背景资料三：15只恒河猴——SARS疫苗研究的替身

背景资料三：15只恒河猴——SARS疫苗研究的替身

今年7月份，我国第一个SARS冠状病毒感染动物模型在中国医科院动物所成功建立，这标志着困扰SARS疫苗和药物研究的“瓶颈”被突破，人类SARS终于有了理想的“替身”——恒河猴。

SARS科技攻关战役打响以来，由于研究难度极大，SARS冠状病毒感染动物模型的建立一度成为影响攻关进程的“瓶颈”。以中国医科院／协和医大动物所常务副所长秦川教授为首的课题组及早动手，利用本所的P3实验室在国内率先展开相关研究。他们分成两个小组，夜以继日地埋头苦干60天，终于取得重大突破。

据秦川教授介绍，在中国CDC病毒所专家协作下，她和同事们用从我国SARS病人分离经Vero－E6细胞培养扩增的SARS冠状病毒，经鼻腔感染15只恒河猴。结果在病毒接种的第2～3天时，15只恒河猴均有一过性（4天左右）体温升高。在病毒接种的第5天，经套式RT－PCR检测，在部分恒河猴的咽拭子标本中即检测出SARS冠状病毒RNA，病毒接种的第10天，在15只恒河猴的咽拭子标本中均检测出SARS冠状病毒RNA。在病毒感染的第7天及第13天，他们分别从4只猴咽拭子和肺脏组织、淋巴结标本中成功分离出SARS冠状病毒。在病毒接种的第17天，15只恒河猴血清中抗SARS冠状病毒抗体（LgG）呈阳性反应。

通过相关病理学观察，他们发现，在病毒接种的第5、10、15、20、30天，恒河猴肺组织检查可见间质性肺炎，肺组织水肿、结构破坏、出血，小血管玻璃样变。30天后感染猴已经出现肺纤维化。总之，恒河猴的病理学改变与人类感染SARS冠状病毒后出现的病理改变十分接近。

根据上述研究结果，秦川教授指出，恒河猴可作为SARS冠状病毒感染的动物模型。其感染后出现的病理学改变、体液免疫应答和排毒现象均可作为SARS发病机制研究、有效治疗药物筛选、疫苗评价的重要指标。

小鼠感染新冠病毒能活多久

人冠状病毒（hCoVs) 病原学涉及许多宿主，包括爬行动物、鸟、猪、狗、猫、牛、啮齿动物、蝙蝠、骆驼和人。除了人外，hCoVs可通过动物与人之间的迁移过程，引起人畜共患病的发生。在过去15年里，包括2019发现的新型冠状病毒（SARS-CoV-2），已发现了7种hCoVs，比如OC43、NL-63、HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。一般认为，蝙蝠是所有冠状病毒的天然宿主，然后通过中间宿主，引起hCoVs感染性疾病。比如，2003年的SARS-CoV（死亡率～10%）和2013年的MERS-CoV（死亡率～35%）两种新型冠状病毒，分别是通过中间宿主果子狸和骆驼，在全球引起严重急性呼吸道困难综合症的爆发流行。最近的SARS-CoV-2（死亡率约2～4%）已经成为影响到141个国家地区的全球大流行。这些都再次表明，新型人传人病毒感染性疾病的出现，已经并将继续对全球公共卫生及经济造成潜在的巨大威胁与挑战。因此，深入研究hCoVs与宿主分子相互作用机制，探讨病毒致病过程，从而指导临床治疗、疫苗和药物研发，将具有非常重要的意义。

