CRISPR专利争夺战或尘埃落定：张锋团队取得决定性胜利

2017年2月16日 讯 /生物谷BIOON/ --北京时间2月16日（美东时间2月15日），美国专利局审查与上诉委员会作出裁决，判定张锋（Feng Zhang）及哈佛大学与麻省理工学院Broad研究所申请的CRISPR基因编辑专利，与加州大学伯克利分校研究者Dougna和欧洲合作者Charpentier的CRISPR发现，并不存在冲突，"no interference in fact"。这也就表明，两家的研究发现并不重复，因此张锋（Feng Zhang）与Broad研究所得以继续保留其2014年获批的CRISPR专利权；这场天价的专利争夺战，至少在当前已经结束，张锋取得了巨大胜利。

2012年，一种名为“CRISPR/Cas9”的DNA编辑技术横空出世。从那时开始，CRISPR/Cas9被用于很多生物系统中进行基因组编辑，在各大顶级期刊上发表了大量文章，可算是赚足了眼球。随着CRISPR/Cas9基因编辑系统逐渐进化，并趋于成熟，从学术界的共享走向专利申请以及商业化的道路也逐渐清晰起来。然而科学家们还面临着很多问题，比如，CRISPR/Cas9的专利申请利。

加利福尼亚大学的研究者Jennifer Doudna及瑞典于默奥大学的研究者Emmanuelle Charpentier首先联合提出了专利申请，2012年她们首次在Science杂志发表论文阐明了Cas9酶可以定向切割离体DNA的特殊位点，同时于当年5月25日提交了专利申请；此时来自MIT Broad研究所及哈佛大学的研究者张锋（Feng Zhang）在2013年所发表的一篇论文中阐述了CRISPR–Cas9技术在哺乳动物机体中的应用，同时他们也于2012年12月12日提交了专利的申请。

尽管伯克利的研究小组首先提交了专利申请，但随后张锋（Feng Zhang）团队提交了加快审核专利的计划，并于2014年4月最终获得了该专利；随后来自伯克利的研究者要求对Broad研究组的最早专利以及另外11项专利进行专利干涉，2016年1月11日美国专利商标局（USPTO）接受了伯克利研究小组的请求。一场围绕CRISPR-Cas9的专利大战也随之打响了，两个团队分别号称自己最先发明了这项技术，双方各执一词，整个生物界莫衷一是。

此前双方都已提交了大量文件，而他们争论的焦点不仅在于谁发明了CRISPR，还有谁首先解决了这项科技关键问题。这就是龃龉所在。伯克利认为2012年Doudna的研究发表后，任何人都能够将这一技术用于编辑真核细胞（一种人类和动物细胞）。这一技术的衍生发展显而易见，易如反掌；因此张锋（Feng Zhang）的专利缺乏法律依据。Broad研究所则认为，这绝无可能，将理论知识真正应用于编辑复杂器官是一次巨大的进步，张锋获得专利是实至名归。

由USPTO专利法官组成的小组会倾听来自双方的证据，以此来确定哪个团队发明了CRISPR–Cas9基因编辑技术，大部分的行动都将通过电话或书面文件的形式来传递实现，同时可能会存在一些口头辩论，而且还会包含学术发明者的相关证词。来自北卡罗来纳周立大学的法学学者John Conley说道，通常专利干涉具有较高的科技含量，对于我们来说很难引用更为复杂的法律，而USPTO法官小组将主要确定哪个团队是首个利用CRISPR–Cas9进行基因编辑的团队，同时还应当确定哪个团队先提出的这个发明思路。整个过程可能非常混乱，在先发明主义 （first-to-invent）专利的时代，许多公司会保留发明者的原始笔记，而且当公司的某个人有某种创新性想法时，他就会记录到笔记本上，并且在未来的专利纷争中拿出来作为一定的证据，而目前很少有学术研究的实验室达到这样的高度。

在今天的裁决中，法官们认为在张锋（Feng Zhang）之前没有研究人员能够绝对地确认，CRISPR能用于有核细胞（比如人类细胞），而张锋（Feng Zhang）研究团队的发明，并非简单的扩展。因此，他们判定张锋（Feng Zhang）得以保留其专利。然而在听取裁决后，加大伯克利分校发表声明，她们表示尊重裁决，但同时也坚持认为是Dougna与Charpentier首先发明了CRISPR系统。

在专利大战的背后是巨大的商业利益，此次裁决后，Editas Medicine股价暴涨超过30%以上。迄今为止，美国专利局已经授予50项与CRISPR有关的专利，其中Broad研究所和MIT拥有15项。Broad研究所方面称，全世界的科研人员可以用他们的技术进行学术研究，但是厂商必须付费使用。值得一提的是，专利判决并不会影响CRISPR-Cas9技术在科研领域的应用，未来我们将会继续期待CRISPR-Cas9为人类健康做出的更多贡献。

