“自噬机制”或能够对抗衰老起作用!(自噬2021-08-03)

2016年诺贝尔生理学或医学奖被授予大隅良典，因为他发现了“自噬机制”。这是一种进化上的保守过程，即真核细胞可以通过输送双膜囊泡到溶酶体进行一部分再循环。与其他细胞退化机制不同，自噬能移除已经老化或损坏的蛋白质、大分子复合体和细胞器，留下空间用于参与新的生理过程。此外，自噬还是清除入侵微生物和有毒蛋白聚集体的关键细胞过程，因此在对抗感染、衰老和许多人类疾病中扮演重要角色。

虽然自噬在上世纪60年代已获得确认，但在接下来的几十年中，科学家对其机制和生理意义仍然知之甚少。大隅良典的工作显着改变了人们对这一重要细胞过程的理解。

1993年，大隅良典发表了他在酵母15个基因中的开创性发现。随后，他在酵母和哺乳动物细胞中克隆了这些基因并阐明了编码蛋白质的功能。基于大隅良典的开创性发现，自噬在人体生理和疾病中的重要性现在获得了广泛认可。

自噬概念诞生后研究进展有限

上世纪中期，研究人员发现，正常大鼠肝细胞中存在包含退化细胞质的膜结构，但其丰度在灌注胰高血糖素之后或暴露于有毒物质之中时会大幅提升。

1963年，在认识到这种结构具有消化细胞内部分内容物的能力后，克里斯汀？德？迪夫创造了“自噬”这个词，并在发表的文章中广泛讨论了这个概念。几年后，基于电子显微镜的观察结果，科学家发现了哺乳动物细胞中也存在这种自噬现象。

接下来发现，自噬现象本身处于低水平状态，但在各种组织包括脑、肠、肾、肺、肝、前列腺、皮肤和甲状腺的分化和重塑期间，这种现象加剧。推测认为，自噬可能在饥饿或疾病发作时有所响应。此外，除了单细胞真核生物中存在自噬现象，在阿米巴原虫、眼虫、四膜虫、昆虫和青蛙等后生动物中也发现了这种机制。

在随后的几十年里，该领域的进展有限。许多迹象表明，自噬可能是一种重要的细胞过程，但其作用机制和规律并没有得到很好的理解。自噬过程实际上是短暂的，只存在于与溶酶体融合的大约10—20分钟内，这使得相关的形态学和生物化学研究非常困难。

直到上世纪90年代初，近30年过去，许多根本性问题仍无法确认：自噬过程是如何启动的？自噬体是如何形成的？自噬对细胞和有机体的存活有多重要？自噬在人类疾病中扮演什么角色？

酵母中发现自噬机制

东京大学副教授大隅良典决定用面包酵母作为模型系统研究自噬。检验了酵母细胞中确实存在自噬现象后，他开发出一种方法，能够识别和鉴定涉及这些过程的关键基因，他将第一个发现的突变基因命名为自噬基因1（apg1），随后报告了一系列真核细胞自噬机制必不可少的基因，命名为apg1-apg15。随着在酵母和其他物种中鉴定出的新自噬基因，atg作为基因缩写命名在此后的学术研究中得到统一使用。

在接下来的几年中，大隅良典克隆了atg基因，并描述了一系列蛋白质产物的功能，包括在实验室证明自噬能参与调解细胞物质合成、降解和重新利用之间的代谢平衡，影响生物生命过程特别是响应饥饿等方面的作用。

大隅良典的先驱性研究激起科学家对自噬的巨大兴趣。该领域已成为生物医学研究的最热门领域之一，自2000年起相关出版物的数量显着增加。

对健康和疾病影响广泛

分子的自噬特性提供了理解细胞生理学过程的新视野，也逐渐成为了解各种生理和病理状态的重要途径。自噬机制失调直接或间接地与人类疾病有关，将自噬机制用于治疗性干预手段变成特别有趣的科学目标。

第一个与重要疾病有关的自噬作用来自自噬基因beclin-1，它是becn1基因的产物，而becn1基因又是酵母atg6的同系物，它的突变在很大程度上导致人类患乳腺癌和卵巢癌。这一发现激起了科学家对癌症中自噬作用的极大兴趣。

后续研究表明，一些隐性人类染色体疾病与自噬能力受损有关，进而导致脑畸形、发育迟缓、智力障碍、癫痫、运动障碍和神经退行性病变等疾病发生。此外，自噬能消除入侵微生物，是激活免疫应答和控制感染性疾病的重要机制。

