核酸突变分析方法抉择: pcr、杂交还是ngs

核酸突变分析方法抉择: pcr、杂交还是ngs

日前，以"精细管理、精准医疗"为主题的2016届csco学术年会在厦门落下帷幕，精准检测作为临床实践中实施精准医学的第一步，成为本届csco学术年会的热点话题。来自不同企业的分子诊断技术百花齐放百家争鸣，面对新技术与成熟技术的较量，在"精准医学"时代下，如何选择合适的检测技术，实现精准治疗成为新医学形态下人们亟需解决的问题。

近期，美国莱斯大学dmitriykhodakov教授在国际知名期刊《advanced drug delivery reviews》（if=15.606）发表的综述文章，也许能给我们一个答案。该文对精准医学关键的基因检测技术手段进行了梳理，作者认为目前实现临床转化的核酸检测技术可以分为三大类：pcr技术、杂交技术和测序技术，介绍了这三类技术，并对其临床应用发表了自己的见解。以下是对该文主要内容的介绍。

一、pcr技术

pcr技术是目前应用最广泛的dna分子检测技术。与杂交技术和测序技术相比，pcr技术优势主要在于、高敏感度、易于推广。其主要局限在于多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限。1、arms

扩增阻滞突变系统（arms）是使用广泛的一种核酸变异检测技术，已有多家公司开发出基于此技术的肿瘤突变基因检测试剂盒产品，如qiagentherascreen、roche cobas、biomerieuxthxid以及中国的amoydx等。2、blocker pcr

blocker pcr技术通过引入blocker序列来抑制野生型基因扩增从而达到检测核酸变异位点的目的。目前已有基于此技术的肿瘤基因突变检测试剂盒产品问世，如pna bio开发的pnaclamp试剂盒。 3、多重pcr

多重pcr技术需要解决扩增抑制、荧光基团的数量限制、引物二聚体等问题，其工程学解决方案主要通过开发设备和一次性芯片等来解决。biofire diagnostics(现被biomerieux收购)和cepheid都开发出用于感染性疾病诊断的多重pcr试剂和仪器。 4、数字pcr

数字pcr技术通过将一个样本分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(dna模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行pcr扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，从而实现高灵敏的绝对定量检测。目前数字pcr主要用于科研及临床研究，也有开发ldt方法用于临床，如trovagene pcmbrafv600e试验。

二、杂交

杂交是一种将合成的dna探针或引物与目标序列结合的过程。与pcr技术和ngs技术相比，杂交的主要优点在于操作简单、可多重检测、结果可靠，其缺点主要在于该方法不能进行序列扩增，因此必须依赖于信号放大技术或者高灵敏的检测设备。 1、微矩阵

微矩阵通过靶基因与固定在芯片上的探针发生特异性杂交，结合在芯片上不同位置的探针对应不同突变，荧光强度代表浓度，从而实现一次检测多种基因突变或者基因表达水平的目的。因此，其检测灵敏度取决于靶基因和探针的杂交效率及荧光显微镜的分辩能力。fda已批准多个微矩阵技术产品，如agendia开发的用于乳腺癌检测的mammaprint试剂盒等。2、荧光条形码单分子检测技术

荧光条形码单分子检测技术是一种高通量检测技术。可分为两大类：intensity barcodes和geometric barcodes，intensity barcodes在二氧化硅颗粒上标记不同密度的荧光标记，通过捕获有目标基因的颗粒的荧光信号来检测突变类型；而geometric barcodes是利用光谱上不同的荧光基团的组合来检测不同序列。其中luminex开发的基于intensity barcodes方法的呼吸道疾病诊断技术已获得fda批准。 3、原位杂交（ish）

原位杂交不仅提供目标基因的序列和浓度信息，而且可实现目标基因的细胞定位，尤其适用于异质性细胞及组织样本的基因扩增检测。原位杂交技术有荧光原位杂交（fish）、显色原位杂交（cish）或者银染原位杂交（sish）等，原位杂交技术可应用于dna和rna的检测，目前，fish主要用于dna扩增检测，如roche和abbot开发的her2扩增检测试剂盒。

三、新一代测序技术（ngs）

ngs是一种高通量检测dna和rna变异的方法，与sanger测序不同，ngs可检测多种样本，且可以同步提供大量的基因变异信息，因此该方法非常适合于并行检测和分析多种基因和变异信息。

