重视β-内酰胺类抗生素高分子杂质研究

近年来研究发现，同一品种不同厂家的产品、同一品种不同批号的产品，有的易发生过敏反应，有的则不易发生过敏反应。也就是说，药物的质量直接影响着过敏反应的发生率。研究表明，过敏反应的发生率与药品中高分子杂质的含量密切：相关高分子杂质的含量越低，过敏反应的发生率也就越低；高分子杂质的含量越高，过敏反应的发生率也就越高。

高分子杂质是主要过敏原

目前，我国科研人员经过深入的研究，已从头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶等四种第三代头孢菌素中分离收集到了能引发动物过敏反应的基本无抗菌活性的聚合物。利用动物口服主动过敏反应模型，确证引发青霉素V钾、阿莫西林等口服青霉素过敏反应的主要过敏原是它们的高分子杂质，而头孢菌素和青霉素本身并不引发过敏反应，肠道吸收不会影响其过敏特性。因此，在研制生产β-内酰胺类抗生素过程中，必须对其中的高分子杂质进行研究，以指导优化制备工艺、确定适宜的贮藏条件和使用方法，并严格控制其含量，以减少临床过敏反应的发生。随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，对内源性聚合物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。

凝胶色谱法具明显优势

高分子杂质的分离分析方法主要有：反相色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法（分子排阻色谱法）。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（过敏性），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。因此，根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法则具有明显的优势。

凝胶色谱法（分子排阻色谱法）是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。药物分子进入凝胶孔径内部，而高分子杂质则被排阻在外，在色谱过程中不被保留，最早被洗脱出来，保留时间较短，而药物被保留，保留时间较长。

根据β-内酰胺类抗生素和其高分子杂质的分子量，研究人员比较了数种凝胶介质，最后选用SephadexG-10作为β-内酰胺类抗生素高分子杂质分离色谱系统的凝胶介质，发现SephadexG-10排阻分子量在1000道尔顿左右。

凝胶色谱方法验证的内容主要有：系统适用性试验（理论板数、拖尾因子、精密度和分离度等）、对照溶液的线性、对照溶液的精密度（RSD）、最低检测限与定量限、F值的重现性、聚合物测定结果的重现性等。

β-内酰胺类抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，故无法制备对照品，不能采用对照品法定量。中国药品生物制品检定所金少鸿等研究者，根据β-内酰胺类抗生素在不同离子强度的介质中具有不同表现状态的性质，首次建立了凝胶色谱自身对照外标法定量测定β-内酰胺类抗生素中的聚合物。此方法已经载入《中国药典》2000年版和2005年版，用于国产β-内酰胺类抗生素的质量控制，并已被国内外β-内酰胺类抗生素生产厂家广泛使用。

质控研究中存在问题

目前，β-内酰胺类抗生素高分子杂质质量控制研究中存在着一些问题，应引起注意：因某些β-内酰胺类抗生素在特定条件下不能完全缔合，无法采用“自身”对照外标法定量，故不再继续进行研究；系统适用性试验不符合要求，例如，对照溶液与蓝色葡聚糖2000峰的保留时间不一致，对照溶液峰不能重叠或峰面积的相对标准偏差大于5.0%，分离度不符合要求等；对照品制备方法错误，如采用在溶液状态下加热或紫外光照射的方法制备β-内酰胺类抗生素聚合物对照品；质量标准中聚合物的限度较宽，无科研依据。

四方面值得关注

目前，β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的控制研究有四方面的问题须引起药品研制、生产人员的关注。

*高分子杂质影响因素

首先要从产品的制备工艺和分子结构特点分析可能产生的高分子杂质，并研究温度、光照、水分及溶液pH值等对高分子杂质含量的影响，以明确高分子杂质产生的影响因素，用于指导优化制备工艺、选择适宜的贮藏条件、制定有效的质量控制指标和限度，以及确定合适的临床使用方法。

*检查方法

高分子杂质的检查方法通常应参照中国药典的方法，重点考察系统适用性，并要进行方法验证，这一点对新药尤为重要。

*对照品的制备

如果某些β-内酰胺类抗生素在特定条件下不能完全缔合，无法采用“自身”对照外标法定量时，可以用结构与研制产品类似，且能够完全缔合的其他药物制备对照品，进行自身对照外标法定量，但在计算结果时应考虑二者分子量的差异。例如，硫酸头孢噻利在特定条件下不能完全缔合，可以选择结构与头孢噻利类似的头孢曲松制备对照品进行定量；硫酸头孢匹罗可以采用头孢他啶制备对照品进行定量。