扩展阅读:一、癌症的病因人类为什么会患上癌症?众多医学研究及临床试验揭开了病魔的面纱:人体细胞电子被抢夺是万病之源，活性氧(自由基 ROS)是一种缺乏电子的物质(不饱和电子物质)，进入人体后到处争夺电子，如果夺去细胞蛋白分子的电子，使蛋白质接上支链发生烷基化，形成畸变的分子而致癌。该畸变分子由于自己缺少电子，又要去夺取邻近分子的电子，又使邻近分子也发生畸变而致癌。这样，恶性循环就会形成大量畸变的蛋白分子，这些畸变的蛋白分子繁殖复制时，基因突变。形成大量癌细胞，最后出现癌症。 癌症病情凶险异常，癌细胞的繁殖、扩散的速度极快，现代医药常常束手无策。目睹癌症肆虐，难道人类就要坐以待毙吗?其实不然。俗话说：一物降一物。临床试验证明：人体得到负氧离子后，由于负离子带负电有多余的电子，可提供大量电子，从而阻断恶性循环，癌细胞就可防止或被抑制。另外，负氧离子通过调节因恶性肿瘤引起的体内的酸碱失衡及氧化还原状况失衡，维持体内环境的稳定性，促进正常的细胞代谢，减轻，消除化疗的不良负作用，对患者的治疗非常有益。简言之就是负氧离子不仅可以有效的抑制癌细胞转移更能从根本上预防癌症的发生，绝杀癌症毫不留情。

医学家指出癌症病因是：机体在环境污染、化学污染(化学毒素)、电离辐射、自由基毒素、微生物(细菌、真菌、病毒等)及其代谢毒素、遗传特性、内分泌失衡、免疫功能紊乱等等各种致癌物质、致癌因素的作用下导致身体正常细胞发生癌变的结果，常表现为：局部组织的细胞异常增生而形成的局部肿块。癌症是机体正常细胞在多原因、多阶段与多次突变所引起的一大类疾病。

自噬2021-08-03

1、自噬的定义： 细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。

2、自噬的过程： 从一张图片开始：

步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。

步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。

步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。

步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

3、自噬的特性：

1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。

2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。

3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。

4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别

5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。

6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。

4、自噬过程的调控： 从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。

关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有：

抑制类

1）Class?I?PI3K?pathway（PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS?(Insulin?receptor?substrate)结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）

2）mTOR?pathway（mammalian?target?of?rapamycin）

mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506?binding?protein?12-rapamycin?associated?protein?1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class?I?PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化,rapamycin是最典型最常用的自噬激动剂.

激活类

1）Class?III?PI3K

结构上类似于Class?I?PI3K，但作用相反。3-MA是Class?III?PI3K的抑制剂,因此3-MA可以作为自噬的抑制剂.

5、自噬的研究方法： 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：

（一）自噬诱导剂

? ?1）Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin?：? 模拟内质网应激

2

）Carbamazepine/L-690，330/ LithiumChloride（氯化锂）： IMPase?抑制剂 （即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶）

3

）Earle's平衡盐溶液：? 制造饥饿

4

）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3KPathway抑制剂

5

）Rapamycin：mTOR抑制剂

6

）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

（二）自噬抑制剂

1

）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）?hVps34?抑制剂

2

）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

3

）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

1）观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic?vacuole，AV）

2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成：(常用)

GFP-LC3单荧光指示体系：由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。双荧光指示体系：汉恒生物科技（上海）有限公司已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

3）利用Western?Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。

自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

(Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响)

4)?利用Western?Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被认为是随机的,但是后来的研究表明有些蛋白是选择性降解的,在这些蛋白之中研究的最为透彻的是p62蛋白，p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。

5）MDC或者Cyto-ID染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

6）Cell Tracker?TM?Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

6、自噬体的发生： 目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membrane source（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中(phagophore到autolysosome)，VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的? 跨膜 蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。

7、自噬与细胞死亡的关系：

? ? ? 有必要说明一下的是，细胞死亡是一个非常复杂的过程，为了研究方便，需进行分类，但我们思考时不要局限于这些?人为的分类，而应注重于现象本身来研究其背后的机制。

? ? ??一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡，并把细胞的死亡方式分为2类：坏死和凋亡，因为两者有着明显的区别，其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性，内容物被释放出来，染料可自由进入细胞，而凋亡细胞保持完整，无内容物释放，染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡，这将在后面一一介绍，如同刚刚说明的那样，这些实验只能说明细胞膜的通透性（必要条件，不是充分必要条件），而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。一般认为坏死是被动的，不可控的，而凋亡是主动的，可控的。为了强调这一点，凋亡被定义为程序性细胞死亡（program celldeath，PCD）。但无论是坏死还是凋亡，都是一个过程，是需要时间的（尤其是凋亡，从启动到完成，细胞要执行很多反应），而且细胞死亡后都有“尸体”。

在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）,?核破裂（karyorhexis）、细胞皱缩（shrinkage）、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡（autophagic celldeath，ACD），它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为Type II cell death，相应的，凋亡为Type I cell death，坏死为Type III cell death。尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death? by? autophagy（自噬引起死亡）还是Cell death? with ?autophagy（死亡时有自噬发生，但不是直接原因）？对此，自噬研究领域“大牛”级专家Levine Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别，但通过阻断自噬，观察细胞的结局可区分开来：Cell death? by ?autophagy细胞存活，而Cell death? with ?autophagy细胞死亡。

8、自噬与肿瘤的关系：

? ? ? 与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，? 自噬具有维持细胞自稳的功能 ；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，? 自噬就是一个“备用仓库” 。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。

鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处：

1

）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。

2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。

自噬与肿瘤的关系可能是双重的。①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。②相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。③在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括?Beclin?1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。上述各种假设均有待证实。肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。

9、在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTracker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔 ?

Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeabilize），可采用0.1%SDS处理

自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法：

1）△ψmdissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。

2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜。

3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonylacridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。

4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。

5）Capase 3a?染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。

6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。

10、如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy？

第一步：利用上述方法证实细胞死亡

第二步：证实细胞死亡前发生了自噬

第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡

第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬

第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。

自噬的抑制根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下：

? ??1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002?也可用作Autophagy的抑制剂。? ??

? ? ? ?2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。

? ??3）对溶酶体降解的抑制:自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。

11、自噬领域的大牛们：

? ?1）YoshinoriOhsumi博士。日本科学家，克隆了第一个酵母自噬基因Atg1以及LC3，主要成果在酵母模型下自噬研究；

2

）Daniel?J.?Klionsky博士。美国科学家，主要成果在酵母模型的自噬研究。最早在《Science》上发表综述介绍自噬，2005年创办了第一本自噬杂志《Autophagy》；2007年举办了第一次自噬国际会议，为自噬的宣传做了大量工作。

3

）Noboru?Mizushima博士。日本科学家，2001年主要报道了Atg5的功能，被认为是哺乳动物分子机制研究的第一环，以及参与克隆自噬标志物LC3，而且制备了一些ATG基因敲除老鼠以及LC3转基因老鼠；

4

）Beth?Levine博士。美国科学家，首先克隆了第一个哺乳动物自噬基因Beclin?1；

5

）Guido?Kroemer博士。法国科学家，是细胞凋亡和死亡领域中引用率第一的科学家。在细胞凋亡研究中作出了卓越贡献而且涉猎及其广泛。目前也从事自噬研究，例如p53，Bcl2家族与细胞自噬。

6

）Tamotsu?Yoshimori博士。日本科学家，2000年克隆了目前广泛使用的自噬标志物LC3文章的通讯作者，而且也参与了2010年ATG5机制研究，是通讯作者之一。在方法学上也有关键贡献。目前主要研究ATG14和ATG16。值得注意的是，上述三位日本科学家合作紧密，克隆了目前大部分的ATG基因，经常共享文章通讯作者。

7

）Patrice?Codogno博士。法国科学家，2000年首先证实了PI3K信号通路在自噬的作用，I型抗自噬，III型促自噬，是自噬信号通路的开拓者。

8

）Ana?Maria?Cuervo博士。美国科学家，是分子伴侣自噬的开拓者。

9

）David?Rubinsztein博士。英国科学家，2004年首次报道了mTOR与自噬的关系，抑制mTOR促进自噬。目前利用rapamycin诱导自噬成为经典模型之一。2010年Nature的报道首次证实了自噬对mTOR的负反馈调节。

12、自噬信号通路：
?1）KEGG
?2）Abcam
?3）CST
?4) Enzo

13、我在做自噬课题中的一些心得：

自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？

自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融合受阻（如使用了氢化氯喹或氯喹，另外，溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合），使自噬体不能降解而积聚，这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。

鉴于这样的原因，单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据，可联用多个方法来判断：

? 1

）加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂，如氯喹，观察自噬潮的变化。

? 2

）或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。

? 3

）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶体膜蛋白）。

? 4

）检测胞浆长寿蛋白的降解。

?WesternBlot

检测LC3时除了上述的原因外，还有几个需考虑到的地方：

1

）抗体的亲和力：有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高

2

）结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。

3

）自噬过程很快，一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短，其中自噬体形成阶段更迅速，数分钟即可完成，而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此，设置多个检测时间点（time frame）是非常重要的。

细胞自噬这一概念是不是2016年诺贝尔生理学获医学奖

细胞自噬这一概念是2016年诺贝尔生理学获医学奖，获奖者为日本分子细胞生物学家大隅良典。

大隅良典是日本东京工业大学前沿研究中心荣誉教授，1996-2009年曾任日本国家基础生物学研究

所教授，主要致力于细胞“自噬作用”的研究。他在有关细胞“自噬作用”的研究中取得了重要成

果，为阐明细胞适应环境的机制、“自噬作用”原理及其生理意义作出重大贡献。

自噬这一概念最早出现于上世纪1960年代，当时研究人员发现细胞能够消灭自身内部物质，方式是

将其包裹进一个膜结构中，从而形成小型囊体并被输运至被称作“溶酶体”的回收机构进行分解。

对这一过程开展研究非常困难，这也就意味着我们对其知之甚少。

直到上世纪1990年代，日本科学家大隅良典利用面包酵母找到了与自噬作用有关的关键基因。随后

他开始致力于阐明酵母菌体内自噬作用的背后机制，并发现与之相似的复杂过程也同样存在于我们

人类的细胞内。他的研究开启了理解自噬作用在许多生理过程中关键作用的崭新道路，如生物体对

于饥饿的适应或者机体对于感染的反应。自噬基因的突变会导致疾病的发生，自噬作用机制在一些

类型的疾病，如癌症和神经疾病等病症中也发挥了作用。

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