生物芯片技术在临床诊断中的应用

生物芯片技术在临床诊断中的应用

生物芯片技术是近年来生命科学与微电子学相互交叉渗透发展起来的一门新技术。随着人类基因组计划（HGP）研究的不断突破，这门技术已广泛应用于基因诊断、功能基因研究、基因组文库图型分析、新药的研究与开发、法医学等诸多领域。生物芯片技术主要通过平面微细加工技术构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸及其它生物组分的准确、快速、大信息量检测，具有高度平行性、多样性、微型化和自动化的特点。常用的芯片有基因芯片和蛋白质芯片两大类，多数为前者（DNA芯片）的寡核苷酸微阵列。它以分析核酸中的碱基序列特征为基础，通过对受检者的某一特定基因和其转录产物进行分析测定而对某种疾病进行诊断，使医学诊断方法从当今的生化、免疫、病原学诊断跃升到一个新的台阶。它特异性强、灵敏度高，可对疾病进行早期诊断，更利于疾病防治。现将近年的应用情况介绍如下。

用于遗传性疾病的监测

随着HGP的逐步完成，许多遗传性疾病的相关基因被相继定位，为从基因水平上认识本类疾病并为早期诊断奠定了基础。如血友病、苯丙酮尿症、地中海贫血、老年痴呆症、亨廷顿舞蹈症、某些精神病等的致病基因已定位，因此可将对应于突变热点区的寡核苷酸探针合成或点加于DNA芯片上，通过一次杂交完成对待测样品多种突变可能性的筛查，实现对多种遗传病的高效快速诊断。国外现已成功地将这一技术用于β－珠蛋白基因的突变检测以诊断地中海贫血，其高准确性及高自动化特性有望成为诊断这一疾病的常规技术。

用于肿瘤诊断

基于癌基因的激活和抑癌基因的失活参与多种肿瘤的发生与发展，因此对此类基因的突变进行检测已成为肿瘤诊断的重要手段。目前，生物芯片当之无愧已成为最方便的检测工具。对遗传性乳腺癌和卵巢癌的相关基因的外显子检测已可证实93％以上的病人存在基因的点突变、插入与缺失突变等，且可快速准确扫描大量基因，适于大量患者的标本检测，对临床基因诊断至关重要。国外运用寡核苷酸微阵列技术检测卵巢癌者的TP53突变，准确率达94％，敏感度达92％，特异性达100％，明显优于传统的DNA测序分析。有人以cDNA消减文库结合交通量微阵列检测前列腺癌和前列腺组织特异基因发现，P504S是一种前列腺癌的特异基因，检测其含量消长可指导临床诊断与治疗。目前人们已经发现，人类所患癌症50％以上为P53基因突变所致，研究人员将此基因全长序列和已知突变的探针制成了P53基因芯片，并制备出能同时检测250种肿瘤相关基因的芯片，将在癌症的早期诊断中发挥重要作用。

用于病毒性疾病的诊断

将各种病毒的特异性序列制成探针，有序地点阵到芯片上再与处理后的样本进行杂交，一次就可检测出多种病毒并能鉴定出亚型。对HIV－1β亚型中的逆转录酶和蛋白酶基因的多态性分析揭示，这一亚型的病毒基因序列存在极大差异，其中蛋白酶的基因片段差异最大，在编码的99个氨基酸序列中，竟有47.5％存在明显突变，直接导致了病毒抗药性的不同。国外现已有用于HIV－1的测序分型及多态性分析的试剂盒问世。国内也已研制出了检测丙肝病毒（HCV）的基因芯片，敏感性高、分辨率好，准确性接近100％。用芯片对人巨细胞病毒（HCIV）感染后引起的细胞基因表达改变情况的分析已发现，感染前后有258种mRNA水平改变大于4倍，其中一些mRNA编码的基因产物在病毒致病性中起关键作用。

在其它疾病诊断中的应用

这一技术已成功用于幽门螺旋杆菌（HP）的基因诊断、基因结构分析和基因分型，已成为HP研究及临床研究的有力武器。国外将等温的基因扩增与微阵列分析结合，用于细菌病原体间的鉴别。细菌的rRNA在长期的进化过程中变化不大，在碱基组成、碱基序列、高级结构及功能等不同层次均有保守性，因此此类生物芯片可快速准确地鉴定细菌，用于检测特异性病原微生物、毒性标记物及抗药微生物的抗药性基因，比培养及传统检测方法更快、更敏感、更特异。芯片技术还用于分枝杆菌对利福平等药物的耐药性研究、检测类风湿性关节炎、肠炎等疾病的相关基因等等，为许多疾病的诊断和治疗提供了新的思路。