hCoVs基因组（～30 kb) 的组成包括，编码高度保守的16个非结构性蛋白基因，hCoVs都含有的4种结构蛋白基因，比如Spike(S)蛋白、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）、以及其他非保守的具有hCoVs特性的辅助蛋白基因。生化与体外培养研究已经表明，hCoVs与宿主细胞表面蛋白间的相互作用，是确保病毒侵入宿主细胞与复制，引起机体免疫反应的基础。研究已证实，S蛋白在多数hCoVs与宿主细胞受体相互作用中，发挥着重要的决定因素。S蛋白在病毒表面形成三聚体，其中每个单体都含有受体结合区（RBD），该RBD能与宿主细胞表面同源受体发生相互作用，帮助病毒侵入细胞内。有研究表明，hCoV的RBD与其相应的细胞受体结合具有物种特异性，比如对SARS-CoV和SARS-CoV-2来说，人ACE2已被证实为其宿主细胞上相应的结合受体，而不能与蝙蝠ACE2受体结合；同样，bSARS-CoV(蝙蝠冠状病毒）也只与其相应的bACE2受体结合，不与hACE2受体结合。并且发现，位于SARS-CoV的RBD中310～518氨基酸区域是决定hCoV结合其相应受体活性的最小受体结合域。而对于MERS-CoV，DPP4则是其宿主细胞表面的结合受体。

位于S蛋白中的RBD被认为是研发保护性抗体与疫苗的关键靶点，而其他高度保守区结构与非结构蛋白，以及主要酶活性蛋白，也可作为广谱抗hCoVs的有效治疗靶点。另外，hCoVs中的那些非保守的辅助蛋白，则被认为在介导宿主免疫反应的种属致病特异性方面，发挥了决定性作用。

SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV三种hCoVs引起的疾病临床表现都有严重急性呼吸道疾病的症状，包括弥漫性肺泡损伤与透明膜形成、肺泡纤维沉积、水肿、出血、细胞碎片、肺泡与间质性炎症及肺组织坏死等临床表现。因此，研究该类hCoVs感染疾病有效的小鼠模型，至少需要小鼠在受到病毒攻击后，表现出和hCoVs感染疾病相似的病理变化，且能引起严重致死性呼吸道疾病。

二、 应用小鼠模型研究

SARS-CoV感染致病性有哪些策略与方法？

根据小鼠构建策略与方法不同，目前SARS-CoV感染小鼠模型分为三种：1. 应用人SARS-CoV病毒直接感染近交系小鼠；2. 应用基因编辑小鼠技术，敲除小鼠相关基因，或将人宿主细胞病毒结合受体（比如ACE2）转入小鼠体内；3. 将野生型SARS-CoV病毒在小鼠体内进行反复适应进化过程，获得致病性更强的小鼠适应病毒，从而建立能引起明显临床表型的病毒感染小鼠模型。关于SARS-CoV感染疾病小鼠模型，主要的研究进展集中于以下几个方面：

直接应用近交系小鼠模型研究病毒致病性

最早开展SARS-CoV感染小鼠模型的研究，是直接在近交系BALB/c小鼠上进行的。在年轻BALB/c小鼠（4-6周）鼻腔里感染SARS-CoV临床株(Urbani)的实验发现，小鼠上/下呼吸道出现病毒复制现象，第3天达高峰，到第7天被清除。但小鼠体重持续增加，没有出现任何相关的临床症状。幼鼠被注射免疫血清后，其呼吸道出现明显抵抗病毒复制的作用，提示人SARS-CoV可以诱导小鼠产生有效的体液免疫反应。另外，也有应用年轻C57BL/6小鼠（5-6周）进行类似的实验，结果如同BALB/c小鼠一样，伴随体重缓慢增加的同时，也有小鼠的上/下呼吸道以及大脑的病毒复制现象，而在SARS-CoV感染患者中，还未见该病毒在大脑中有复制现象。所以，这种只有病毒复制，但缺乏致病作用的所谓感染小鼠模型，很难有效准确用于评估干预治疗效果等方面的研究。

