我国首次利用荧光偏振技术筛选新药

日前，记者从中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心了解到，该中心科研人员在我国首次制备成功两种荧光偏振技术专用的荧光标记药物靶点配基，建立了两种高通量药物筛选模型。

荧光偏振技术（又称荧光极化技术），是根据分子运动频率和荧光偏振原理建立的荧光分析技术。应用该技术可以灵敏地分析分子间的相互作用，特别是对于大分子（如蛋白质）与小分子（如化合物）之间的相互作用，可以通过荧光偏振的角度变化得到特异的反应，是一种理想的研究方法。国外已经将此项技术应用在多种药物的筛选中，而我国一直没有应用。

这项研究为国家科技部支持的“863”计划“创新药物与中药现代化”重大科技项目中的“药物筛选平台”专项。在该所副所长杜冠华教授的指导下，张天泰、王金华两位博士后等科研人员反复实验，突破了小分子荧光标记的关键技术，制备了两种荧光偏振技术专用的荧光标记药物靶点配基；通过竞争结合的方法，建立了两种高通量药物筛选模型，可灵敏地筛选出能够与靶点相结合的小分子化合物。

据介绍，同其他相关方法比较，该方法操作简便，灵敏度高，假阴性或假阳性率低，全部试剂可以在实验室制备，降低了筛选成本，特别适用于高通量药物筛选，实现了每日筛选样品1万个的高通量。目前，这两种模型已经完成约16万个样品的筛选，发现了10个具有研究价值和开发前景的活性样品，为新药研究提供了重要信息。

据悉，由该中心建立的这两种高通量药物筛选模型均针对心血管系统的药物靶点，用于筛选治疗心血管疾病的药物，目前国内、外尚未见同样模型的报道。由该模型筛选出的活性样品（化合物），不仅可以用于新药研究和开发，而且对于药物新靶点的研究也具有重要价值。

