禽流感疫病原快速检测技术的研究进展

点评专家：张鹤晓（北京出入境检验检疫局动物检验检疫中心主任）

“现在国内有些人谈禽流感而色变，甚至不再吃与禽类相关的食物。对于禽流感我们要重视但不用恐惧它。”张鹤晓在接受记者采访时，侃侃而谈，“因为早在2001年我们就开始禽流感技术的研究并获得成功。不但把检测时间从原来的3周缩短到4小时，而且实现了养殖场环境的安全控制。”

据介绍，过去由于禽肉中禽流感病毒的快速检测技术没解决，对禽流感检测最常用的方法是世界动物卫生组织推荐的鸡胚病毒分离法。由于检测约需3周时间，加上样品需要一定的前期处理过程，无法保证进出口禽肉在短时间内通过检疫后通关。鸡胚病毒分离法不但不适应我国进出口活禽及产品的快速检验、快速通关放行需要，也不适应国内消费者对禽肉安全性需求以及禽流感防控工作中对疫情的早发现和早确诊。

“建立快速、敏感、特异的禽流感诊断技术并应用到实际防治工作中去，才能真正解决‘一线’急需。”张鹤晓郑重地告诉记者。

把疫情扼杀在摇篮中

2003年底，韩国、日本、越南、泰国等相继爆发禽流感，并波及到10多个国家和地区。我国自2004—2005年初报告发生禽流感疫情以来，内地确诊禽流感的地区涉及16个省份。禽流感给我国的养禽业造成重大损失，不仅危害养鸡业，而且重创了部分地区的养鸭场和养鹅场。

高致病性禽流感的发生往往是突如其来的，发生后迅速蔓延，因此一旦发生后的防控工作非常艰巨，因此，必须对疫情早发现、早确诊，并“把它扼杀在摇篮中”，禽流感病毒的快速检测技术，包括病毒的快速检出和快速定型被列入“十五”科技攻关课题，并迅速获得成功，投入了实际应用。

课题组根据全球禽流感病毒流行特点和规律，先后建立了荧光RT-PCR快速检测禽流感通用型、H5亚型、H7亚型、H9亚型方法，成功研制出4种禽流感病毒检测试剂盒。在检测灵敏度与鸡胚病毒分离基本一致的情况下，将原来所需的21天检测时间缩短为4小时，禽流感疫情的早发现、早确诊，进出口活禽及禽类产品的快速检测，快速通关终于成为了现实。在2005年的中美禽流感高层论坛上，美方专家为我国有此先进检测技术感到惊讶，因为美国也刚刚将此技术作为美国禽流感病毒快速检测的首选方法。

课题组自主研发的试剂盒通过了国内权威部门所做的临床试验和符合试验，于2005年2月取得了国家“一类新兽药”证书，这表明该试剂盒在当时为国内外首创，这也是我国检验检疫系统唯一的“一类新兽药”；课题组还制定了《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》、《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》等四项国家标准，并于2004年2月15日由国家质检总局和标准化管理委员会公开发布。

敏感、特异又安全

禽流感检测技术不但要快速，还要非常敏感，只有灵敏地检测出污染了禽流感病毒的环境已经被非常彻底地消毒了，才能避免再次进入其中的禽类一旦感染再次爆发疫病的可能。课题组研发的检测技术实现了敏感、特异和安全性。

在动物的脏器中，病毒含量较多，肌肉中病毒含量相对较少，课题组研发的检测技术，由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100—1000倍，即使是把发病的鸡肉稀释1万倍，也能检测出所含的微量禽流感病毒；快速检测技术采用了特异性的引物和探针，其特异性高于传统PCR方法，使它只限于检测禽流感病毒，不能检测其他病毒，避免了病毒交叉反应而造成的检测误差；快速检测技术还很安全，由于检测是在杀死病毒后进行的，并且不对病毒进行增值，病毒不会扩散，在常规实验室里都可以进行，而鸡胚病毒分离法必须在生物安全3级实验室里才能进行，应用快速检测技术的实验室范围大大扩大，成本也大量减少。

课题组还首次建立了2种敏感、特异的多重荧光RT-PCR检测法。多重荧光RT-PCR同单管反应相比，不仅提高效率，而且节约了成本。经大量研究验证建立了禽流感病毒H5/N1多重荧光RT-PCR检测方法，实现了一次反应中确定病毒是否为H5N1亚型；此外，通过将H5亚型和H7亚型检测引物和探针进行正交试验，经优化后，建立了禽流感病毒H5/H7亚型多重荧光RT-PCR检测方法，实现了一次反应中确定病毒是否为H5或H7亚型。2004年2月，禽流感快速检测技术被科技部列为向全国首批推荐为22项禽流感防治技术之一。已经推广应用试剂盒30万余头份，创造了较好的经济效益。在应用本试剂盒对出口禽类进行检测3年多以来，我国出口的禽产品从未被进口国检出禽流感病毒，不但为养殖企业和广大养殖户创造了良好的经济效益，还支持了6亿多美元的出口创汇。

至今，该试剂盒已在全国20多个出入境检验检疫局、20多家检疫机构和24个出口大型养殖企业及7个省、地级兽医站得到应用，有些人医疾病预防控制中心也采用了该技术来预防和检测人感染禽流感。

解决的关键技术

课题组解决了禽肉中微量禽流感病毒的快速检验检疫技术难题。该技术比常规RT-PCR和胶体金技术灵敏度高100-1000倍，其诞生有力地促进了禽肉进出口贸易，大大降低了进出口禽肉携带禽流感病毒的风险。

解决了由于禽流感病毒亚型多，亚型检测技术分别对样品检测较复杂的问题。建立了首先用禽流感病毒通用快速检测技术进行检测，然后对阳性样品进行分型的禽流感病毒检验检疫模式；解决了养禽场禽流感快速诊断技术问题，为养禽场禽流感的快速诊断进而采取相应防治措施，减少经济损失提供了好方法。目前为止，仅课题组就已为100多个养禽场做出准确、快速诊断。

为国家质检总局对日本交涉提供了依据。针对某公司出口鸭肉被日本检出禽流感病毒问题，国家质检总局派调查组应用荧光RT-PCR检测禽流感病毒技术，从采集的138份样品中检测出一份样品禽流感病毒H5亚型阳性，后用鸡胚分离出禽流感病毒，为质检总局决策提供了依据。虽然如今禽流感感染的速度在加快，宿主的范围也在扩大，但总体来说病毒感染人的数量很少，只有极少数接触禽流感病毒的人才会得病。但我们一定要重视禽流感问题，人们尽量不要接触活禽，特别是有病的禽类，比如北京去年就已经取消了活禽市场。为了避免人流感病毒和禽流感病毒的交叉混合感染，导致新的亚型产生，患了流感的病人尤其要注意不要接触活禽和野生鸟类。

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