没有一种方法是完美的，由于背景信号干扰、酶的扩增错误率、化学反应不彻底等问题，所有的ngs平台都有一定的内在错误率。而测序过程中的错误会增加突变检测的难度，特别是低频突变。1、主流ngs平台

主流ngs平台有illumina和iontorrent的的ngs系统，illumina在序列错误率和成本控制上处于领先地位。在诊断应用方面，illumina开发有miseq和nextseq两个平台，其中miseqdx是首个获得fda许可用于ivd的ngs平台。2、其他平台

其他平台还有：适用于长序列检测的smrt ngs平台（pacific bioscience），以及nanopores ngs平台（oxford、genia technologies）等。

四、作者观点

ngs实验操作复杂且成本高，由于其高通量的序列分析能力，已经成为许多序列变异分析与科研应用的主要选择。然而，从临床诊断应用的角度，检测的目标位点必须具有明确的临床价值，因此相对于ngs技术而言，pcr技术的简便性、稳定性和使用的广泛程度意味着在未来一段时间内pcr技术依然是核酸突变位点检测的不二选择。在可预见的未来里，技术的发展将扮演重要的角色。虽然ngs技术单位通量价格在近10年极大地降低，但是依然离整个基因组或转录水平的全面深度测序至少6个数量级的差距。dna序列变异分析的优化和创新将主要集中在价格，准确性，运行周期，操作复杂度和实验室的规范化等方面。

如何进行目的基因片段分离，克隆和分析

分离目的基因
生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。
分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA 芯片、cDNA芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。
2 基因文库技术分离目的基因
基因文库指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体的形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑，或成活细胞）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。其类型很多，如可分为基因组文库与cDNA文库、克隆文库与表达文库，按载体分有智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有以下几种：核算杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作，也是分离目的进的常用方法之一。
3 功能蛋白组分离目的基因
蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用RT-PCR 得到目的基因的全长；应用核算杂交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。
4 PCR技术在基因克隆中的应用
PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用 PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的 cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的 PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小节），用于DNA序列克隆的Panhankle- PCR、Cassette-PCR以及减法cDNA文库的PCR法构建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR为基因组已知DNA相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。
5 mRNA差别显示技术分离差别表达基因
mRNA差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mRNA反转录与PCR技术结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。它利用5’锚定引物oligo（dT）12MN和3’端随机引物对总mRNA进行PCR扩增，以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。
6 插入突变分离克隆目的基因
获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。这里举T-DNA标签法和转座子诱变分离克隆目的基因的例子。T-DNA标签法是将T-DNA在任何感兴趣的基因处产生插入性突变，获得分析该基因功能的对照突变体。它将T-DNA左右边界之间携带的外源报告基因片段作为一个选择性的遗传标记，因为插入的序列是已知的，因而对获得的转基因重组突变体就可以通过各种克隆和PCR策略加以研究。倘若将35S强启动子在T-DNA整合到宿主基因组后，整合到内原基因的上游，则可以产生异常增加或表达的时空特异性改变而破坏基因的表达的效果。有获得性突变和功能丧失性突变等。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。

二代测序文库构建-概述与挑战（1）

高通量测序又称NGS，重新定义了基因组学研究。近年来，NGS技术稳步发展，伴随着成本下降以及测序应用呈指数增加。本文，我们研究了影响测序文库质量的关键因素，以及，在DNA来源和RNA来源文库准备过程中存在的挑战。这些因素包括，DNA/RNA材料的定量和物理性质以及潜在应用（比如，基因组测序、靶向测序、RNA-seq、ChIP-seq、RIP-seq和甲基化），在制备高质量测序文库的内容中将提到。另外，我们也会讨论制备单细胞来源的文库的方法。

在过去的5年里，NGS技术在生命科学领域的研究人员中得到了广泛应用。与此同时，随着测序技术的发展和进步，衍生了一些核酸提取和文库制备的方法。比如，已经可以成功利用来自单细胞的RNA和DNA进行文库的制备. NGS文库制备的基础是将靶向的核酸、RNA或DNA 改造成测序仪可以使用的形式（Fig 1）。在这儿，我们对比了多个文库制备策略以及NGS应用，主要着眼于与illumina测序技术兼容的文库。但是，需要指出一点，本文讨论的几乎所有原则只要稍加修饰便可应用于其他NGS平台，比如，Life Technologies、Roche和Pacific Biosciences。