蛋白质：蛋白质相互作用方法与应用的内容简介

《蛋白质:蛋白质相互作用方法与应用》共35章。首先介绍了信号转导和人类遗传学/药物基因组学等问题，并强调蛋白质——蛋白质相互作用在其中发挥关键作用。然后分三部分介绍了如下内容：6个基于标准分子生物学、生物化学和微生物学技术建立起来的、用于分析蛋白质——蛋白质相互作用的方法；6种鉴定和识别蛋白质——蛋白质相互作用的生物物理学方法；近期改进过的与GST沉降和免疫沉淀相关技术、两个补体系统、渐增截断方法、蛋白成束、高通量方法。最后讨论蛋白质——蛋白质相互作用数据的整合及模型构建，以及这些模型在临床治疗方面的应用。
《蛋白质:蛋白质相互作用方法与应用》内容详尽、具体，为蛋白质——蛋白质相互作用研究的关键技术提供操作指南，并提供大量识别和操作蛋白质的技术和相关综述，覆盖了迄今最完全、最有效的分析蛋白质——蛋白质相互作用的技术及原理，从理论的阐述到相关方案的列举和比对，包括经典的分子生物学、生物化学和微生物学方法、生物物理学方法、计算分析和相互作用模型的构建等，系统性好，浏览方便，是生命科学研究者很好的工具书。 第一部分　概述
第1章　蛋白质一蛋白质相互作用的结构基础
第2章　蛋白质一蛋白质相互作用的定量分析
第二部分　离体实验方法
第3章　等温滴定热分析技术检测蛋白质一蛋白质相互作用
第4章　应用圆二色光谱分析蛋白质蛋白质相互作用
第5章　核磁共振谱分析蛋白质一蛋白质相互作用
第6章　应用表面等离子共振技术研究视紫红质一G蛋白相互作用
第7章　使用光散射技术确定蛋白质复合物的化学计量
第8章　沉降平衡研究
第9章　模拟小区带凝胶过滤色谱法检测蛋白质一蛋白质相互作用
第10章　荧光凝胶阻滞实验检测蛋白质一蛋白质相互作用
第11章　荧光偏振实验技术定量研究蛋白质一蛋白质相互作用
第12章　通过印迹叠加或FarWestern印迹研究蛋白质一蛋白质相互作用
第13章　GST融合技术研究蛋白质一蛋白质相互作用
第14章　亲和毛细管电泳分析蛋白质一蛋白质相互作用在靶向药物发现中的应用
第15章　羟基蛋白质足迹法筛选蛋白质一配体相互作用
第16章　利用噬菌体展示和多价大分子技术设计蛋白质一蛋白质相互作用抑制剂
第三部分　在异种系统中检测蛋白质蛋白质相互作用
第17章　基于转录激活的细菌双杂交系
第18章　应用酵母双杂交系统检测相互作用的蛋白
第19章　利用双诱饵酵母杂交系统分析蛋白质一蛋白质相互作用
第20章　用于膜蛋白研究的分裂泛素酵母双杂交系统
第21章　反向酵母双杂交技术
第22章　哺乳动物细胞双杂交分析检测体内蛋白质一蛋白质相互作用
第23章　对转染细胞进行免疫共沉淀
第四部分　活细胞中蛋白质蛋白质相互作用
第24章　荧光共振能量转移显微技术
第25章　应用流式细胞分析和荧光共振能量转移检测活体细胞内分子间相互作用
第26章　荧光相关谱技术——定量检测分子相互作用的新型技术
第27章　共聚焦显微镜检测细胞内蛋白质的共定位
第28章　蛋白质片段互补法分析生物化学网络
第29章　细胞内蛋白质交联
第五部分　基于蛋白质组学的技术
第30章　蛋白质蛋白质相互作用的计算机预测
第31章　用亲和力方法研究磷酸化依赖的相互作用
第32章　蛋FI质复合物的双向凝胶电泳分析
第33章　凝胶电泳分离的相互作用蛋白质用于质谱分析前的样品制备
第34章　应用固相同位素标记和质谱进行蛋白质定量分析
第35章　研究蛋白质蛋白质相互作用的网络资源专业词汇英中对照 人类基因组测序的完成标志着一个新的生物学研究时代——后基因组时代(post—genomic era)的来临。全基因组的序列信息并不足以解释及推测细胞的各种生命现象，蛋白质才是细胞活性及功能的最终执行者，蛋白质之间复杂的相互作用决定着生物体的复杂程度，科学家们的研究热点又回到了蛋白质上。机体细胞内蛋白质之间相互交叉作用可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且对于提示生长、发育、分化、凋亡以及理解生物调控机制等生命活动规律至关重要，为探讨重大疾病的机制、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供了重要的理论基础。因此，了解、阐明蛋白质之间相互作用的机制意义重大，是后基因组时代生命科学与其他学科交叉研究的热点。