由于SARS-CoV感染人群造成病死率的增加，与年纪较大的患者（大于60岁）发生严重急性呼吸道困难综合症（ARDS）的增加有关，为了探讨能模拟老年人感染SARS-CoV更适合的小鼠模型，有研究分别应用12-14月大的BALB/c、C57BL/6和129S6近交系野生小鼠进行实验，结果发现，此三种老年小鼠经SARS-CoV感染后，都有短暂（平均约7天左右）的临床症状表型，比如体重减少、乱的毛发、弓背和脱水等，更为重要的是，在组织病理学方面，表现有血管周围和细支气管周围炎性细胞渗入，细支气管细胞坏死，以及间质性肺炎发生等现象。而且，BALB/c小鼠的广泛肺泡破坏可持续到第9天，非常接近人SARS-CoV感染的临床病理症状。该研究也是第一次阐明了不同宿主遗传及年龄特征，可以显著影响SARS-CoV感染致病性强弱，同时也再次表明，病毒感染性疾病的发生，不仅与病毒本身特性有关，宿主自身相关因素也发挥极为重要的作用。

应用基因编辑技术建立病毒感染疾病小鼠模型

直接应用SARS-CoV临床分离株感染野生小鼠和免疫缺陷小鼠模型，都不能引起小鼠感染死亡。可能的原因是，与人群比较，这些小鼠对SARS-CoV易感性较低，或人病毒对小鼠致病性较弱等有关。因此，应用基因编辑技术，建立对SARS-CoV易感的小鼠模型，已经成为当前该研究领域更加关注的研究方向。关于基因编辑小鼠模型构建的基本策略与方法可参考我在中国实验动物信息网中的相关专访资料（ /Category_2287/Index.aspx）。

最早应用基因敲除小鼠模型，研究先天性免疫缺陷小鼠发现，这些小鼠常常会出现体重减轻，并伴随有进行性恶化肺部疾病的表现。比如Stat1基因敲除小鼠，在受到SARS-CoV临床分离株感染后，病毒复制3天达高峰，并持续至22天，且可出现明显的临床症状，虽然不是所有的病理变化都与人的一样，但一些病理特征却与人感染SARS-CoV后常见的临床特症相似，比如伴有严重呼吸上皮细胞坏死的细支气管损伤等。而野生对照小鼠则只表现有下呼吸道病毒复制，无相关肺部疾病表型。因此，经过基因编辑的小鼠模型比野生型小鼠对SARS-CoV感染更易感，而且表现出更接近SARS-CoV感染患者呼吸道的临床病变。

目前已经证明，SARS-CoV是通过S蛋白中RBD与细胞受体人血管紧张素转换酶2（hACE2) 结合启动入侵。该hACE2基因位于X性染色体上，表达于人上皮细胞及血管内皮细胞，广泛表达于人包括胃肠道、心脏、肾、肺、肝和骨骼肌等多个组织器官，且具有在人睾丸高表达的特点。因此，成功构建能表达hACE2受体的基因编辑小鼠，已被证实是更能有效被SARS-CoV感染，引起小鼠呼吸道明显的病理改变的解决策略与方法。同时也表明，相比于小鼠自身ACE受体，hACE2受体对人SARS-CoV临床分离株S蛋白RBD的结合更加有效。

关于hACE2遗传修饰人源化小鼠模型的构建策略，目前通常应用不同的组织特异性或广泛表达启动子与hACE2基因构建的表达载体，通过原核注射的方法，获得随机插入的转基因小鼠模型，比如，细胞角蛋白（上皮细胞特异性表达-K18）启动子；CAG启动子（广泛表达）或小鼠ACE2基因启动子。应用这些ACE2人源化小鼠模型的研究结果表明，hACE2的表达水平高低与其疾病的严重程度直接相关。虽然，这些小鼠模型都表现有呼吸道上皮细胞感染，但同时在小鼠脑部也可见高表达的hACE2基因，并在SARS-CoV感染模型中发现，病毒量在小鼠脑部的增加与广泛扩散，最终导致小鼠发生脑炎而死亡。