生物芯片尽管有诸多其它检测方法难以比拟的优越性，但因问世与使用时间较短，目前仍有一定的局限性影响到其应用。这些局限性表现在：技术成本高，对实验条件要求严，不利于普及推广；探针制备、合成过程要求严格，若掺入错误核苷酸或混入杂质，使杂交背景增高，其特异性将大大降低；对杂交条件的选择要求很高，一个芯片上多种探针的最适条件颇不一致，增大了芯片的制作难度及测定误差等等。但是这一技术具有巨大理论价值和实用性能，其发展前景十分广阔。人们预计，在未来的几年内上述不足将能很快得以解决，芯片上探针位点的空间分辨率将达到1微米水平，人类所有的约3万个基因有望集成在一块1平方厘米的芯片之上。

DMSO在药物合成中的应用

鬼臼亚乙苷（etoposide）是p53活化拓扑异构酶 Ⅱ的抑制剂，在临床上作为一种抗肿瘤药物。Wang 等经用鬼臼亚已苷作用人成骨肉瘤细胞系U2－ OS后，根据不同的时间间隔分别提取细胞mRNA，用寡核苷酸芯片测定6591条mRNA表达百的变化，发现62条mRNA表达县有变化。通过选取其中12条基因做进一步研究，发现有2条是已知的 p53调控基因（WAF1／p21和PCNA），有两条是新的p53靶基因，其余的与p53无关。在实验基础上，他们提出了介导鬼臼亚乙苷诱导细胞凋亡的信号传导途径。此项研究工作使人们又多获得一种抗肿痛药物的靶点。
应用DNA芯片还可直接筛选特定的基因文库以寻找药物的作用靶点。如给酵母某一特定的呈单倍体状态的基因对应的位置上放置一个遗传标记，该标记可被DNA芯片所识别，那么通过比较药物作用前后用芯片检测整个文库的结果，便有可能获得药物作用的靶基因。研究者称此种筛选方式为 haploinsufficiency drug screen。
用DNA微阵列芯片进行药物研究还存在如下一些缺点：①由于杂交样品制备复杂，采用DNA微阵列芯片很难实现高通量。②DNA微阵列芯片只能用于检测已知序列的基因。③由于灵敏度的限制，采用现存的DNA微阵列芯片难以检测到表达水平很低的基因。
除了DNA芯片外，组织芯片、蛋白质芯片和细胞芯片也在药物研究中崭露头角。最近，耶鲁大学的研究小组首次报道了真核生物蛋白质组水平的蛋白质微阵列芯片。他们表达和纯化了酵母的 5800种蛋白质，并将这些蛋白质点样固定在载玻片上，制作了酵母蛋白质组微阵列芯片。他们使用这种芯片筛选能与特定蛋白质和磷脂相互作用蛋白质，发现了新的能与钙调蛋白和磷脂相互作用的蛋白质。这种蛋白质微阵列芯片可以用于筛选与蛋白质相互作用的药物，还可以用于检测蛋白质翻译后的修饰。他们的研究成果证实了制作和使用蛋白质组微阵列芯片进行功能分析检测的可行性，并向人们预示了蛋白质微阵列芯片在药物开发领域的广阔应用前景。
Zlauddin和Sabatinl发明了一种细胞微阵列芯片。他们首先将不同的质粒DNA点在玻璃片上，做成质粒DNA做阵列芯片。接着用脂质转染试剂处理该质粒DNA微阵列芯片，然后在处理好的质粒DNA微阵列上培养哺乳动物细胞。点在芯片上的质粒DNA在转染试剂的帮助下原位转染哺乳动物细胞，在质粒DNA微阵列的每一个质粒样品点的相同位置形成了转染了该质粒的细胞群。细胞因获得了外源DNA而获得了新的性状。这样，由质粒DNA芯片制成了由不同性状细胞组成的细胞做阵列芯片。他们尝试用这种细胞芯片来确证药物作用靶点，寻找能改变细胞生理状态的基因产物。这种新型细胞芯片可以用来在哺乳动物细胞内高通量筛选有可能成为候选先导分子的化合物、蛋白质或寡核苷酸。在功能基因组研究和药物开发等领域具有很大的应用潜力。
2 生物芯片作为超高通量筛选平台的应用
在过去的十几年里，随着科学的进步以及在巨大的经济利益驱使下，药物筛选技术得到了飞速的发展。在80年代中期（高通量筛选形成之初），每天只能筛选30种化合物，到90年代中期，每天可筛选1，500种化合物，而如今每天可筛选超过 100，000个化合物。高速、低成本的高通量筛选已成为当今药物筛选的主流，并逐渐向超高通量方向发展。在过去的几年中，世界上著名的制药公司纷纷与以高通量药物筛选技术为核心的中小型生物科技公司结盟或合作，采用高通量或超高通量药物筛选技术进行先导物分子的筛选。要进一步提高筛选率，高通量筛选技术的各个方面均需要技术创新，这为生物芯片技术进入药物筛选领域提供了宝贵的契机。
提高药物筛选的通量，实现超高通量筛选有2 条途径：一是微型化，一是自动化。生物芯片作为一种新型技术平台，正可满足超高通量筛选微型化和自动化的需要。生物芯片技术应用于超高通量筛选有2个发展方向：一是微孔板/微阵列技术，一是微流体芯片技术。
微孔板/微陈列技术