高通量药物筛选的简介

1. 化合物样品库
化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。其中,人工合成又可常规化学合成和组合化学合成两种方法。
2.自动化的操作系统
自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。
3.高灵敏度的检测系统
检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。
4.数据库管理系统
数据库管理系统承担4个方面的功能: 样品库的管理功能;生物活性信息的管理功能; 对高通量药物筛选的服务功能; 药物设计与药物发现功能。 常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。
1.分子水平的药物筛选模型:受体筛选模型;酶筛选模型;离子通道筛选模型
1.1受体筛选模型:指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。
1.2酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点,酶的反应底物,产物都可以作为检测指标,并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括1) 适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3)单时间点数器, 需测量产物的增加和底物的减少。
1.3离子通道筛选模型: (1)贝类动物毒素的高通量筛选,其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。
2.细胞水平药物筛选模型
观察被筛样品对细胞的作用,但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括: 内皮细胞激活; 细胞凋亡; 抗肿瘤活性; 转录调控检测; 信号转导通路; 细菌蛋白分泌; 细菌生长。
高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点:反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。但是，高通量筛选作为药物筛选的方法,并不是一种万能的手段，首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，随着对高通量筛选研究的深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。 光学测定技术。美、英两国研究人员在高通量筛选检测中，努力进行了光学测定方法的研究，建立了大量的非同位素标记测定法，如用分光光度检测法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活剂等，均获得成功。
放射性检测技术。美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中，应用放射性测定法，特别是亲和闪烁（SPA）检测方法，使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。该方法灵敏度高，特异性强，促进了高通量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。
荧光检测技术。美国学者GiulianokA研究认为，采用FLIPR（fluor ometricimaging readet）荧光检测法，可在短时间内同时测定荧光的强度和变化，对测定细胞内钙离子流及测定细胞内pH和细胞内钠离子流等，是非常理想的一种高效检测方法。
多功能微板检测系统。由西安交通大学药学院研制的1536孔板高通量多功能微板检测系统，是国际上先进的高通量检测系统，它可使筛选量进一步提高，现已在该院投入使用。
1．基本原理
高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。
1.1 化合物样品库
高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选。因此通过高通量药物筛选发现先导化合物(leading compounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。化合物样品的数量是指不同样品的数量。化合物样品的质量主要由化合物结构的多样性决定的。许多活性反应基团(reactive groups)使初筛的假阳性大量增加，剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。
化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。
人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。采用常规化学合成的纯化合物一直是国外制药企业建立化合物样品库的主要来源。它们通过长年积累的化合物建立化合物样品库，通过购买和化合物交流使化合物样品库的数量和质量大幅度提高。
组合化学(combinatorial chemistry)的出现为大量增加化合物的数量提供另外一种来源。组合化学的基本原理是采用适当的化学方法，在特定的分子母核上加入不同的基团，在同样条件下，产生大量的新化合物。这种方法在化合物的结构改造和优化方面已经表现出强大的优势。但是，由于该方法是基于母核结构的改造，因此产生的大量化合物在结构多样性方面尚有极大的不足。解决组合化学产物结构多样性的问题，已经成为化学研究人员的研究课题。
从天然产物中分离出来的化合物，母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。因此，增加样品库中具结构多样性的天然化合物及其衍生物是提高样品库质量的一个重要途径。跨国制药企业为了增加高通量筛选的阳性率，已经或正在寻求助买我国的天然产物单体。
1.2 自动操作系统