虽然，关于SARS-CoV感染ACE2人源化小鼠后，小鼠为什么最终会因为相关神经系统损伤而死亡，而不是如同人感染后因严重肺部组织损伤导致死亡的原因，目前尚无很好的解释，也许这就是人们常强调的物种间的差异吧。但是，成功构建对人SARS-CoV易感的ACE2人源化小鼠模型，无疑有助于SARS-CoV致病机制，以及评价疫苗与药物安全性及有效性等方面的研究。

应用适应实验进化方式获得SARS-CoV变异强毒株

通过将病毒种植在小鼠特异性组织中，进行适应进化，迫使病毒适应其特定生存环境，并在特定的选择压力下发生突变，以达到更有利于其有效复制的目的。为了让SARS-CoV适应在野生小鼠肺部复制，并引起严重急性呼吸道疾病表型， 研究者通过对BALB/c小鼠（6周龄）鼻腔反复接种SARS-CoV临床株15次,直到野生小鼠出现明显的人感染SARS-CoV的临床症状（比如体重下降等）。

在小鼠肺部感染反复传代15次后的适应病毒被称为MA15病毒株，应用该适应株MA15病毒感染不同周龄的野生BALB/c小鼠，肺部出现高滴度病毒量与病毒血症，并扩散至肺外组织等；表现体重快速下降，淋巴细胞减少，中性白细胞增多，以及与肺炎相关的组织病理改变。最后，由于病毒大范围复制，导致小鼠肺细胞与上皮细胞坏死。分析该毒力增强型MA15病毒的变化发现，与原始SARS-CoV临床分离株比较，虽然MA15病毒株只发生了6个编码氨基酸的突变，但却能分别导致4周龄，6-8周龄和老年BALB/c小鼠100%的致死率。后来的研究也证实，该MA15病毒株也可引起其他野生小鼠品系（比如C57BL/6) 的感染及死亡。在MA15基础上进一步感染适应传代，目前已经分别获得MA20和MA25相应毒力的致死病毒株。通过比较不同传代获得的适应致死病毒株，有助于分析病毒引起严重呼吸道致病毒力的变化与其蛋白特定突变间的相互关系，为进一步研究特异性SARS-CoV蛋白适应性突变在病毒宿主间作用联系提供了方便。

应用协同交配（Collaboratory Cross-CC）技术建立遗传背景多样性小鼠品系

关于建立CC小鼠品系的策略与方法，可参考我在中国实验动物信息网“小鼠模型在研究病毒感染性疾病中的应用”内容。应用CC小鼠品系建立SARS-CoV感染模型，有助于寻找在病毒致病过程中，是哪些遗传相关影响因素，决定了宿主对病毒感染性疾病的不同反应。通过用SARS-CoV感染CC小鼠后，分析比较不同表型的CC品系小鼠，比如体重减少的高与低，或病毒滴度的高与低等，达到快速确定与表型相关基因的目的。

利用CC小鼠技术，有研究者从SARS-CoV感染致病过程中，寻找到对病毒敏感性完全相反的CC小鼠品系（CC003和CC053/Unc)，基因定位分析发现，在Toll样受体信号通路中的适配体蛋白Ticam2，是决定严重呼吸道疾病表型的潜在关键因子。基于这类研究的结果表明，CC小鼠可作为更加客观模拟人病毒感染疾病临床表型的一种新型小鼠模型。

三、应用小鼠模型研究MERS-CoV致病性有哪些策略与方法？

研究者们在利用MERS-CoV直接感染野生小鼠时发现，以前对SARS-CoV感染/复制相对易感的野生小鼠品系，对MERS临床分离株完全不易感，只有非人灵长类(NHPs)动物对MERS-CoV易感。进一步研究发现，免疫缺陷小鼠也对该病毒不易感，说明该病毒感染与宿主免疫反应限制可能没有直接关系。