*质量标准

《中国药典》2005年版中供注射用头孢类抗生素原料药和注射剂大都纳入了聚合物检查项，青霉素类抗生素口服原料药和制剂也定入了聚合物检查项。因β-内酰胺类抗生素高分子杂质的含量与生产工艺直接相关，同一产品采用不同的生产工艺，其聚合物的含量也不同，且高分子杂质的含量直接影响过敏反应的发生率，故在质量标准中控制高分子杂质的含量是控制产品质量、降低过敏反应发生率，保障临床用药安全的有效措施。通常注册申请人应考虑将高分子杂质检查纳入质量标准，并制定合理的限度；或作为企业内控质量标准的检查项目，高分子杂质的限度与其他杂质一样，同样要有安全性研究结果的支持。

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高分子杂质系指药物中分子量大于药物本身的杂质的总称。分子量一般在1000~5000道尔顿，个别可至10000道尔顿。

β-内酰胺类抗生素高分子杂质有外源性和内源性两种。外源性一般源于发酵工艺，为蛋白、多肽、多糖等杂质与抗生素结合的杂质。内源性系指抗生素药物自身聚合的产物。聚合物既可来自生产过程，又可在贮藏过程中形成，甚至在用药时也可以产生。如阿莫西林颗粒在采用开水冲服时，其高分子杂质可增加100倍。

β-内酰胺类抗生素主要包括青霉素和头孢菌素两大类，除青霉素G和V外，临床中常用的β-内酰胺类抗生素均为半合抗生素，故除青霉素G和V中还含有少量青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽外，其他产品中的高分子杂质主要是聚合物。