高通量药物筛选每天要对数千化台物样品进行检测，工作枯燥、步骤单一，人工操作容易疲劳、出错。自动化操作系统采用微孔板作为反应容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通过条形码加以标记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作，并将操作结果及相关数据存贮在计算机内，使筛选结果准确，实验过程快速。
自动化操作系统编程过程简洁明了，可操作性强。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组成都分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。
除了实验步骤的需要以外，自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选模型中是必需的。
自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈(hotel)。所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。因此，高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。
由此可见，高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个部分组成。不同的单位可根据主要筛选模型类型、筛选规模选购不同的部分整合成为一个完整的操作系统。
1.3 检测系统
快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。
1.3.1 液闪计数 放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(time-resolved coincidence circuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。
亲和闪烁分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一种新的液闪分析法。该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。
1.3.2 分光光度法 为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。以Molecular Device公司的spectra 190为例，它采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。测定波长以2nm为间隔，可以在190nm一850nm间进行选择。对未知物质，可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。因此，大大增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。方便、快速、准确、自动化程度高。分光光度法高灵敏仪器同自动化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。
1.3.3 化学发光检测 化学发光指生色物质在酶促作用下，化学能以光子的形式释放出来。化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。辉光型化学发光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等为基础的发光反应。其发光时间较长且稳定。而以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物的发光反应则是闪光型发光反应，其发光时间较短。由于时间分辨及偶合回路技术的使用，对于背景的去除更为有效，使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。在单孔多点喷射技术中，用于检测化学发光的光导纤维末端带有一喷头，用来加入反应性底物。反应性底物从100个小孔喷出，使反应性底物加入孔中后即可均匀混合。发光反应同时启动后，可立即进行测定，对于闪光性化学发光的测定更为有利。
1.3.4 激发荧光检测 新型激发荧光检测仪在传统仪器的基础上，用连续的激发光谐和测定光谱取代固定光谱，使模型的建立更具备灵活性。荧光检测方法灵敏是因为多数荧光基团都有短暂的半衰期，即使用较弱的激发光源也能获得大量的光子流。这种特性以及多种可采用的荧光模式，使得荧光检测技术成为高通量筛选必不可少的应用手段。荧光技术在均相筛选分析中广为应用。其中，包括荧光共振能量转移(FRET)，荧光偏振(FP)，时间分辨荧光(TRET)以及荧光相关谱(FCS)等技术。
1.4 数据库管理系统
高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选。与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。
样品库的管理功能：化合物样品库对进行高通量药物筛选的化合物样品的各种理化性质进行存储管理。对每一个新入库的化合物进行新颖性分析，排除结构雷同的化合物，避免不必要的筛选。由于高度反应性基团增加了假阳性出现的机率，样品库对新入库的化合物进行反应基因检测以去除这类化合物。
生物活性信息的管理功能：生物活性库存贮每一化合物经过不同模型检测后的结果，并根据多个模型的检测结果对化合物的生物活性进行综合评价。
对高通量药物筛选的服务功能：高通量药物筛选的工作量大，自动化程度高，也涉及到许多繁琐的工作。高通量药物筛选数据库管理系统对与药物筛选相关的业务往来通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行管理，使高通量药物筛选的各个环节程序化、标准化。
药物设计与药物发现功能：高通量药物筛选产生大量的化合物结构信息，随着筛选的进行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量药物筛选数据库管理系统通过对同一模型不同的呈现阳性反应的化合物结构进行分析，找出其构效关系，从而为药物设计提供参考。
