Caco-2细胞模型助力新药研发(单细胞新药研发导论|| 药靶发现)

现代药物研发成功与否，与药物的代谢特性密切相关。目前，人工合成和筛选有限数量的化合物已被大规模的化合物合成和高通量筛选所取代。无论是开发新药还是开发新的给药途径，化合物在体内的吸收特性都非常重要。以往传统的体内药代吸收筛选模型，由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端，已经无法满足现代新药的研发要求，因而开发新的快速、准确以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的必然趋势。目前，被广泛采用的三种筛选方法是：大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法以及体外人结肠腺癌（Caco-2）细胞系法。其中，Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。

结构与功能决定其应用价值

Caco-2细胞模型是最近十几年来国外广泛采用的一种研究药物小肠吸收的体外模型，具有相对简单、重复性较好、应用范围较广的特点。其来源于人的直肠癌，结构和功能类似于人小肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接。胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似，这些性质可以恒定维持约20天。由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。

另外，存在于正常小肠上皮中的各种转运系统、代谢酶等在Caco-2细胞中大都也有相同的表达，如细胞色素P450同工酶、谷氨酰胺转肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶、葡萄糖醛酸酶及糖、氨基酸、二肽、维生素B12等多种主动转运系统在Caco-2细胞中都有与小肠上皮细胞类似的表达。由于其含有各种胃肠道代谢酶，因此更接近药物在人体内吸收的实际环境。

研究药物小肠吸收的标准工具

利用人小肠上皮Caco-2细胞单层来进行药物小肠吸收的细胞水平实验，现在已经成为一种预测药物在人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准筛选工具。

评价新药的吸收。在研究新的抗生素药物时，如新药为水溶性很差的化合物，则药物性质决定其不能制作成注射剂。为了改善其口服吸收生物利用度，国外研究人员使用了一些吸收增强剂，用Caco-2细胞来评价其吸收程度取得较好的结果。

还有研究者使用Caco-2细胞模型评价了系列难溶性药物磷酸酯前药与其母药的吸收度，这些药物包括可的松、苯妥英等。结果发现，苯妥英等药物磷酯化后吸收大为增加，而可的松磷酯化后吸收程度有显著改变，这些结果在其他模型上也类似。在研究药物赋形剂对药物吸收的影响时，同时使用了Caco-2细胞模型和大鼠离体肠道进行评价，两模型的结果一致。这些都表明Caco-2细胞模型在新药吸收评价方面的重要价值。

预测吸收过程中的药物相互作用。Caco-2细胞中存在有与小肠上皮相同的各种转运系统、代谢酶，因此可以用来作为研究与吸收相关的药物相互作用的体外模型。

小肠上皮的代谢、受体介导的转运、p-gP对药物分子的泵出，是一个饱和过程。联合用药时，因为有可能存在药物竞争酶、载体或p-gP泵的作用，所以会与单独给药时的生物利用度存在差异。这种药物吸收过程中存在的相互作用可以应用Caco-2细胞模型进行研究。此外，与药物吸收有关的相互作用还可来源于代谢酶、载体、p-gP泵被特定药物重复给药引起的诱导。当药物经细胞转运途径被吸收时，p-gP泵成为药物吸收的一个重要生化屏障，它把进入细胞内的药物泵出，从而减少了药物的吸收，因此成为口服药物生物利用度低、波动大的一个重要影响因素。具有这种p-gP泵出性质的药物分子在与p-gP泵抑制剂共同口服给药时，其透过细胞膜吸收的程度增强。

研究吸收机制。Caco-2细胞除了在吸收评价方面的大量应用外，也比较适合用于吸收机制的研究。有研究人员分别利用Caco-2细胞作为钠和铁吸收的模型细胞，结果发现，LR(lipidraft)在决定PI3K/AKT2信号转导过程中起到重要作用，包括增加了肠道的Na吸收。

拓展药物小肠代谢研究

人体小肠中存在着丰富的细胞色素P450同工酶，其中P4503A4占到该组织中所有细胞色素P450同工酶的约50％，而其在Caco-2细胞单层中的表达已见报道。

与人体小肠甚至空肠微粒体相比，Caco-2细胞中的细胞色素P450同工酶为低水平表达，这是限制其作为口服给药化合物的小肠一相代谢研究模型的一个因素。为了克服这一局限，国外研究人员等利用1α，25-二羟基维生素D3处理过的Caco-2细胞单层作为研究小肠代谢动力学首过作用的体外模型。当将该系统应用于研究细胞色素P4503A4底物咪唑安定的代谢动力学时，显示出与体内研究相似的结果。

