植物组织培养及其在中草药研究中的运用

植物组织培养及其在中草药研究中的运用

植物组织培养（Plant

Tissue Culture）是应用无菌培养的方法培养植物的一个离体部分，也即是一种将自然环境中分离出来的植物细胞或组织放入含有合成培养基的瓶中，在无菌条件下使之生长或发育的方法。这项工作自动控制50年代后期至今巳取得了很大的进展，如诱导培养胡萝卜的体细胞分化成完整植株，由曼陀罗的花药培养形成了单倍体的植株。

从而证明了植物每个体细胞都有形成整体植物的潜在能力，如植物细胞具有“全能性”，在离体培养的一定条件下能诱导其分化器官和再生成植株。70年代以后有关植物原生质体培养和体细胞杂交的研究得到了很诀发展，如烟草、曼陀罗、颠茄、胡萝卜、油菜等能从其原生质体经培养再生分化长成胚或完整的植物，利用原生质体融合已经能使烟草属和矮牵牛属的杂种细胞增殖分化成杂种植株。

因此，运用组织培养方法可以在比较简单易观察的条件下研究细胞、组织或器官的繁殖、生长和分化，以及各种外界因素对它们的影响，从而为解决农业生产和药物生产中的某些问题开辟了广阔的前景，目前已有若干重要成果应用于生产实践中，一为营养繁殖系的快速繁殖，如以甘蔗为例，原来每亩要用蔗种0.5～1吨，用组织培养快速繁殖的幼苗进行栽培可节省大量蔗种。又如贝母繁殖率非常低，而用组织培养分化出的三个月左右的鳞茎，其大小就相当于用种子繁殖二年生的鳞茎，另一为药物和生物制品的工业生产，药用植物的有效成分一般都从植物体提得，其产量和质量难免要受到植物的遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素所影响，如果能采用类似培养微生物产生抗菌素的方法生产有效成分，就可克服这些缺点，这对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的植物药更有意义。如近年来已大量培养人参组织，并提取有效成分，因此利用组织培养生产药用成分，探索天然药物生产工业化的途径是当前药物生产的一个新方向，随着大规模人工培养技术的成功，就有可能用组织培养法来代替全植物提取有效成分，这项工作将是未来研究植物药的中心课题之一。

培养基的组成和配制法培养条件

材料和方法有效成分的形成

一、培养基的组成和配制法

近年来用的化学合成培养基大致由6种成分组成：（1）糖类，②多种无机盐类，（3）微量元素，（4）氨基酸、酰胺、嘌呤：（5）维生素；③生长素。此外，有些培养基还可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麦芽浸出液等，培养基中如加入0．5～1％的琼脂即为静止培养的固体培养基，否则为悬浮培养的液体培养基。不同植物材料常需要改变配方，如维持生长和诱导细胞分裂和分化的培养基配方就不同，因此配方的种类很多，目前以Ms （Murashige

and

Skoog）培养基配方为最常用的一种基本培养基，它利于一般植物组织和细胞的快速生长。

总之，在进行组织培养研究时应根据研究目的和培养植物的种类来确定培养基的组成，除营养、诱导作用外还应当注意离子平衡和毒性问题，如水一般都采用重蒸馏水，无机盐类一般都需用化学纯的药品，

pH值可用1N

KoH（或NaOH）溶液和2N

HCI调整。有时可以用普通药品代替，但须注意这些药品不仅应有营养价值，还须无毒。如果在工业上使用大缸深层培养细胞或组织生产有效成分和生物制品、应用培养基的量将要以吨位计量时，则采用什么代用品较为经济实用更应慎重考虑。

二、培养条件

（一）温度：对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合。

（二）光：

组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成，光是决定三因素。

（三）渗透压：

渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。

（四）酸碱度：一般植物组织生长的最适宜pH为5～6．5。在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。