同时在研究MERS-CoV感染细胞的结合受体二肽基肽酶（DPP4）时发现，不同于SARS-CoV病毒S蛋白中RBD可与小鼠ACE2受体相互作用，小鼠DPP4受体并不支持与MERS-CoV病毒中S蛋白相互作用。分析MERS-CoV病毒S蛋白与人DPP4受体相互作用的晶体结构进一步表明，在与MERS-CoV 的S蛋白中RBD结合过程中，人DPP4受体中某些特异氨基酸组成发挥了决定性作用，而对应位置上的小鼠DPP4氨基酸组成（比如A288和T330）与人是不同的。更为重要的是，与其他包括人、NHPs、蝙蝠和骆驼等易感物种同源DPP4不同的是，小鼠DPP4中独特的T330位氨基酸N-糖基化位点，有可能成为空间上阻碍了MERS-CoV感染小鼠的原因。另外，雪貂和豚鼠的DPP4也含有类似的糖基化位点，这也间接解释了为什么这两种小动物对MERS-CoV不感染的可能原因。目前，关于MERS-CoV感染疾病小鼠模型的研究进展如下。

基因编辑DPP4人源化小鼠模型

最早构建DPP4人源化小鼠模型，是通过直接注射能短暂表达人DPP4受体的腺病毒至野生小鼠肺部来实现的。结果表明，短暂表达人DPP4的小鼠对MERS-CoV易感，且引起病毒在肺部复制，并伴随轻度肺炎以及短暂的体重减少，在老龄和免疫缺陷的小鼠中表现更加明显。虽然，没有见到严重呼吸道疾病症状及死亡现象，但应用该策略构建特殊Ad-hDPP4小鼠模型，对于新型未知病毒出现时，实现快速评估针对MERS-CoV感染肺部病毒复制的抑制干预治疗对策，提供了简便实用的方法。 当然，在明确相应治疗对策是如何防治严重呼吸道疾病过程的机制方面，此类小鼠模型的构建方法，则存在明显的局限性。

与SARS-CoV构建遗传修饰小鼠模型的策略与方法相似，为了构建与感染MERS-CoV病人临床表型相关的小鼠模型，应用基因编辑技术，将人DPP4基因导入小鼠体内，使小鼠全身过表达人DPP4基因。比如，有研究者选用CAG广泛表达启动子建立的人DPP4转基因小鼠模型，该小鼠经MERS-CoV感染后，其肺部出现高滴度的病毒量，并引起严重呼吸道疾病症状及死亡。但同时也发现，小鼠其他组织器官包括脑、心、脾、肾和小肠等，也见有高滴度的病毒量，并出现多器官损伤的表型。而且，小鼠脑部的病毒量也显著高于肺部的病毒量，并在小鼠感染的第9天出现病毒性脑炎，表现为瘫痪症状。

也有研究者应用组织特异性启动子，建立上皮细胞特异性表达人DPP4的转基因小鼠模型，比如应用细胞角蛋白（K18）或表面活性C蛋白（SPC）启动子。应用SPC启动子表达人DPP4小鼠经MERS-CoV感染后，并不引起小鼠死亡，或呼吸道疾病症状。相反，K18启动子表达人DPP4的小鼠感染MERS-CoV后，体重下降，肺出血，并在第6-7天死亡。肺部的病理表现符合严重呼吸道疾病特征。不幸的是，这种小鼠模型，表型不仅会出现在肺部，也出现在脑部，表现为神经疾病相关症状。

相对以上的基因编辑小鼠策略，再生元（Regeneron）公司应用其独特的VelociGene技术，将整个小鼠DPP4基因组区域（～79 kb) 替换成人DPP4基因组区域 (～82 kb) ，但保留小鼠DPP4基因的5’内源性启动子和3’ RNA终止的非翻译区域，这样插入的人DPP4基因的表达则与小鼠DPP4基因表达水平和组织分布相一致。该定点插入性人源化DPP4小鼠经MERS-CoV感染后，可引起明显的体重下降与死亡。该感染小鼠肺部病理学表明，小鼠产生中等程度的呼吸道感染症状，伴有少部分的严重呼吸道疾病症状。该研究结果第一次显示，CD8 T细胞和巨噬细胞在MERS-CoV致病过程中，发挥了显著作用。更加重要的是，MERS-CoV感染/复制主要集中在小鼠肺部，只有少量肺外组织有病毒入侵，且无小鼠脑部损伤。因此，相比于全身过表达或组织特异性表达人DPP4的随机插入的转基因小鼠模型，该种定点插入DPP4基因的人源化小鼠模型，更能准确模拟MERS-CoV感染患者急性呼吸道疾病的临床特征。