1.5 筛选模型
是指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小，而且，反应具有较高特异性和敏感性，因此对于筛选模型也要求较高。这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。基因水平的药物筛选模型，使药物筛选模型的范围更为广泛。
1.5.1 以酶为靶的高通量筛选 以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。
基于放射性的方法多是将底物标记，测定放射性产物的生成。Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制剂(抗真菌)的高通量筛选方法。将含有酶的菌丝提取物、α-淀粉酶和UDP-14C-葡萄糖加入96孔板的孔中，温孵、反应。终止反应后，滤去未被合成进入的底物。闪烁计数检测滤器上保留的(1,3)β-葡聚糖，指示酶活性大小。
也有将酶标记，测定被特异结合的酶的方法。Vollmer等建立了一种以青霉素结合蛋白(PBP)为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。将莫诺霉素(moenomycin)结合于一种小球上，制成混悬液，加入96孔板，然后加入3H标记的PBP(细菌膜粗提物)和受试化合物，孵育、过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得的放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其影响。
另外，基于放射性而无需过滤分离的SPA也有应用。Brown等建立了内源性肽酶的水解活性检测方法，用以研究其抑制剂。用3H标记的肽底物，通过生物素(biotin)与抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA闪烁球相连。酶解使3H随肽的断裂而离开闪烁球。测定3H放射性作用于闪烁球产生的闪烁信号的丢失量，即指示酶活性大小。
基于比色、荧光等的方法有一些报道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制剂的筛选方法。酸性条件下，脂的过氧化物能把Fe2+氧化为Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenol orange)，产物在可见光区620nm有强烈吸收。在96孔板上测定。Zhang等建立了HIV逆转录酶抑制剂(抗病毒药物)的高通量筛选方法。方法使用了“同质时间分辨荧光”(homogenous time resolved fluorence，HTRF)技术，既实现了非分离操作(同质)，又避免了放射性同位素的使用。该方法基于逆转录酶能很容易地将核苷酸类似物(如生物素-11-dUTP)引入新生DNA链。在96或384孔板上，将生物素化的引物/模板与抗生蛋白链菌素-铕在板孔中混合孵育，加入逆转录酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物启动反应。反应60min后，加入链亲和素-别藻蓝蛋白(streptavidin-allophycocyanin)，孵育，用HTRF分析仪读取数据。该法也可用于多种其他的核酸聚合酶。
1.5.2 以受体为靶的高通量筛选 以受体为作用靶的高通量筛选方法。检测功能反应的优点是易于区分激动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低，而引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量，既高效且节省成本。检测第二信使或下游机制如磷酸化，传统方法也比较麻烦，不适于高通量检测，但将这些机制与报告基因相偶联则能克服。
1.5.3 以离子通道为靶的高通量筛选 Negri等建立了贝类动物毒素的高通量筛选方法。其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)结合位点，用放射性配体(3H-STX)进行竞争性结合试验考察受试样品。Yong等用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。
1.5.4 以核酸为靶的高通量筛选 Hamasaki等建立了以16S rRNA编码区结构和HIV-RRE RNA结构为靶的抑制剂的高通量筛选方法。寻找类似氨基糖甙类抗生素而亲和力更高或作用于相同核酸的其他位点的新化合物，以及不易被代谢失活的新化合物。方法基于当含芘的氨基甙类似物结合于RNA时，芘的荧光被淬灭的原理。在96孔板上，将芘碳酰巴龙霉素(PCP)，RNA结构配成溶液后加入有受试化合物的板孔中，用荧光读板器考察荧光恢复的程度。
1.5.5 以细胞功能为基础的高通量筛选
1.5.5.1 内皮细胞激活 内皮细胞激活是急慢性炎症过程中重要的组成环节。Rice等以E选择蛋白在细胞表面的表达作为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法。建立人脐静脉内皮细胞培养系统。IL-1刺激下，E选择蛋白在内皮细胞表面的表达用ELISA方法定量。方法包括细胞固定、加液、加受试化合物等操作，能保持细胞完整，不昂贵，可重复，筛选速度可达每星期1000种化合物。适用化合物范围很宽，并且方法用细胞作为检测对象，使能够较早地发现细胞对化合物的摄取及化合物的细胞毒性。
1.5.5.2 细胞凋亡 Erusalimsky等建立了新型细胞凋亡调节物的高通量筛选方法。细胞预先用3H 胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的，捕获完整的染色质和高分子量DNA。另一个装有DEAE活性基团，捕获低分子量DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。