一般来说，文库制备的核心步骤包括：1）片段化及或选出特定长度的片段，2）将其转化为双链的形式，3）将寡核苷酸接头连接至片段末尾以及4）对文库进行定量；目标DNA片段的大小是NGS文库构建的关键因素。对核酸进行片段化的方法主要包括物理、酶切和化学的方法。物理方法包括声波剪切（代表：Covaris）和超声（代表：BioRuptor），酶切方法包括非特异性内切酶和转座酶片段化；我们实验室中，Covaris, Woburn, MA主要用于获得100-5000bp范围的DNA片段，而Covaris g-TUBEs主要用于mate-pair文库所必需的6-20kb范围的DNA片段。酶切的方法包括DNase I或片段化酶的消化，一个两种酶的混合（New England Biolabs, Ipswich MA）。两种方法都很有效。但是，片段化酶相比物理方法会产生更多的假indel。另一种酶切方法是Illumina的Nextera，利用转座酶进行随机片段化并把接头序列插入双链DNA中。 这种方法有几个优势，包括，减少样品处理和制备的时间。

文库大小是由插入片段（指的是接头序列之间的文库部分）大小决定的，因为接头序列的长度是不变的。反过来说，最佳插入片段长度是有NGS设备以及特定测序应用决定的。比如， illumina中，最佳片段大小是受簇生成过程影响的，这个过程包括，文库编写、稀释以及分布至芯片表面进行扩增。虽然，短片段扩增更加有效，长片段文库能够产生更大、更弥散的簇。我们用illumina测序的文库最大为1500bp。

最佳文库大小也是由测序应用决定的。对于外显子测序来说，80%以上的人类外显子长度小于200bp。我们测试PE100bp，外显子文库大小约为250bp，这样可以匹配大多数外显子的平均大小，结果中没有重叠的读对。 RNA-seq文库大小也是由应用决定的。对于基因表达分析我们采用SE100的测序。但是对于，可变剪切或转录起始终止位点的判定，我们选择PE100的方案。大多数应用中，RNA在片段化之前会逆转录成cDNA的形式。一般是利用二价金属离子（镁或锌）对RNA进行可控的热消化。文库片段大小可以通过调节消化反应的时间来控制，重复性很好。

在最近对7个RNA-seq文库制备方法的研究中，大多是先对RNA进行片段化然后进行加接头。有两种方法，不利用随机引物，或者说在SMARTer Ultra Low RNA试剂盒中， 合成具有固定3'，5'序列的全长cDNA序列。 全长的cDNA文库（平均2kb）可以通过长距离PCR（LD-PCR）进行扩增。这种扩增的双链cDNA再通过声波剪切至合适的长度，用在标准的illumina文库准备过程中（包括，末端修复和补平，加A和接头连接，再通过PCR进行扩增。）

另一种文库构建后对文库大小处理步骤是片选以及去除接头二聚体或其他文库制备的副产物。接头二聚体是接头自连的结果。这些二聚体成簇效率非常高，而且会消耗掉珍贵的芯片空间，但不产出任何有效数据。因此，我们通常利用磁珠法或切胶回收。磁珠法适用于起始材料比较充足的情况。若样本投入有限，就会生成更多的接头二聚体。我们的经验是，磁珠为基础的方法在这种情况下不适用，需要结合磁珠和切胶回收的方法。

在microRNA/small RNA文库制备过程中，目的产物通常只比120bp的接头二聚体长20-30bp。因此，必须使用切胶回收的方法获得尽可能多的目的序列。这种分离精度对于磁珠来说就不适用。另外，我们经常需要建大插入片段（1kb）的文库，结合更长的读长PE300以及无PCR步骤，用于细菌基因组的从头组装。为了尽可能获得可用于组装的数据，就必须要小心地进行切胶回收以获得大小较为一致的插入片段。

在利用DNA样本进行文库构建过程中有几个考虑，包括起始材料的量以及该文库是用于重测序（有可用于比对的参考序列）还是从头测序（需要利用此次下机数据组装出新的参考序列）。文库制备容易存在bias，这是由于基因组存在高GC或低GC的区域，目前已经开发了解决这些问题的方法，包括仔细选择用于扩增的聚合酶、循环数、条件以及缓冲液等。