（五）通气：

悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。

三、材料和方法

从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚珠等各个部分。

由于植物在自然条件下，表面常被霉菌和细菌污染，故材料必须进行灭菌处理。一般用漂白粉溶液（1～10％）、次氯酸钠溶液（0．5～10％）、升汞溶液（0．01％）、乙醇（70％）或过氧化氢（3～10％）等处理后，再用无菌水反复冲洗至净，然后在无菌室内，将所取的组织迅速培养在固体培养基上。在适宜的条件下，受伤组织切口表面不久即能长出一种脱分化的组织堆块，称为愈伤组织（Callus），此种愈伤组织在适当的培养基上经一定时间即能诱导生长成整株植物，因此愈伤组织既可是某种植物代谢产物的来源，又是诱导成株的主要途径之一。

在适宜的培养条件下，还可使愈伤组织长期传代生存下去，这种培养称为继代培养。但在继代培养中，不少植物培养的组织或细胞随着再培养代数的增加，分化能力就逐渐降低甚至丧失，其原因可能是由于在培养过程中原有母体中存在的、与器官形成有关的特殊物质被逐渐消耗所致，因此可以用激素或改善营养条件使之恢复，也有认为是组织和细胞在长期培养中遗传往的改变，主要是染色体的变化，出现大量多倍性或非整倍性细胞，这种改变恢复的可能住较小。不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度，结构也可松可紧，利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。要形成单细胞培养宜在较高盐分、高生长素及高水解酪蛋白的培养基中进行，然后移入液体并经搅拌而分散成单细胞。也有用加入一些果胶酶的办法，但一般来说要得到纯一的单细胞是很少的。

在培养药用植物选材时，还应考虑到所需要的次生物质在植物体中的合成部位，如果选材和培养方法适当，可使原植物内所产主的代谢物通过细胞或组织培养发生生化转变而获得。

通过组织培养可获得有效成分，但实际上只有大量培养成功才有经济价值。因此在生产上常采用悬浮培养法来代替含有琼脂的固体培养基。愈伤组织悬浮培养的生长通常比静止培养快，这是由于悬浮培养时营养成分可较快地渗入细胞，抑制生长的代谢废物可较快地除去，同时供氧情况也较好，在进行这种培养时要注意通气与定期更新营养液，这是保证生长稳定，次生物质产量高的关键之一。

四、有效成分的形成

列举用组织培养方法合成的一些有效成分。

利用组织培养方法产生药用成分，已渐渐成为药物生产的新方向之一。六十年代以来，有些国家已经开展了薯蓣及其他有关科属植物的组织培养，研究薯蓣皂甙元的形成，探讨其生物合成机制；已知有7种薯蓣属植物经组织培养后，可获得薯蓣皂甙元或其它甾体化合物，其中三角叶薯蓣Dioscorea deltoides Wal1。经组织培养得到薯蓣皂甙元的含量为0．3～2．5％，此外尚有鱼藤酮、甘草甜素，菸碱等，例如从烟草根尖细胞悬浮培养可产生2．9％（干重）菸碱。

在通常应用的基本培养基中适当添加生长激素、维生素或其他化学药品有时能使代谢物增加，如白花曼陀罗组织培养时，在培养基中加进0．1％酪氨酸可使阿托品的产量增加7倍多，芸香组织培养时在培养基中添加4一羟基-2喹啉酚，可促进白藓碱的合成和积累，在这两例中的添加物被认为是生物合成的前体。又如培养三分三愈伤组织时，在生长后期供给1my/1激动素，可使东莨菪碱的含量达到0．495％，比原植物中的含量提高很多。

除了培养基的组成外，环境因素也影响次生物质的产生。例如石芹的组织培养在黑暗中虽也增殖，但不形成黄酮类，而当暴露于光线中时，就能测出芹菜甙。组织培养应用在药学方面的工作虽然历史不长，但发展很迅速，它具有如下一些优点：

1．利用组织培养代替原植物的栽培以获得所需的有效成分，达到产量高，成本低的目的，还可节约土地。

2．除了应用于产生次生物质外，还可应用于生物转化。例如烟草组织培养中蒂巴因去甲基后可能生成吗啡。

3．从组织培养的定性分析中发现新化合物。例如在芸香组织培养中，合成和积累了芸香素（Rutacultin），它是一个至今尚未能从原植物或其他植物的呋喃香豆精中检测到的化合物。因而，组织培养将是获得新的生物活性化合物的一个来源。