也有研究者提出，无论是人DPP4基因的随机还是定点插入修饰，需要考虑这类DPP4人源化小鼠模型自身的局限性，因为先天DPP4本身就有物种特异性，且具有参与多种特定生理过程的作用。比如，DPP4参与了许多细胞因子和趋化因子的修饰过程，而这些相关因子对维持免疫球蛋白稳定状态，具有至关重要的作用。所以，经基因修饰的DPP4小鼠有可能明显改变了小鼠原本DPP4所具有的生物学和免疫学特征，从而人为改变MERS-CoV感染的病理结果以及评价治疗策略的免疫学反应。

因此，为了避免基因修饰过程可能对小鼠DPP4基因功能造成的影响，也有研究者应用CRISPR/Cas9技术，对小鼠DPP4基因中两个关键氨基酸（A288L和T330R）进行修饰，成功构建了MERS-CoV感染DPP4点突变的最新小鼠模型。分析该DPP4点突变小鼠模型表明，该小鼠表现出正常内源性DPP4基因的表达特征及其生理学功能（比如糖代谢和T细胞激活等）。该DPP4点突变小鼠经MERS-CoV临床株感染后，虽可出现肺部高滴度病毒复制现象，但无临床疾病症状的出现。另外，最近也有将小鼠DPP4基因的10-12外显子区域替换（KI）成人DPP4相应区域基因组，成功构建DPP4基因的部分定点修饰的KI人源化小鼠模型。该种DPP4 KI人源化小鼠模型比再生元的人源化小鼠模型的修饰区域要小，但比DPP4点突变小鼠模型修饰程度大。研究表明，该DPP4 KI人源化小鼠对MERS-CoV临床株易感，出现肺部病毒复制，但无呼吸道疾病症状。

就目前而言，有观点认为，小鼠需要表达完整的人DPP4基因（比如再生元公司策略），才能在受到MERS-CoV临床株攻击后，建立感染死亡的病毒感染小鼠模型。通过随机过表达人DPP4基因，或者点突变/定点插入替换部分小鼠DPP4基因等方法，难以真正模拟感染MERS-CoV的患者临床特征，并有可能破坏了小鼠原有存在的免疫学平衡，从而增加了分析该病毒感染疾病的病原学，以及相关防治对策的的难度。

MERS-CoV小鼠适应进化获得强毒株病毒

在DPP4点突变小鼠基础上，应用病毒适应实验进化方法，在DPP4点突变小鼠中传代15次后获得适应株MERS-CoV，再用该适应株病毒感染DPP4点突变小鼠，可引起小鼠呼吸道功能丧失、严重急性呼吸困难综合症的病理变化、并导致小鼠死亡。进一步的研究分析表明，该小鼠模型中出现的严重呼吸道疾病与死亡，可以通过针对MERS-CoV S蛋白的疫苗及相应的抗体疗法，得到预防与治疗。且在小鼠大脑中检测不到任何病毒。 然而，需要强调的是，构建该种病毒感染小鼠模型，仍然需要高浓度的适应株MERS-CoV (比如5x10 6PFU)。为了降低病毒用量，对已传代15次的适应株MERS-CoV，再继续20次传代适应，最终获得传代35次的毒力较高的小鼠适应株MERS-CoV，从而降低了DPP4点突变感染小鼠模型的病毒的使用量（10 3-10 5PFU）。而DPP4 KI人源化小鼠，经过传代31次的小鼠适应株MERS-CoV感染后，出现严重呼吸道疾病症状且死亡。适应小鼠MERS-CoV强力株的相关分析发现，病毒S蛋白上第222位氨基酸的突变，可能在该病毒毒力增强中起了关键作用。

