环孢菌素A生产新工艺关键技术及其应用

由上海医药工业研究院等单位完成

环孢菌素A是器官移植抗排斥反应的首选药物，我国长期依靠进口。该项目研制出环孢菌素A生产新工艺关键技术：（1）采用原生质体融合和代谢调控定向菌种选育技术，选用不同性状的亲本菌株，定向诱变获得了一株高产突变菌株。（2）针对菌体提前自溶和发酵过程产生大量泡沫的问题，研制新的发酵培养基及发酵中间补料工艺与补料配方，各项发酵技术指标取得重大突破。（3）改进了原有的分离纯化工艺，总收率从20%提高到50%，含量及杂质指标优于进口产品，临床疗效肯定。

环孢菌素A新工艺实施后，使国产环孢菌素A国内市场占有率据第一，达35%，三年累计新增销售1.95亿、利润3587万元、税收2640万元，企业直接出口创汇折合192万美元。申请国内外发明专利8项，已授权两项。打破了国外产品对中国市场的垄断。

副蛋白相关肾病肾小球疾病总论

近年来，副蛋白相关肾小球疾病的基础和临床研究取得了更多进展，其分类和治疗也有了更多新发现。CJASN杂志最近发表了一系列关于副蛋白相关肾病的综述文章。在这篇文章中，我们将与您分享副蛋白相关肾小球疾病的回顾。


副蛋白是单克隆免疫球蛋白，由异常增殖的B淋巴细胞或浆细胞产生。副蛋白血症是指血液中副蛋白的异常增加。副蛋白血症相关肾脏疾病常见于免疫增殖性疾病，如多发性骨髓瘤(MM)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)，也可见于非增殖性单克隆球蛋白病(MG)。


根据副蛋白在肾脏中沉积部位的不同，副蛋白相关肾小球疾病可分为无序沉积(颗粒状)和有序沉积(纤维状触手样和微管样)。


副蛋白沉积相关疾病


1.单克隆免疫球蛋白沉积病(MIDD)


MIDD是指非淀粉样单克隆轻链和/或重链在肾小球基底膜中的沉积。包括轻链沉积病(LCDD)、重链沉积病(HCDD)和轻链重链沉积病(LHCDD)。LCDD是最常见的。19%患有肾副蛋白沉积症的多发性骨髓瘤患者是LCDD。并且主要是轻链的亚基。MIDD患者通常表现出蛋白尿、肾损害和高血压。HCDD患者常见大量蛋白尿。MIDD的典型肾脏病理是结节性硬化性肾小球病(图1)。


系膜区结节性非细胞物质增生(A)。PAS:系膜区被PAS(B)强烈染色。免疫荧光：肾小球、肾小管和血管基底膜呈弥漫线性染色阳性(链)(C)。电子显微镜：肾小球基底膜内侧沉积的颗粒状电子致密物质(D)


MIDD的治疗主要集中在血细胞异常增殖的治疗上。硼替佐米是目前主要的治疗药物。可用于肾功能不全患者(包括透析患者)。


对MIDD的预测有所不同。在应用蛋白酶体抑制剂之前，患者进展为终末期肾病(ESRD)的中位时间为2.7年，中位存活时间为4.1年。硼替佐米的应用能明显改善患者的预后。MIDD管型肾病患者预后较差。


2.增殖性肾小球病伴单克隆免疫球蛋白沉积(PGNMID)


2004年，PGNMID首次被描述为具有单克隆免疫球蛋白肾小球沉积的免疫复合物肾小球病。其病因和病理生理学仍不清楚。IgG3是沉积在肾小球中最常见的免疫球蛋白亚单位。


PGNMID与血液系统的异常增殖性疾病有关，如多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、细小病毒B19感染和自身免疫性溶血性贫血。


目前报道的PGNMID患者以白人女性为主，临床表现为肾病综合征、肾功能不全、低复合血症。PGNMID肾的病理表现为膜性增生性肾小球肾炎或毛细血管增生性肾小球肾炎。


广泛肾小球增生伴壁新月体。均匀的嗜酸性物质沉积在肾小球膜上，基底膜增厚(A)。PAS染色：GBM局部可见双轨征(B)。免疫荧光：单克隆免疫球蛋白颗粒沉积(C)。电子显微镜：内皮细胞下的电子致密沉积物(D)


目前缺乏PGNMID疗法的大规模研究成果。常用的治疗方法包括RASi和免疫调节剂(环孢素、类固醇、MMF、硼替佐米等。).PGNMID预后差。


3.C3肾小球肾炎与单克隆免疫球蛋白


C3肾小球肾炎是一种由替代补体系统(AP)异常引起的肾小球疾病。肾小球以C3沉积为主，但无明显Ig沉积。包括C3肾小球肾炎(C3GN)和致密物质沉积病(DDD)。


最近的研究表明，单克隆链可以激活AP，导致C3肾小球肾炎。此外，石蜡包埋的组织切片经链霉蛋白酶消化后，在冰冻切片上可发现假阳性Ig染色。在一些C3肾小球肾炎患者的肾组织切片中可检测到单克隆免疫球蛋白。


最近的三组病例报道了它们的临床特征：50~60岁的患者比无MG的C3肾小球肾炎患者年龄大。常见的有高血压、肾病、蛋白尿、CKD。血清C3水平低，C4水平正常，补体调节蛋白(CFH、CFI和MCP)无基因突变。


肾脏病理：光镜可显示膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、系膜增生性肾小球肾炎、毛细血管增生性肾小球肾炎和新月体肾小球肾炎。如果显示粒状C3分散分布。MPGN和IF阴性的患者需要考虑是否检查石蜡切片，并且在1/3的患者中可以发现单克隆Ig。电镜显示电子致密物主要沉积在系膜区和皮下区。