4．一般情况下，组织培养是异养的，但也有自养的细胞系株，它们具有光合作用的能力而不依赖外界的糖类供应。这种特性将使细胞培养技术优越于全植物，并更为经济。

目前中国有关单位已成功地将麦角菌、灵芝、猴头菇等真菌进行工业化生产，高等植物组织培养在工业化中的应用也正在研究。

总之，植物组织培养这一新技术在中草药方面应用的前途是无限广阔的，它不仅有利于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生物合成等一系列理论问题，而且一旦工业化生产问题得到解决，将可以为防病治病做出很大的贡献。

可用于组织培养的植物有哪些

可用于组织培养的植物有哪些

几乎所有的植物都可以用组织培养的方式繁殖，但要求的条件与技术较高。

现在植物组织培养技术在生产中应用已经很普遍了，比如花卉中的国兰、洋兰、马蹄莲、安祖花（火鹤）；水果中的火龙果、香蕉、苹果、枣、石榴；林木中的竹子、桉树、柚木；药材中的罗汉果、绞股兰、石斛；蔬菜中的青花菜、芋头、马铃薯等等很多

适合组织培养的植物有哪些啊 ？

理论上什么植物都可以进行组织培养，但是利用组培技术繁殖植物就是为了快速得到大批量优良植株，所以应该选取形状比较优良的植物进行培养，植物的组织器官，茎，叶，芽，都可以培养，根据不同的植物选取不同组织和器官进行培养。也可以从种子培养出无菌苗然后用无菌苗进行接种。
对于经济实惠要看你想购买什么样的植株，如果你想培养的植物比较名贵那就不能考虑这个了，如果想做个简单的培养实验完全可以就地取材，随便找几株植物取其幼嫩的部位进行培养就可以了。

哪些植物常用于组织培养

首先明确组织培养的应用是
1植物快速繁殖，该应用的目的是保持植物原有的优良性状，因此该方法适合于那些具有优良性状但在自然状态下而无性繁殖比较难的植物，如兰花之类的植物。
2、植物脱毒：因病毒会降低产量，因此用于农作物的脱毒，如土豆。草莓之类的作物。
3、生产细胞产品：主要用于濒危植物，植物所含的物质作用比较大，因此采用植物组织培养的方法将其培养到愈伤组织后，使其产生大量产品，而生产周期比较短。如紫杉醇的生产等。
生产上用得最多的植物有马铃薯、草莓、香蕉、甘蔗、甘薯、枸杞、葡萄、杨树及兰花、月季、百合、康乃馨等；还有各种新引进的名、特、优品种及一些名贵药材。

关于植物组织培养的疑惑

首先是脱分化。植物组织培养通常采用已经完全分化的成熟组织，如植物的根，茎，叶等，必须将这些完全分化的外植体去分化 或 脱分化转变成具有未分化状态的愈伤组织。这时你可以进行一下选择：
1，当生长激素含量大于细胞分裂素时,会促进"根原基"的生长，即先生根。
2，当细胞分裂素含量大于生长激素时,会促进"芽原基"的生长，即先发芽。
也就是你可以让愈伤组织先生根 或 先生芽。

关于植物组织培养的问题……

外植体一般选用芽等分生组织的细胞，因为这些细胞分化程度低，且很少带有病毒。
细胞形态结构会发生变化，概括就是 去分化再分化
营养成分不是一直不变，一是植物体在不断消耗，有的时候我们也会进行补充；二是在诱导去分化再分化的时候，就需要调整激素的浓度。

关于植物的组织培养的问题

花粉来进行组织培养，算无性繁殖（没有经过精卵融合成受精卵），培养得到的是单倍体（由配子直接发育成）

植物组织培养与植物细胞培养的区别

一是，植物组织培养是用很多细胞，而植物细胞培养使用一个细胞。
二是，植物组织培养可以得到与母本的植株，而植物细胞培养即可以得到与母本的植株也可以得到单倍体植株(譬如说花粉培养）。