MERS-CoV感染的CC小鼠模型

研究者认为，MERS-CoV感染的最理想小鼠模型，是直接应用临床分离株感染未经任何基因修饰的小鼠，并能引起临床病人相似的急性严重呼吸道症状。也许直接应用CC小鼠品系是合适的选择。比如，有研究者将DPP4点突变小鼠与CC小鼠品系交配，或者直接对CC小鼠品系进行相应的基因编辑，以确保基因修饰小鼠的DPP4内源性表达、分布和功能不受影响，同时小鼠还具有遗传背景多样性的特征，从而有助于筛选对MERS-CoV临床分离株差异敏感性的小鼠品系。然而，不同于SARS-CoV，目前的研究表明，CC小鼠对MERS-CoV也不敏感。

四、如何应用人冠状病毒小鼠模型评价抗病毒治疗效果？

构建小鼠模型的最终目的，是准确找到能真实反映hCoVs 感染疾病的病原学，并在此基础上，评价某一种疾病针对性的预防与治疗方法是否有效。虽然已经有不少对hCoVs 的潜在药物、抗体和疫苗等相关预防治疗进行评估的研究，但是到目前为止，还没有FDA批准的专门治疗SARS-CoV或MERS-CoV的相关药物与疫苗。各种广谱抗病毒药物联合应用，结合干扰素疗法（alpha或beta)， 或者相关免疫调节剂（比如肾上腺皮质激素）的治疗，对SARS-CoV和MERS-CoV效果不佳，有时候还可能会加重该类病毒感染疾病的严重程度。

最近，抗hCoVs 新药瑞德西韦（GS-5734，药品名Remdesivir）的研究表明，瑞德西韦是一种小分子核苷酸类似物，有抑制RNA合成酶的作用。该药在NHPs（比如恒河猴）动物实验中，显示出抗Ebola和MERS-CoV感染的作用，目前已进入临床试验阶段。另外，在人气道上皮细胞的进一步实验也证实，该药对多种人冠状病毒（SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV和NL63等），以及新兴的蝙蝠冠状病毒（HKU3、HKU5、SCH014和WIV），都有较为广谱的抗病毒效果。重要的是，小鼠体内研究表明，如果GS-5734是预防性使用，或在感染后24小时给药，该药能抑制SARS-CoV引起的免疫病理改变。但如果感染后48小时再用药，则失去缓解疾病症状的效果。虽然，小鼠与人之间的SARS-CoV致病动力学会有不同，但这些结果提示，病毒感染后，引起的呼吸系统免疫病理学变化，出现在非常短的窗口期内，这也使药物发挥效果的窗口期相应缩短了。

另外，再生元研究者应用前面介绍的DPP4人源化小鼠模型，对抗MERS-CoV S蛋白的人源化单克隆抗体的抗病毒作用进行了研究，结果表明，该单抗在MERS-CoV感染DPP4小鼠前一天，或感染后一天治疗，都表现有明显抑制病毒复制的作用。

有效的治疗方法不仅能防止病毒复制，更加重要的是，还能有效限制呼吸系统的病理变化。要想实现这样的治疗干预策略，必须是通过抗hCoVs 治疗与改善宿主免疫力相结合的疗法，从而达到抑制急性呼吸道困难症状引起的免疫病理变化的目的。