谁才是CRISPR技术的所有者

　近年来，CRISPR/Cas9风暴席卷全球。这项基因组编辑技术在短短几年内迅速应用于世界各地的实验室，并催生了上千篇文章的发表。然而，麻省理工学院（MIT）的《Technology Review》杂志提出了一个问题，谁才是CRISPR技术的所有者？ 立即索取更多资料 生物通 www.ebiotrade.com
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近年来，CRISPR/Cas9风暴席卷全球。这项基因组编辑技术在短短几年内迅速应用于世界各地的实验室，并催生了上千篇文章的发表。然而，麻省理工学院（MIT）的《Technology Review》杂志提出了一个问题，谁才是CRISPR技术的所有者？生物通 www.ebiotrade.com
一个月前，“科学突破奖”（Breakthrough Prize）揭晓。加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和德国亥姆霍兹传染研究中心的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR技术方面的重要贡献而获奖，且每人获得了300万美元的奖金。
这一领域的另一位风云人物，Broad研究院的张锋（Feng Zhang）虽然没有获得科学突破奖，但在今年4月获得了CRISPR/Cas9的首个专利。他的研究中心控制着这一技术的每个重要商业应用。生物通 www.ebiotrade.com
那么问题来了，这个备受瞩目的奖项和专利为何会落入不同人的手中？究竟是谁发明了它？“这一领域的知识产权相当复杂，”CRISPR Therapeutics公司的CEO Rodger Novak谈道。Emmanuelle Charpentier是这家公司的创始人之一。
Tech Review的记者Antonio Regalado指出，张锋与Doudna共同创立了Editas Medicine公司，它获得了Broad的技术授权。不过，在张锋成功申请专利之后，Doudna就与该公司断绝了关系。她将她的知识产权（专利申请中）授予了另一家竞争性的公司Intellia Therapeutics。然而，让事情更加复杂的是，Charpentier又将她在同一专利申请中的权利出售给了CRISPR Therapeutics。生物通 www.ebiotrade.com
此外，围绕这一技术的科学信用，那也是错综复杂。2012年夏天，Doudna、Charpentier及她们的团队发表了一篇文章，证明CRISPR/Cas9系统可以作为一种可编程的DNA编辑工具。半年后，张锋博士以及哈佛大学的George Church发表文章称它可应用于人类细胞，不久后，Doudna也发表了类似的结果。
但是，张锋表示他对Doudna和Charpentier的工作知之甚少。为了支持他的专利申请，他提交了实验室笔记本的照片，表示他在2012年年初就开始了这方面的研究，早于Doudna和Charpentier。生物通 www.ebiotrade.com
Charpentier表示：“我可以说的是，我和Jennifer Doudna是在我的实验室中开展研究。这里的一切都很夸张，因为这是一项人们很容易学会的技术。事情发生得太快了。”
Regalado在文中写道：“目前还没有CRISPR药物。但是如果CRISPR真的如科学家想象得那么重要，对这一基本技术的商业控制将价值数十亿美元。”也许，这场专利之战才刚刚开始。（生物通 薄荷）

CRISPRa基因过表达技术

上回说到，基因功能研究，最常用的策略就是功能获得和功能失活。基因过表达、基因干扰、基因敲除，这三板斧挥出去，配合下游的转录谱分析、表型分析，基因功能的神秘面纱，往往就能解开一角。

基因过表达技术，通常是指将目的基因的ORF构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因表达量增加的目的，可以使用的载体类型有Virus-Free转座子载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。

CRISPRa(转录激活)，作为基因过表达技术的新成员，是通过催化失活的Cas9（dCas9）连上转录激活子，来实现促进基因组特定位点的转录。

目前CRISPRa已经发展出好几个新版本。MIT的CRISPR先驱张锋通过改造dCas9和sgRNA优化了转录机器的招募，成功将RNA表达水平提升了一个数量级。张锋团队用自己的改良版CRISPRa激活了十个基因,研究显示，这些基因的转录都得到了两倍以上的增涨，许多基因的活性甚至有了几个数量级的增加。他们发现，CRISPRa离转录起始位点越近，转录激活的效果就越强。如果CRISPRa靶向转录起始位点的上游（超过200bp），触发的转录就会更为温和，更接近生理水平。通过这一途径揭示了基因表达量与表型强度之间的线性关系。

加州大学的Jonathan Weissman研究团队在dCas9上融合了一连串短肽（也就是SunTag array），这些短肽相当于一套分子挂钩，能在细胞中招募多拷贝的转录激活子，生成强劲的信号。

综合看CRISPRa（基因激活）系统是用于转录激活内源性基因的强大工具。完整的CRISPRa系统包含三个组分，每个组分分别由单独的载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。

gRNA/MS2表达载体，包括两个138-nt发夹RNA适体，形成噬菌体MS2衣壳蛋白的结合位点。这些发夹RNA适体与gRNA连接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

MS2/P65/HSF1辅助载体驱动由MS2，p65（NF-kB的反式激活亚基）和HSF1（人热休克因子1的激活结构域）组成的三结构域融合蛋白的表达。

dCas9/VP64辅助载体驱动催化失活变体dCas9和合成型VP64反式激活结构域融合蛋白的表达。

当这三种载体共转导细胞时，用户定制的gRNA可能会募集MS2/P65/HSF1（通过MS2结合发夹适体与gRNA连接）和dCas9/VP64（通过CRISPR/Cas9复合物组装） 到gRNA靶位点，从而组装出强大的SAM复合物。这些SAM复合物可通过VP64，p65和HSF1激活结构域之间的协同作用实现靶位点的强烈转录激活。

该载体系统可用于激活单个或一系列基因的转录，也可用于基因组的大规模筛选，使用gRNA序列文库来产生gRNA/MS2表达载体文库。?

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.??

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi:?10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPRa vs ORF传统过表达技术

相比于传统ORF稳转过表达技术，CRISPRa通过激活内源性启动子高效转录，从而促进基因表达，不需要额外构建外源性表达元件，不受基因转录本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此，CRISPRa技术在长转录本基因过表达研究、单基因多转录本的整体激活研究具有不可替代的优势。

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