1.5.5.3 抗肿瘤活性 Lu等建立了用高通量“生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法，考察受试分子(类维生素A及类维生素A相关分子)对许多不同细胞系的效应特点。检测指标包括：(1)肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括了大量不同的组织和(或)肿瘤来源。细胞暴露于受试化合物5d后，用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测，用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292非小细胞肺癌细胞，暴露于受试物一定时间。然后对细胞进行清洗，植于无受试物的培养介质共7d。用结晶紫对细胞染色，考察集落形成情况。(3)凋亡检测，用ELISA方法测量细胞DNA破碎。(4)转录调控检测，用以考察受试化合物是否有类维生素A受体介导的转录抑制作用。方法是将HeLa TK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染，与受试物一起培养，用ELISA方法检测CAT活性。
1.5.5.4 G2检查点(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法。将MCF-7m p53细胞培养，种在96孔聚苯乙烯组织培养板上。照射使细胞进入G2静止期，加入受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，从而得到从G2期释放进入M期的细胞数量，即抑制G2检查点程度。
1.5.5.5 信号转导通路 Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量筛选方法。构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGFβ高诱导的克隆。将细胞植于96孔板，与受试化合物孵育后，稀释并加入Steady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。
1.5.5.6 细菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。
1.5.5.7 细菌生长 Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌，因其具有生长迅速以及非感染性的特点。通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。用96孔板的形式，1d内可以测试数千个样品。
2．生药活性成分的高通量筛选
样品是高通量药物筛选的物质基础，样品库来源的化学多样性是决定高通量筛选技术能否成功的关键因素之一。前面我们谈到，化合物样品主要有常规化学合成、组合化学合成和从天然产物中分离纯化几个来源。而从天然产物中分离出来的化合物，由于其母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们具有人工合成化合物所不能比拟的优势。
我国拥有非常丰富的药材资源，几十年来，我们应用药理学手段，对我国的传统药物进行了大规模的研究和筛选，取得了巨大成就。但是，仅仅依靠传统的药理实验方法，既耗时，劳动强度又大，还需要使用大量实验动物，显然不能适应大量样品的同时筛选。虽然经过努力，已从生药中分离、提取、纯化出大量化合物，但由于研究手段的落后，使大量分离出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物资源的极大浪费。
因此，将高通量筛选技术应用于生药的活性成分研究，既是对高通量筛选技术的不断完善，又是将这一技术应用于中药现代化研究的有益尝试。
如何对生药的活性成分进行高通量筛选呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量筛选基本一致，区别主要在于筛选前需要从生药中将化合物提取出来并进行适当的分离和化学多样性的评价。相同的就不再赘述，这里主要谈一下提取、分离和多样性评价的问题。
2.1 提取 由于高通量筛选需要大量的样品来源，所以常规的提取方法显然不能满足这一要求。寻找一个快速、高效、连续、自动化的提取方法显得迫在眉睫。加速溶剂提取技术是一个新的提取技术，在准备好样品和对提取方法（或程序）进行设定后，自动进样和自动收集装置就可以连续对最多24个不同样品自动完成样品的提取和提取液的收集，简单方便。应用这一技术，可以得到大量的生药的提取物。
2.2 分离及化学多样性评价 我们都知道，生药的化学成分相当复杂，通过提取得到的提取物往往是大量单体组成的混合物，所以筛选前需要对生药的提取物进行适当的分离。在众多的分离手段中，制备型HPLC应该是最为理想的，它具有快速、高效、自动化等诸多优点。
分离完成后还需要对分离的物质进行化学多样性的评价，以提高高通量筛选的效率。以前，这种评价多是基于物种的地理分布、生物学分类、化学分类以及基源等关系，随着科技的进步，多种现代化手段开始应用于化学多样性的评价。其中，色谱-电喷雾质谱联用（HPLC-ESI-MS）技术在这方面做出了有力的尝试。首先，它做出成分的离子信号（m/z）对保留时间的平面图，然后对这些数据进行统计学的相似度评估从而对样品的多样性进行定量的评价。接着，三维的HPLC数据被转换为CDF文件格式并传输到UNIX工作站。数据文件中的每一个离子（包括保留时间、质量、离子强度等数据）被定位在一个二维图谱中，保留时间和质量分占一个轴，离子强度数据储存在位点中。滤除噪声以后，离子的中心时间和中心质量被计算出来。根据对LCMS的数据处理，混合物间的相似度被定量地计算出来。这种数据处理基于以下的一种关系，这种关系表征了样品1中的离子i和样品2中的离子j的“化学空间”距离。
其中，ti表示离子i的色谱保留时间，mi表示离子i的质荷比（m/z），wt是保留时间的权重系数，wm是质量的权重系数。dij是离子i和离子j的欧几里的距离，n1和n2分别是样品1和样品2中确认的离子数。sij是离子i和离子j之间的相似度（0-1），相似度值为1表明是相同样品，相反，相似度值接近0则表明样品具有很高的化学多样性。通过这种方法，可以很好的解决样品化学多样性的评价问题。

