，有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后，得到的就是 Nanopore 测序所需的 Reader 蛋白。

Membrane ：Reader 蛋白会被嵌入到高电阻率的 Membrane （人工合成的多聚物膜），膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。

Motor ：在 Nanopore 文库构建时，需要在接头上连接一种动力蛋白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。以DNA解螺旋酶作为 Motor（动力蛋白）为例，它可以除了可以解开双螺旋，使之变为单链，还可以提供推动力。

Tether ：该蛋白用于锚定DNA或RNA链，防止在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。

这时，解开的其中一条链会穿过蛋白质孔，它在通过蛋白孔时，会对膜两边离子的稳定流动产生扰动。不同的碱基，对离子流的影响不同，也就会产生不同的电流大小，进而形成下面的电流信号图。

利用这些电流信号，使用计算机软件识别后，推断出碱基类型，完成测序。

虽然 Nanopore 测序仪种类很多，但都是基于Nanopore芯片来搭建的平台，大到由多个芯片阵列组成的PromehION，GridION系列测序仪，小到可以连接手机的Type C，电脑USB的MnION系列便携式测序仪。

这里边，最著名的就是MnION系列，2016年8月，美国宇航员凯特·鲁宾斯在国际空间站完成微重力条件的DNA测序。

它在测序时，一般像下图这样连接就行，显而易见的便携性。比如，可以直接用它在深入疫区采集样本后进行实时分析，为防疫工作争取大量宝贵的时间和资源。

测序时，将制备好的文库或样本溶液，滴在芯片小孔中，开始测序。

一张芯片中有 2048 个 membrane wells，也就是芯片上的一个孔，每个孔包含一个nanopore Reader。

每四个 wells 共享一个 Amplifier（信号放大器），一张芯片中有 512 个信号放大器，也就是 512 组 wells。

在启动测序仪后，机器自检，会将每组 wells 中依据效率高低排序。测序开始，仪器先用每组 wells 中效率最高的 wells，运行 8 小时后，更换效率第二的，以此类推。

但是，在实际使用过程中，只有 1200 个 wells可以正常工作。

造成 wells 失效的原因：

1D文库是将DNA双链，解链为正义链与反义链，分别测序，大约有 85% 的碱基判读准确率。

目前 1D文库 有两种建库方案：

在 DNA 两侧接 ? 接头，其他步骤和 1D 文库类似。

这种文库中的? 接头，可以让第二链紧跟第一链来一起测序。

由于可以测到两条链，可以相互矫正，进而提高判读准确率，能达到 90%以上的碱基判读准确率。

但是，由于文库质量，蛋白活性等因素，导致并不是所有的第一链后都会测到第二链。

在测序过程中，得到的信号并不是每次测得一个碱基信号。而是根据 Reader 蛋白孔的纵向长度，R9 大约为 5 个碱基长，也就是说，同时会测得 5 个碱基的电信号，这并不是一项简单的判断过程。

目前，Nanopore 公司采用一种机器学习方法，递归神经网络（RNN），对碱基进行判读。

该过程简单来说，是将已知碱基序列的电信号波形图做训练集和测试集，通过修正参数，拿到模型。最后，将新测到的未知序列的波形图与之比对，从而提高判读准确率。

但是，还是有误读情况：

以R9芯片为例，测序过程，先用 180 mV 电压，每 10 min，短时间翻转电压方向，作用是激活被堵住或卡住的 Reader 蛋白孔。但是，这个过程也会使正常测序的 DAN链倒吐回去。

随着电极使用时间的增加，电极的电压会发生漂移，因此每过两小时，要增加 5mV 电压抵消影响。

R9 芯片，测序速度是 250 碱基/s，一张芯片可以得到约 5 ~ 10 G的碱基序列。

Nanopore 公司每一种新Reader蛋白，Motor，Membrane，就会有一个新的芯片版本号，一般命名规则如下：

比如，R9 指的是大肠杆菌的 CsgG 蛋白质改造的 Reader 蛋白。

参考：

https://www.youtube.com/watch?v=RcP85JHLmnI

https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw&t=13s

https://www.youtube.com/watch?v=sv9fFeSd3kE

https://nanoporetech.com/

本文地址:http://www.dadaojiayuan.com/jiankang/269838.html.

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