五、如何应用小鼠模型研究SARS-CoV-2感染的新冠病毒肺炎？

无论是核酸还是氨基酸序列比较分析都证实，SARS-CoV-2与SARS-CoV的相似性非常高 （分别约为80%和76%），而且SARS-CoV-2也是通过细胞表面的ACE2受体与宿主发生相互作用，引起与SARS-CoV感染相似（虽然不是完全相同）的严重急性呼吸道困难综合症等临床表现。因此，上面介绍的针对SARS-CoV感染的相关小鼠模型构建策略与方法，也适合于SARS-CoV-2感染小鼠模型的建立。需要提醒的是，已报道的通过基因编辑技术构建的SARS-CoV感染疾病小鼠模型，都是采用相应启动子，随机导入hACE2基因的策略实现的，而该种转基因小鼠构建策略的不足也是显而易见的（可参考我在中国实验动物信息网中的相关专访资料 /Category_2182/Index.aspx）。这也许与该类hACE2转基因出现的某些难以解释的疾病症状表现有关，比如出现严重神经系统损伤症状，且成为小鼠感染致死的原因。而我们也知道，对于SARS-CoV感染病人来说，出现严重呼吸道功能衰竭则应该是诱发死亡的主要原因。虽然，目前也有COVID-19患者出现神经系统严重损伤（比如急性脑血管疾病、意识障碍和骨骼肌症状等）的报道。而对于SARS-CoV-2感染病人，现也有人认为，出现严重呼吸道功能损伤后，由严重的细胞因子风暴（比如IL-6显著升高等），引起的多器官功能衰竭（比如心肾功能衰竭等）可能是COVID-19致死的主要原因。因此，选择合适的更能反映人病毒感染性疾病临床特征的小鼠模型构建策略，就显得相当重要了。比如，将hACE2基因以定点插入/替换小鼠自身ACE2基因的方式，构建与小鼠内源性ACE2表达水平与组织特性相似的ACE2人源化小鼠模型。

目前，国内已有研究者，首先应用hACE2启动子介导，以随机插入的方式，在ICR小鼠背景上成功构建了可表达hACE2的转基因小鼠模型，初步的研究结果表明，该小鼠在受到SARS-CoV-2临床分离株（HB）感染后，可表现明显的肺部炎症等病理变化。另外，也见国内其他研究者，通过应用高滴度SARS-CoV-2（比如～10 7 PFU) 直接攻击野生小鼠，引起病毒成功感染的初步研究结果。

赛业生物作为提供遗传修饰模式动物技术服务的全球专业化商业平台，也正在根据目前研究SARS-CoV-2感染性COVID-19的需要，努力研发更好更适合的hACE2基因修饰的人源化小鼠模型，希望能为生物医药研究领域的研究者们，提供可供SARS-CoV-2感染致病机制研究，以及疫苗与药物研发等选择的理想小鼠模型。

综上所述，病毒通常是首先通过与细胞受体结合而发挥其致病作用，然而，人病毒感染人细胞受体与小鼠的细胞受体往往是不同，并且，人与小鼠的先天免疫应答反应也存在一定差异。因此，多数情况下，小鼠对能感染人的病毒不易感。也就是说，应用小鼠模型来研究人病毒感染存在物种间差异。所以，应用成熟的基因编辑技术，对小鼠基因组进行有目的的改造，可以从某种程度上克服人与小鼠间的物种差异。

在探索人病毒感染性疾病过程中，小鼠模型在揭示病毒是如何引起病理改变，以及机体免疫反应等相关机制方面，发挥着重要的作用。并且，小鼠模型也是评价疫苗、抗病毒药物临床前安全性与有效性验证等方面的首选实验动物模型。

其实，在过去漫长的生物界自然进化过程中，我们可以发现，人类与病毒之间的关系，就是一种持续不断的相互战争、相互改变、以及相互完善的进化发展过程。相信，以后我们的关系也还会继续如此。

非典疫苗研制用了多少时间

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、北京科兴生物制品有限公司和中国医科院实验动物研究所组成的联合课题组于4月底展开的灭活疫苗的研制工作
。在确定了用于疫苗研制的毒株，找到有效的病毒灭活方法后，现已为灵长类恒河猴接种了实验性疫苗。
2004年1月，取得国家食品药品监督管理局颁发的SARS病毒灭活疫苗临床研究批件。
2004.05.23首次进行人体实验。前后经历约1年。

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