影响组织培养的因素有哪些

1.植物的材料
（1）不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。例如，菸草和胡萝卜的组织培养较为容易，而枸杞愈伤组织的芽诱导就比较难。
（2）同一种植物材料，因器官来源及其生理状况、材料的年龄、储存时间的长短等也会影响实验结果。
2.培养基
离体的植物组织和细胞，对营养、环境条件要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。植物组织培养常用MS培养基，其主要成分包括：
（1）无机营养：
大量元素：除了C、H、O外还有N、S、P、Mg、K、Ca等
微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Co、I等
（2）有机营养
维生素、Aa、琼脂、活性炭、烟酸、肌醇、蔗糖等
（3）植物激素
植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。按照不同的顺序使用这两种激素，会得到不同的实验结果。
当同时使用这两种激素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向。
（4）能量和渗透压
通常植物本身进行光合作用，产生糖类，不需要从外部供给糖，但在植物组织培养进行异养的状况下，大多不能进行光合作用来合成糖类，因此必须哎培养基中新增糖（一般是蔗糖），作为碳源和能源物质，同时糖对保持培养基的渗透压也有重要作用。
（5）PH
3.温度
温度是植物组织培养中成功的重要条件。在植物组织培养中大多采用最适温度，并保持恒温培养，以加速生长。通常采用25加减2摄氏度的温度，对大多数植物来讲是合适的，但也因种类而异。进行菊花组织培养时是18~22度。
4.光照
不同的植物对各种条件的要求往往不同。组织培养中光照也是重要条件，它对生长和分化有很大影响。当然这也和材料的性质、培养基情况以及由于光照而引起的温度上升等方面的因素有关。菊花培养的光照强度为1000~4000lx，每天光照12h。

哪儿可以弄到植物组织培养的培养基

你好，请问你是小批量做试验还是大量生产呢
一般网路有组培相关的公司在卖了，主要是MS培养基
因为不同植物对培养基要求不一样，个人建议有条件自己配，这样才知道怎么去改良配方
如确实需要购买，请留下你的qq或其他联络方式，细谈
欢迎追问，满意请采纳，谢谢

现代生物及农业技术在药用植物研究和生产中的应用是什么？

（朱蔚华）

1902年，最早作植物组织培养实验的G.Haberlandt预言，高等植物的离体细胞可以长成植物体。这一假说成为以后植物组织培养的理论依据。

1937年，White建立了组织培养的综合培养基，并和Gautheret等人首次成功地用烟草的茎形成层细胞和胡萝卜根的小块，在人工培养的条件下，使细胞增殖和诱导出愈伤组织。他们建立起来的植物组织培养的基本方法，成为以后各种植物进行组织培养的技术基础。

1948年，F.Skoog和崔澂发现，在培养烟草茎段和髓的培养基上，附加适当比例的腺嘌呤和生长素可以控制植物的组织长苗或长根，也就是说当腺嘌呤/生长素的比例高时产生芽，比例低时形成根。其后，C.D.Miller等（1956）发现，激动素代替腺嘌呤效果更好，建立了激动素/生长素比例的控制器官分化的激素模式。这种激素“控制论”的理论在植物组织培养研究中，至今仍起着指导作用。

50年代，组织培养技术发展迅速，由静止的固体培养发展到液体培养，其中又分悬浮培养、微室培养、看护培养、平板培养等。1958年Steward等人，用液体悬浮培养把胡萝卜的体细胞经胚状体的发育途径，培养成完整植株并且开花结实。这项重大突破，不但证实了Haberlandt的“细胞全能性”的设想，而且也为组织培养中研究器官形成和胚胎发生，开创了一个新的领域。

60年代初E.C.Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功，为近年来新发展的原生质体融合技术、体细胞杂交等遗传工程的迅速发展创造了条件。

近二十年来，由于培养的植物细胞在一定条件下所表现的全能性规律，使组织培养技术在生产上的应用得到了重视与发展，已逐渐成为农业、林业、园艺、医药等方面的重要研究手段，并且带动了形态、细胞、生理、生化、遗传育种等一系列学科的进展。

由于分子生物学和生物工程的发展，促使植物组织培养技术日趋完善。60年代后植物组织培养开始在生产上应用，使植物生产走向工厂化的应用时期。花卉及草本植物，用无性繁殖系快速繁殖植株，工厂化生产的试管品种商品化；应用细胞大量培养技术生产药物的方法，已在日本、联邦德国等国家获得成功。总之，植物组织和细胞培养是一项具有很大潜力的新兴的生物技术，将以崭新的面貌投入世界新的产业革命的行列，而展示美好的前程。