荧光偏振法快速准确高通量检测IgG和含Fc段衍生物

荧光偏振法快速、准确、高通量检测IgG和含Fc段衍生物

Dr. Carolanne Doherty

Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland

? ? BMG多功能酶标仪可应用于定量IgG的新技术Valita?TITER

采用荧光偏振法直接在细胞培养上清液中检测IgG

酶标仪预设检测程序和数据分析模板提高研究速度

简介

准确、快速和高通量检测IgG对于大多数治疗性抗体的开发和生产来说是必不可少的。单克隆抗体正在生物药物领域大显身手，大量的样本正等待着进行筛选以进一步得到开发。这里我们介绍一种在细胞培养上清中直接定量IgG的全新的筛选技术：Valita?TITER。

现有的技术，包括蛋白A高效液相色谱（HPLC protein A）、ELISA技术、 蛋白A表面干涉法以及HTRF（均相时间分辨荧光）都具有明显的缺点，包括价格昂贵、耗力以及耗时。

Valita?TITER方法是一种全新的非常精确、低成本的检测IgG的方案，检测范围在2.5-80mg/L。Valita?TITER采用荧光偏振技术检测IgG的Fc段与蛋白G的结合（图1）。分析在96孔板中进行，操作简单、高通量、快速且可自动化完成。分析可以在很少量的细胞培养基中进行且没有繁琐的准备过程。

在这个应用指引中，我们介绍了在PHERAstar?，POLARstar? Omega以及CLARIOstar?多功能酶标仪上使用Valita?TITER试剂盒定量检测IgG的方案。

荧光偏振可以有效地分析分子大小的改变。“不动”的荧光基团在偏振光的激发下会发出与激发光相同偏振方向的荧光。然而，转动的荧光基团的荧光偏振方向与激发光偏振方向相比会有一定的改变。在溶液中小分子比大分子转动更快，因此，连接有荧光基团的分子大小的改变，可以通过荧光去偏振程度的大小来进行测定。所以，当标记有荧光的蛋白G在没有结合其它分子时，其转动快，去偏振更多，而结合了IgG则相反（大5倍）（图2）。这种偏振的改变应用于检测溶液中的IgG。荧光偏振（FP）通过用平行偏振方向的激发光照射溶液并在平行方向和垂直方向上测定发射荧光。FP就是这两个偏振荧光的归一化后的差别，通常用mP表示。

材料和方法

Valita?TITER分析试剂盒

Valita?TITER APP软件（试剂盒里提供）

IgG标准品（从人血清中获得IgG）

PHERAstar, POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶标仪 (BMG LABTECH)

实验过程

样品的准备遵照试剂盒说明书的相应要求。标准曲线的绘制采用每个相对荧光值对应一个IgG标准品的方法。在Valta?TITER微孔板的每个孔中加入60?l重建缓冲液以及60?l标准品或样品。混匀后避光孵育30分钟。然后在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶标仪（BMG LABTECH公司）中，采用预置的检测程序进行读数（参数的设定详见下表）。在MARS分析软件中将获得的Raw Data转化成.csv格式文件，再用Valita?APP软件进行分析。

仪器设定

结果与讨论

图3的标准曲线（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有荧光偏振检测功能的多功能酶标仪（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita?TITER试剂盒绘制的。所有酶标仪所获得的结果都具备很高的稳定性。

最后，我们用不同条件培养的样品，用Valita?TITER定量IgG的结果与用常规方法HPLC的结果进行对比。图4显示两种方法测定结果的相关性，显示两种定量方法都有很好的准确性，而Valita?TITER分析速度更快因其不需要繁琐的样本准备过程。

结论

在研发和生产此类生物药物中对混合样本进行快速IgG浓度测定非常重要。这里我们介绍了一种基于荧光偏振法的快速、简单的进行高通量IgG和Fc段衍生物测定全新技术——Valita?TITER分析法。Valita?TITER分析法可以直接对待测样本中的IgG进行定量测定而无需繁琐的样本准备或纯化过程。CLARIOstar， PHERAstar和POLARstar Omega应用于Valita?TITER分析时现实出卓越的性能。与其它IgG的定量方便相比，Valita?TITER具有高通量、简单、准确、快速的特点。

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