阿莫西林的研究进展？

【摘要】药物阿莫西林的原有剂型有片剂、胶囊剂等，目前又出现了一些新的剂型、制剂，为了适应新剂型、制剂的要求和进一步完善阿莫西林原有的质控标准，笔者对测定阿莫西林制剂含量的方法进行了研究，并在本文中作了阐述。 【关键词】阿莫西林制剂含量测定方法研究进展 作为光谱抗生素药物的一种，临床上阿莫西林被广泛应用，其又名为羟氨苄青霉素，属β-内酰胺青霉素类抗生素。作为阿莫西林研究的一个重要方面，阿莫西林制剂的含量的测定方法一直备受关注。笔者对测定阿莫西林制剂含量的方法进行了研究，并在本文中作了阐述，以供参考。 测定阿莫西林制剂含量的方法主要有微生物效价测定法、碘量法、电位滴定法、旋光法、分光光度法以及流动注射化学发光法等，下面对以上这几种方法一一说明。 一微生物效价测定法 作为抗生素测定经典方法之一，微生物效价测定法同样适用于阿莫西林制剂含量的测定，通过该种方法测定出的资料能够直接反应阿莫西林对病菌微生物的抑杀能力，但该种方法的不足之处是实验操作繁琐、工作量较大。具体方法是以藤黄八叠球菌***28001***为试验菌种，试验培养基为药典Ⅰ号培养基进行实验，最低检测浓度为0.05mg/L，日内和日间变异系数小于15%，线性范围为0.05～400mg/L***r=0.997 7，P<0.01***，符合生物样品分析要求。 二碘量法 碘量法是利用阿莫西林分子不消耗碘，而其降解产物消耗碘的特性来测定阿莫西林含量的方法，也是一种测定青霉素类抗生素较为通用的方法。具体方法是先将阿莫西林制剂水解成阿莫西林噻唑酸，然后用足够的、定量的碘与其发生反应，之后再用准硫代硫酸钠滴定剩余的碘，从而测出消耗碘的阿莫西林的量，最终测出制剂中阿莫西林的含量。 三电位滴定法 电位滴定法是利用阿莫西林的降解产物能够与汞盐***Hg2+***发生反应，形成巯基化物汞盐这一特性而得以测定制剂中阿莫西林含量的，青霉素类化合物的降价降解产物普遍存在这一特性。该种方法先将阿莫西林制剂水解，然后以铂电极为指示电极、Hg-Hg2SO4为参比电极，然后用硝酸汞滴定液***0.02 mol/L***滴定，最终测得制剂中阿莫西林的含量。 四旋光法 旋光法测定制剂中阿莫西林含量操作简单、耗时段，该种方法主要是利用了阿莫西林具有旋光性这一特点，需要注意的是在绘制工作曲线过程中要将检测温度严格控制在***20℃±0.5***℃，阿莫西林浓度在0.5～1.5mg/ml范围内呈良好线性关系，平均回收率为99.56%，RSD为1.2%。 五分光光度法 分光光度法主要有比色法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、荧光分光光度法等方法。 1、比色法测定阿莫西林制剂中阿莫西林含量的比色法是基于其能够与有机溶剂发生反应形成有色物质而进行的，该种实验方法要求反应温度、反应时间以及反应***pH***介质必须固定，因该种方法影响因素较多且操作步骤复杂，一般较少采用。 2、红外分光光度法 红外分光光度法技术主要适用于测定阿莫西林胶囊中阿莫西林含量，它是利用漫反射红外光谱分析技术对待测样品进行非破坏性、非污染性含量测定。该种方法具有操作简单且检测速度快的优点，不足之处是误差相对较大。具体测定方法是以KBr作为稀释剂，准确称量并配制标准样品系列，然后用18.4倍的KBr对样品进行稀释，混匀，研细，用固定的样品槽均匀装样，压片，测定各种浓度的标准品及样品的红外光谱。选择辅料淀粉无干扰的1672.18cm-1为分析峰，840.62cm-1为参考峰，之后应用软体进行定量分析处理，平均回收率为99.6%。 3、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法利用高锰酸钾在碱性介质中能够与阿莫西林含硫化合物的发生反应这一特性，在这个反应中高锰酸钾被还原为锰酸根，并与氯化钡中的钡离子结合成蓝色锰酸钡沉淀，之后再经流动注射线上过滤稀释，以AAS法测定滤液中反应剩余锰的量，从而间接得出被测制剂中阿莫西林的含量。该种方法经化学引数及流动注射引数优化，同药典法比起来，资料更为准确。 4、荧光分光光度法 之所以可以用荧光分光光度法测定制剂中阿莫西林的含量，是因为其具有较好的荧光性质，尤其是在激发波长***λex***277nm与发射波长***λem***303nm处，阿莫西林的荧光值最大。阿莫西林分子中既含有酸性基团又含有碱性基团，这就使得荧光光谱对于溶液的酸度相当敏感。有关实验结果表明，阿莫西林在微碱性溶液中的荧光发射最强，随着温度的升高，其荧光轻度会下降，且与Ca2+、Mg2+等无机离子有配合作用。如果在溶液中加入丙酮，阿莫西林的荧光强度会降低，甚至猝灭；如果向溶液中加入乙醇或甲醇溶液，其荧光强度会增加。除此之外，CTAB（表面活性剂）对其还有增效的作用。因为该种方法的选择性和灵敏度都相对较高，因此被广泛用于药物的前期分析。 六流动注射化学发光法 流动注射化学发光法的具体操作是先将阿莫西林样品注入水的载体流，再将其与盐酸中的二价钯试剂流混合，当温度达到40℃时，阿莫西林会与二价钯形成黄色的混合物，这种黄色混合物在波长400nm处时吸收最大，其吸收度会随着浓度的增大而增强。在硫酸溶液中，阿莫西林会生成含巯基的降解产物，在罗丹明6G的增敏作用下，含巯基的化合物（阿莫西林的降解产物）能够和Ce***Ⅳ***发生发生反应，出现较强的化学发光。该中测定阿莫西林含量方法的优点是灵敏度较高，且线性范围宽，能够有效排除样品剂型对测定结果的干扰。 七结语 从上文中我们可以看出，测定制剂阿莫西林含量的方法有很多，除了以上这六种外，还有高效液相色谱法等其它方法。我们从这些方法中不难看出，分析技术趋向微量、灵敏、简便、专属、快速和自动化是今后测定制剂阿莫西林含量方法的发展方向。阿莫西林含量的测定能够有效指导医护人员对于该药的用量及用法，是阿莫西林研究的一个重要方面。希望以上方法能为医护人员提供参考。 参 考 文 献 [1]罗兴洪，周进东，赵耀军.高效液相色谱法测定阿莫西林颗粒中高分子杂质[J].中国药业，2004，13***5***:32-3. [2]刘媛，丁岚，谢孟峡.动物组织中阿莫西林残留的液相色谱分析方法研究[J].色谱，2007，21***6***:541-544. [3]沈铮，张亮，冯艳.HPLC-MS同时测定人血浆中阿莫西林和克拉维酸的浓度[J].中国药科大学学报，2008，33***1***: 24-27.

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