目前植物组织和细胞培养技术在植物学等学科的实际应用，主要在两个方面：（1）植物育种与快速繁殖；（2）生理活性物质的生产。

一、植物组织培养的实验设备、灭菌方法和基本培养基

（一）植物组织培养的实验设备

1.实验室的设置

（1）无菌操作室室内有供接种用的净化工作台，放置接种用具和培养物的工作边台，天花板或墙上安装紫外光灯管供灭菌用。如有细菌过滤的通气装置更好。

（2）培养基配制室

用于配制各种培养基，室内须有较大面积的平面工作台以及放置各种化学药剂及器皿的柜架。存放配制好的培养基母液的冰箱，蒸馏水制备及贮存的设备。

（3）恒温培养室

培养室内需要有控制恒温的空气调节器，以及照明装置。恒温室的温度一般保持在25℃左右，温差最好不超过±1℃。

培养室内须有培养架，摇床，转床等培养装置及设备。

（4）细胞学实验室

放置各种显微镜和解剖镜，主要观察培养结果。有条件时可建立摄影设备，摄制实验结果。

（5）化学实验室

置备各种常规和先进的化学分析和测定的仪器设备，进行各种化学分析和测定工作。

2.仪器和用具

（1）玻璃器皿

应用碱性溶解度小的硬质玻璃制成的仪器和器皿，特别是进行长期培养时，如选用非优质玻璃制品，则易发生不良影响。

常用的玻璃器皿有：三角瓶、奶头瓶、T型管、角形培养瓶、圆形培养瓶、L形试管、平行有（无）角试管、圆形扁瓶、培养皿、玻璃环、载玻片、盖玻片、漏斗、分装器、注射器、圆底烧瓶、分液漏斗、玻板、玻璃柱、冷凝器、提取装置、染色缸、酒精灯。

（2）用具和器械

选用医疗器械和微生物实验室使用的器具，如刀、剪、各种镊子、解剖刀、接种针。

（3）仪器和设备

一般需要有天平、酸度计、离心机、显微镜、解剖镜、温箱、烘箱、冰箱、摇床、转床、自旋式培养架、分光光度计、薄层扫描仪、高压液相色谱仪等。

（二）植物组织培养的灭菌方法

1.器皿和培养基的灭菌

培养皿、工作服、口罩、帽子等可用高温消毒，一般用1.2个大气压，20—30分钟；培养基的消毒时间不宜过长，否则有些物质易分解破坏，1.2个大气压，15分钟就足够了。金属器械的消毒，一般于使用前浸泡在70%乙醇中，用时在火焰上点燃消毒冷却后使用。

2.植物材料的灭菌

植物材料的灭菌主要是外部灭菌，须根据材料的种类对杀菌剂的敏感性来选择消毒剂的种类与浓度和处理时间的长短。首先将实验材料在肥皂粉溶液中仔细刷洗并用流水冲洗干净，然后参照表13—1和表13—2所列的方法和顺序进行灭菌。

表13—1 常用灭菌剂效果的比较

表13—2 植物不同器官的灭菌顺序（三）植物组织培养的基本培养基

1.培养基的成分组成

植物组织培养基通常由以下几类物质组成（表13—3）：

表13—3 几种常用培养基的成分组成（单位：mg/l）

（1）无机营养物

无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素除碳（C）、氢（H）、氧（O）外，就是氮（N）。氮通常用硝态氮或铵态氮，但在培养中多用硝态氮，也有将硝态氮与铵态氮混合使用。磷常用磷酸盐，硫常用硫酸盐。钾是主要的阳离子，钙（Ca）、钠（Na）、镁（Mg）的需要量较少。大量元素的配合比率一般都是沿用培养整体植物的Knop溶液的配方修改而成。在一般情况下，营养培养基中至少要含有各为25mmol的硝酸盐和钾。铵的含量超过8mmol时常对培养物有毒害作用；但对常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养，硝酸盐加上铵的浓度可以提高到60mmol。钙、硫、镁的浓度在1—3mmol范围内较为合适。而所需的钠氯化物则由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘（I）、硼（B）、锰（Mn）、锌（Zn）、钼（Mo）、铜（Cu）、钴（Co）和铁（Fe），其中碘可能是不必需的。