目前尚无最佳治疗方案，泼尼松或其他免疫抑制剂可能对降低尿蛋白、稳定肾功能有效。


与准有序蛋白质沉积相关的疾病


1.淀粉样变性


淀粉样变相关肾损伤包括轻链(AL)、重链(AH)和重链轻链(AHL)型淀粉样变肾损伤。AL型最常见，占94.3%。70%的AL淀粉样变患者肾脏受累。al型的临床特点是肾功能不全的比例约为47%。68%的患者表现为肾病综合征；24小时尿蛋白中位数为6.2g；与AL型相比，AH或AHL型患者心脏受累较少，血尿发生率较高，对肾脏治疗反应较好，预后较好。


a1型淀粉样变性的诊断需要对相关组织进行病理学检查。血尿免疫固定电泳和骨髓活检可用于诊断骨髓瘤和淋巴增生性疾病。24小时尿蛋白定量、心肌损伤标志物检查、心电图、心脏超声、碱性磷酸酶、血栓指数检查可对患者受累组织器官进行评估。


淀粉样蛋白可以沉积在肾脏的任何部位。大多数肾小球受累的患者表现出大量蛋白尿。光镜下，典型的表现是淀粉样物质用刚果红染色时呈现苹果绿的双折射。IF显示单Ig轻链肾沉积。


治疗的目的是尽量减少单克隆副蛋白的产生及其组织毒性。肾脏受累的患者还应注意液体平衡和降低尿蛋白的治疗。


低危患者可给予化疗加自体干细胞移植，高危患者可给予化疗及支持治疗。由于心血管系统受累，患者可能出现低血压和对利尿剂治疗不耐受。ACEi类药物控制尿蛋白的效果尚不确定，且可引起患者低血压，应特别注意其应用。大多数进展为ESRD的患者由于低血压而不能耐受透析治疗。缓解期患者可以考虑心脏和肾脏移植。


大多数没有得到有效治疗的患者在确诊后2年内死亡。因此，及时诊断和正确治疗至关重要。有效的治疗可以使大多数患者存活5年以上。


2.纤维性肾小球肾炎(FGN)


FGN是一种罕见的疾病，其特征是肾小球内1624nm的纤维无序沉积，刚果红染色阴性。虽然大多数FGN是原发性疾病，但据报道它也可以继发于副蛋白疾病。


大多数患者年龄在50至60岁之间，其主要临床特征为蛋白尿(100%)、肾病综合征(38%至52%)、肾功能不全(66%至72%)、血尿(52%至73%)和高血压(71%至72%)。约17%的患者血液和尿液中含有单克隆蛋白。


肾脏病理：系膜增生性肾小球肾炎和膜性增生性肾小球肾炎(图4)。7%~31%的病例有月牙形形成。免疫荧光显示IgG主导的肾小球沉积。


图4显示系膜增生性肾小球肾炎和膜性增生性肾小球肾炎。


对患有副蛋白沉积症的FGN患者的治疗集中于抑制副蛋白的产生。免疫抑制疗法包括类固醇、环孢霉素、MMF、马尔法烷和利妥昔单抗。


3.免疫性触须样肾小球肾炎(ITG)


ITG是一种由1090nm的有序微管样单克隆抗体在肾小球内沉积引起的肾脏疾病。主要临床表现为蛋白尿(100%)、肾病综合征(69%)、肾功能不全(50%)和镜下血尿(80%)。大多数患者伴有MG、淋巴增生性疾病和低补体血症。肾脏病理表现为MPGN，新月形少见。但是如果IgG和C3呈阳性。类固醇单独或与环孢菌素、苯丁酸氮芥和马法兰联合使用可有效诱导完全或部分缓解。


4.冷球蛋白肾病伴镁


冷球蛋白是一种免疫球蛋白，当温度低于37度时会沉淀。冷球蛋白引起的器官损害主要是由于血液粘度高和免疫复合物的沉积。大约24%的冷球蛋白血症患者会有肾脏受累。最常见的原因是HCV感染。


肾脏病理表现为MPGN和肾小球毛细血管内透明血栓。免疫荧光显示透明血栓和内皮细胞下有多种免疫球蛋白染色。电镜显示肾小球内有直径2030nm的微管沉积。


图5显示电镜下肾小球内直径为20~30nm的微管沉积。


非感染引起的冷球蛋白血症的治疗主要使用类固醇、烷化剂和利妥昔单抗。淋巴增生性疾病患者应重点治疗淋巴增生性疾病。


5.单克隆晶体肾小球病


单克隆晶体蛋白主要引起近端小管的肾小管性肾病。然而，它也可以沉积在肾小球中，导致肾小球病。其沉积主要在肾小球足细胞或内皮细胞下。


6.血栓性微血管病伴副蛋白血症


少数病例报道TMA患者患有多发性骨髓瘤(MM)。患者表现出肾脏受累、血小板减少性紫癜、微血管溶血性贫血、神经系统症状、血象中细胞破碎以及血液LDH升高。


7.膜性肾小球病伴不可见IgG沉积


目前仅有少数病例报道，患者肾脏病理电镜显示上皮细胞下沉积有电子致密物。常规IF仅显示C3主导沉积；石蜡包埋的切片用链霉蛋白酶消化，并沉积IgG链。


副蛋白血症肾损害主要是由肾中异常副蛋白沉积引起的。其诊断主要依靠肾脏病理检查。近年来，由于检查方法的进步，我们对它的认识逐渐加深，这使得我们在临床工作中的诊断和治疗更有针对性。

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