微孔板技术的发展主要表现在板孔数的增加。目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至 9600孔板。如Oldenburg等报道了用9600孔板（0.2μL/孔）分析系统，以金属蛋白酶为靶，对组合及分离纯化的化合物库进行筛选的结果。虽然随着材料科学和加工技术的发展，微孔板技术有了长足的进步，但其发展面临着一些不易解决的困难，主要有：微量液体极易蒸发，不适于那些不能用二甲亚砜（DMSO）作溶剂的筛选方法以及受限于当今还不够完善的微量液体分配技术。
微阵列技术是将微孔板技术进一步微型化。最近，哈佛大学的研究人员开发了化合物微阵列芯片，主要用于筛选能与特定蛋白质特异性结合的化合物。他们将玻片表面进行化学处理，使其衍生化产生活性基团，然后将溶于有机溶剂中的化合物用机械手点在经处理的玻片表面，化合物与玻片表面的活性基团反应而被固定于玻片表面，这样就将不同的化合物排布成微阵列，固定在玻片表面，制成化合物微阵列芯片。随后将感兴趣的蛋白质进行荧光标记，然后与微阵列芯片上的化合物反应，经清洗后，再进行荧光检测就可以筛到能与这种蛋白质特异性结合的化合物。他们用化合物微阵列芯片进行了原理性实验，其结果表明，使用这种化合物微阵列芯片可以并行、快速地进行大规模的化合物与蛋白质的结合筛选。他们最先是将玻璃片表面进行马来酰亚胺衍生化处理，后来采用亚硫酰氯处理，都获得了成功。他们还尝试了使用这种化合物微阵列芯片进行大规模对映异构体的分型检测。加利福尼亚大学Davis分校的科学家们采用类似的方法也制造了一种化合物微阵列芯片。他们对玻琥载玻片表面进行氨基化处理，在氨基玻片上进行乙醛酰衍生化，然后将带有连接臂的配体分子点在修饰过的玻片表面。在进行化学连接反应之后，这种固定了不同小分子配体的微阵列芯片被用来进行了3种生物学检测：蛋白质结合检测、功能磷酸化检测和活细胞粘附检测。实验结果证实了化合物微阵列芯片可以帮助我们对由组合合成方法获得的大量化合物进行快速的功能分析和筛选。化合物微阵列芯片技术与基于微珠体的固相组合会成技术相结合为高通量药物筛选带来了一条新的途径，将对高通量药物筛选技术的发展产生积极的影响。
最近，出现了一种被称为芯片膜片钳（patch-on- a－chip）的新技术。在这种膜片钳芯片上加工有检测电信号的点阵，点阵中的每一个点是一个电信号记录单元，同时每个点底部与负历相通，可以吸位细胞。这样膜片钳芯片上的每一个点就可以实现传统膜片钳技术的功能。膜片钳芯片具有操作简单、快速和可实现高通量等优点，可以用于电生理研究和高通量药物筛选。位于美国圣地亚哥的AVIVA公司正在致力于此项技术的开发。

哪些现代生物技术可以用来检测环境？

生物酶技术、金标免疫速测技术、FCR技术、生物发光检测技术、生物芯片技术和生物传感器。其中生物芯片技术和生物传感器应用最为广泛。
生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程如样品制备、化学反应和分析检测 ，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表 面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。生物芯片技术有四大要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。生物芯片的成熟和应用一方面将为本世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命；另一方面生物芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段，故必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台。 在环境保护上，基因芯片也有广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时还可用于农业、商检、司法等领域的实用化芯片的开发。
生物传感器是一种将生物敏感元件和物理元件相结合制成的分析仪器。其基本原理是将生物敏感元件发生的特异性反应及信号经由物理元件转变为光、电、声等易检测信号，从而间接地获知待测物的有关信息。生物传感器在环境检测中的具体应用有BOD生物传感器测定水环境、微生物传感器快速测定酚、阴离子表面活性剂传感器测定LAS浓度、硝酸盐微生物传感器测定水体硝酸盐、微生物传感器测定大气各组分、残留有毒有害物的检测和污染物急性毒性的检测等等。
（以前有人问过···········）

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