尽管细胞色素P450同工酶在Caco-2细胞中的表达水平较低，但其他许多药物代谢酶的表达水平不经诱导就可以用于药物小肠代谢的研究。比如，像羧酸酯酶、葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、磺基转移酶和儿茶酚-O-甲基转移酶等在Caco-2细胞中仍保持其功能特点。在这些酶中，二相磺基转移酶和葡萄糖醛酸转移酶对于口服给药化合物的生物利用度尤其重要，因为具有药理活性的化合物与它们发生结合反应后通常会导致活性降低或消失。例如，人们已经发现在Caco-2细胞中，类黄酮物质5，7-二羟黄酮产生硫酸盐和葡(萄)糖苷酸的变化，5，7-二羟黄酮硫酸盐的产生速度是其葡(萄)糖苷酸化的两倍。类似研究也表明，Caco-2细胞模型中酶的表达可以使其应用于药物的小肠代谢研究。

尽管Caco－2细胞模型尚存在不足，如细胞培养时间过长（21天）；该模型本身为纯细胞系，缺乏在小肠上皮细胞中的黏液层；缺少细胞培养标准以及试验操作标准，使结果有时缺乏可比性；由于Caco-2细胞来源于人结肠，因而该细胞的转运特性、酶的表达以及跨膜电阻相对更能反映结肠细胞而非小肠细胞等等。但是，不可否认的是，建立与应用Caco－2细胞模型可以被认为是药物吸收研究方面取得的重要成就，而且随着改进细胞模型的建立和培养装置、检测设备等新技术的应用，其在新药研发中必将发挥出重要作用。

单细胞新药研发导论|| 药靶发现

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单细胞新药研发导论|| 新药研发管线

人类开展药物筛选的方法与科学技术的发展密不可分，先后经历了活体评价（神农尝百草）、器官/组织筛选，再到现代的分子靶向、细胞表型等方法。在这个历程中，单细胞技术将怎样推进药靶的发现呢？

在讲单细胞技术加速药靶发现之前，我们先来理解一下什么叫药靶以及相关的几个问题：

药物与机体生物大分子的结合部位即药物靶点。药物作用靶点涉及受体、酶、离子通道、转运体、免疫系统、基因等。可见，药靶不是有机体中天然存在的，它是疾病固有的特征，举两个例子：

但是生物大分子依然使一类最大的经典靶点，那么仅看人体的生物大分子的话，人体到底有多少潜在靶点呢？在后基因组时代我们可以回答这个问题，人类共有20000--25000个蛋白质编码的基因，加上人体微生物基因组编码蛋白基因，这个总量是可以衡量的。研究表明大约有5000个潜在的 可成药 的大分子靶点适合用于小分子药物开发，另外有3200个靶点可适用与生物学治疗。

以上，我们简单明白了靶点的基本性质，那么我的单细胞分析流程可以从哪些方面来入手药靶发现呢？

首先，单细胞技术把我们认识靶点的精度拉到组织器官和生物大分子之间，这就是生命的基本单位：细胞。把细胞的类型和状态及其表达的基因、受体配体、通路、TCR/BCR、酶、离子通道、转运体的改变放入到新药研发的流程中我们不难发现，单细胞技术几乎重新为这个管线新着了一遍色。

单细胞水平的靶点更加接近真是世界。如EGFR调控的下游信号通路主要有RAS-RAF-MAPK通路和PI3K-AKT -mTOR通路，是细胞增殖和存活的重要信号通路，针对肿瘤细胞，EGFR是抗癌药物的重要靶点。那么肿瘤细胞还有哪些特有的通路呢？这时候我们可以做一个差异分析，于是，单细胞水平的生物标志物（biomarker）和靶点（target）是那样的接近：

随着单细胞多组学和空间技术的成熟，基于系统生物学和生物信息学的生物标志物及靶标发现系统日益成熟，人们得以快速确定与疾病发生、发展密切相关的关键因素，以发现新生物标志物和新靶标。

参考：
白东鲁，沈竞康，《创新药物研发经纬》，2019
Blass,白仁仁（译）《药物研发基本原理》，2019
Sarah Middleton,《Cell types to targets Single cell RNA sequencing for drug discovery》
阿波斯托利亚－玛蒂亚·钦巴瑞多，等 编 赵维莅，张俊 主译《癌症转化医学研究中的靶向治疗 》

Single-Cell Sequencing for Drug Discovery and Drug Development 2017
Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum 2011
Heath, J., Ribas, A. & Mischel, P. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov 15, 204–216 (2016).https://doi.org/10.1038/nrd.2015.16
DRUG-NEM: Optimizing drug combinations using single-cell perturbation response to account for intratumoral heterogeneity

https://otd.harvard.edu/explore-innovation/technologies/single-cell-high-throughput-drug-screening

caco-2细胞限制药物吸收的因素有

caco-2细胞限制药物吸收的因素有细胞膜、细胞间各种连接处、不流动水层。细胞膜能够选择性的让物质通过，让某些小分子物质透过，而一些有害的物质或大分子物质则限制通过，保持细胞内物质的稳定。细胞间各种连接处能够封闭相邻细胞间的接缝，防止溶液中的分子沿细胞间隙渗入体内，从而保证了机体内环境的相对稳定。不流动水层能够限制某些脂溶性药物的吸收。

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