DNA样本的文库制备，不管是用于WGS、WES、ChIP-seq还是PCR扩增子，一般都遵循相同的流程。总的来说，对于任何应用，目标都是使文库尽可能的复杂。

DNA建库试剂盒目前有多个品牌。竞争也促使价格迅速下降以及质量的提升。这些试剂盒能够处理DNA起始量从ug到pg多个级别。但是，我们需要记住一点，起始量大可以降低扩增循环数，因此文库复杂度更高。除Nextera外，文库制备步骤通常包括：1）片段化，2）末端修复，3）5端磷酸化，4）3端加A，5）接头连接，6）几个cycle的PCR以富集加了接头的产物。Ion Torrent流程的主要不同在于平末端连接不同的接头序列。

起始DNA被片段化后，会使用3个酶的混合物（ T4 多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶以及 Klenow大片段 ）进行末端补平和5端磷酸化。3端加A尾利用Taq聚合酶或Klenow片段（exo-）。Taq在加A尾上更有效率，但Klenow在不能用加热方法时，比如mate-pair文库可以适用。在接头连接过程中，最适的接头：片段比例大约为10：1，以摩尔数为单位。接头太多会形成难以分离的二聚体，这些二聚体在随后的扩增中会占主导地位。末端修复和加A反应后，磁珠或胶回收的方法都适用，但连接反应后我们发现，磁珠的方法能够更有效地去除接头二聚体。

为了便于多样本混合，可以对不同样本使用不同barcode的接头。另外barcode也可以由PCR扩增过程经不同barcode的引物加入。可以从多个供货商购买高质量的带barcode的接头和PCR引物。 目前DNA文库构建的所有组分，从接头到酶，都有详细的文字说明，可以组装成自制的文库制备试剂盒。

另一种方法是Nextera方法，利用转座酶对DNA进行随机打断，并在一个单管中对其加标签（又称tagmentation）。这种工程化的酶有两个功能，对DNA进行片段化，并将特定的接头加到片段化DNA的两端。 这些接头序列在接下来的PCR过程中用于扩增插入片段。PCR反应会加入barcode。这个制备过程相对传统方法的优势在于，将片段化、末端修复和接头连接合并成一步。这种方法相对于机械片段化的方法来说，对DNA的起始量更加敏感。为了实现在合适的距离进行片段化，转座酶相对样本的比例非常关键。因为片段大小依赖于反应效率，所有反应的参数，比如，温度和反应时间，都非常关键，需要严格控制。

一些课题组发表了对单个细胞基因组进行测序的结果。现在的策略采用多重链置换（MDA）对整个基因组进行扩增。MDA主要是利用了随机引物和phi29，一种高度进行性的链置换聚合酶。虽然这个技术能够产生足够的量用于测序文库的构建 ，但它的一个问题在于非线性扩增造成的大量的bias。最近有研究认为通过加入一个半线性的预扩增步骤能够减少bias。Fluidgm基于单细胞分离和微流控技术用于单细胞文库制备，每次运行可获得最多96个单细胞。

对于RNA文库，我们需要根据测序目的来进行文库构建方案的筛选。如果目的是发现复杂全面的转录事件，文库需要覆盖整个转录组，包括，编码、非编码、反义以及基因间RNA，而且需要尽可能的完整。但是，很多场合，目的只是研究能够翻译成蛋白质的编码mRNA的转录本。另一种情况只涉及small RNA，大多miRNA，也包括snoRNA，piRNA，snRNA以及tRNA。虽然，我们想要详述RNA测序文库的原则，但无法一一列举。感兴趣的读者可以自行研究。

NGS应用到RNA-seq最初成功的例子之一是 miRNA 。制备miRNA测序文库非常简单，通常是一步反应。事实上，miRNA在5端有天然磷酸修饰，这允许连接酶选择性地靶向miRNA。

illumina步骤的第一步，3端阻断，5端腺苷化的DNA接头通过截断的T4 RNA连接酶2被连接至RNA样本。这个酶经过修饰，能够对3端接头底物进行腺苷化。结果是，其他RNA片段在这个反应中不会连接在一起。只有腺苷化的寡核苷酸可以连接到游离的RNA的3端末端。由于接头3端是阻断的，无法进行自连。下一步，在ATP和RNA连接酶1的作用下加入5端RNA接头。 只有5端磷酸化的RNA分子能够在连接反应中作为有效的底物。第二步连接反应后，逆转录引物杂交到3端接头，开始启动RT-PCR 扩增（一般是12个循环）。由于小且片段大小可预测（120bp 接头序列加上20-30bp miRNA插入片段），文库或多个barcode混合样本通常一起进行切胶回收。 由于存在接头二聚体以及非miRNA的连接（tRNA和snoRNA），切胶回收非常重要。这种文库制备方法导致文库的测序具有方向性，总是从原始RNA的5端到3端。Ion Torrent 的miRNA测序原则也是相似的。Ion Torrent利用两种不同的接头连接至miRNA 3端和5端，随后进行RT-PCR。一般，文库构建步骤可以将任何RNA材料构建成有方向性的RNA-seq文库。

miRNA文库的一大限制在于RNA的起始量低（<200ng 总RNA）；短接头二聚体在RT-PCR反应中与目的产物、接头和miRNA进行竞争。 当存在太多二聚体时，他们会在片段筛选时充斥整个凝胶，污染产物条带。为了尽量避免这种情况，很多试剂盒采取了各种方式来避免二聚体的形成。

对于mRNA测序文库，方法主要包括利用随机引物或oligo-dT引物进行cDNA合成或在mRNA片段上加接头后进行某种形式的扩增。mRNA可以由随机引物或oligo-dT起始产生一链cDNA。如果使用随机引物，必须先将rRNA去除或减少。rRNA可以通过寡核苷酸探针为基础的试剂，比如，Ribo-Zero和RiboMinus，进行去除。另外，polyA RNA可以通过oligo-dT磁珠进行正向筛选。

通常希望文库能够留有原始目的RNA的链的 方向性 。比如，逆转录产生的反义RNA在调节基因表达中发挥作用。实际上，lncRNA分析依赖于定向RNA测序。制备定向RNA-seq文库的方法有几种。逻辑时，进行cDNA反应，将两条链中的1条有选择地移除，通过，在第二条cDNA链合成时加入dUTP。尿嘧啶包含的链可以被响应的酶消化掉或者扩增的时候用不识别尿嘧啶的聚合酶。 另外，加入actinomycin D可以减少一链cDNA合成过程中假义链的合成。

另一种杂交方法利用随机或锚定oligo-dT引物的接头序列起始第一链cDNA的合成。接下来，在模板转换步骤，3端接头序列添加到cDNA分子。这种方法的明显优势在于第一链cDNA分子可以利用3端的唯一序列标签无需进行第二链合成，直接通过PCR进行扩增。5端唯一序列标签在第一链合成过程中引入。

用于cDNA合成的引物设计对于RNA-seq文库非常重要。比如，rRNA序列可以通过设计靶向rRNA的引物（不用于进一步扩增）进行去除。 NuGEN Ovation RNA-seq结合SPIA（ Single primer isothermal amplification ）核酸扩增技术以及用于第一链cDNA合成的引物来抑制rRNA的扩增。另一种方法中利用4096种六聚体来抑制rRNA序列（识别并消除完美匹配）。749种六聚体保留并用于起始第一链cDNA合成反应。结果是，rRNA reads从78%降至13%。还有一种方法叫， DP-seq ，利用44个7聚体引物扩增了大部分的小鼠转录本。这种引物设计选择性地抑制了高表达转录本的扩增，包括rRNA，并提供了胚胎发育模型中低丰度转录本的估计。

最近发表了一些制备单细胞RNA文库的方法。一种方法利用第一链cDNA的多聚核苷酸尾巴，结合模板转换反应。结果是第一链cDNA产物可以通过通用PCR引物进行扩增。如图，Figure4B所示，且已并入是试剂盒中。另一种方法叫 CEL-Seq ，在cDNA 5端合成T7启动子序列，随后在体外转录过程中进行现象扩增。

单个细胞的总RNA一般为10pg，但polyA RNA只有0.1pg。因此，这些方法某种程度上需要全转录本扩增以产生足够的建库所需起始量。这样大量扩增的弊端就在于大量技术噪音的产生，这一问题目前尚未解决。 （？）

最后，核糖体印记能够反应翻译的任何节点上细胞mRNA转录本的混合。这种方法涉及到利用RNase对细胞进行裂解，只留下被核小体保护的30个核苷酸的区域。核小体经蔗糖梯度密度离心进行纯化，接着mRNA被从核小体中提取出来。另一种新的RNA测序的应用是 SHAPE-Seq，通过酰化试剂来偏向性地修饰未配对的碱基以探索RNA的二级结构。通过对修饰的RNA和未修饰的对照进行逆转录，对得到的cDNA片段进行测序，比较后能够揭示核苷酸水平的碱基配对信息。

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