（2）碳源和能源

大多数植物细胞对蔗糖的需要范围是2—4%，在有些植物组织培养中，蔗糖的浓度高达7%甚至15%。糖源在培养基中除作为碳源和能源外，可能还有其它作用。蔗糖也能用葡萄糖和果糖来代替，其它的糖类均不够理想。肌醇可能并不是必需的，但在一般培养基中均用了较大的浓度，这可能与它有促进愈伤组织的生长作用有关。

（3）维生素

在各种维生素中，盐酸硫胺素（B1）可能是必需的，而烟酸及盐酸吡哆辛（B6）对生长只有促进作用。

（4）生长调节物质

植物激素是培养基中不可缺少的组成成分，它对植物愈伤组织的诱导、培养生长、器官分化和次生产物的代谢，都有直接的影响。通常加入于培养基中的激素有两类：一是生长素，常用有2，4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等；另一类是细胞分裂素，常用的有激动素（Kt）、玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA）。2，4-D的适宜浓度为10-7—10-5mol，IAA的为10-10—10-5mol，以1—10mg/l为最通用。NAA的适宜浓度范围比前二者均高。在通常情况下，只用2，4-D（10-5—10-7mol）就可以成功地诱导产生愈伤组织。如将2，4-D等生长素物质与一种细胞分裂素配合使用时，其效果会更好。诱导外植体分化植株时，用萘乙酸与一种细胞分裂素配合可能更好。在细胞分裂素中，激动素与6-苄基嘌呤均使用得较普遍，对愈伤组织的生长均有促进作用，其适宜浓度为10-7—10-6mol。

（5）氨基酸

培养基中应包括某些氨基酸，例如甘氨酸。另外像水解酪蛋白也是组织培养中常采用的，它是一种具有多种氨基酸的混合物，特别是在分化培养基中加入一定量的水解酪蛋白，可促进胚胎发生和多胚性出现。一些氨基酸是某些次生物质的前体物（如苯丙氨酸、鸟氨酸等是莨菪类生物碱生物合成的前体物），当它们加入培养基中，会明显地增加这类次生物质在组织培养物中的含量与产量。

（6）有机添加物

一些天然产物加入培养基中，它们对愈伤组织的诱导和维持，以及促进生长和次生物质的形成与积累都是有益的。其中最常用的有椰子乳、酵母提取物、番茄汁、大豆粉等。其使用的浓度范围：椰子乳为10%（体积/体积），酵母提取物为0.5%，番茄汁为5—10%，大豆粉0.1—0.5%。这些天然添加物，由于成分复杂且难保证重复一致，所以在培养基的配制中更倾向于选用完全已知的合成化合物。

2.培养基的制备

（1）水和药品

配制培养基最好使用玻璃容器蒸馏过的去矿质盐的蒸馏水。所用的化学药品应较纯。生长调节物质在用前最好进行重结晶。蛋白质水解物最好用酶水解的，这样可以使氨基酸更好地在自然状态中保存。

（2）母液（贮备液）

配制培养基方便的方法是先制备一系列母液。大量的矿质盐（大量元素）可配成浓于使用浓度的10倍。溶解矿质盐时，力求把Ca2+与SO2-4—和PO3-4错开，以免形成硫酸钙和磷酸钙的不溶物，最好是用一定量蒸馏水将矿质盐分别溶化后，然后按顺序加入，最后加水至一定体积。微量元素由于用量少，可配成使用浓度的100—1000倍浓缩液，与大量元素等贮存于冰箱中。维生素每种分开配制，可按0.2—1mg/l的浓度分别配在容量瓶中贮存。铁盐需单独配制（见前）。植物激素类物质，配制时的要求各有不同。NAA、2，4-D和IAA等生长素类物质，称好药品后先用少量95%乙醇溶化，然后再加蒸馏水稀释至一定浓度；细胞分裂素类物质，则宜先用少量0.5或1N的盐酸来溶解，然后加蒸馏水至所需量；叶酸则应用少量的稀氨水溶解，然后再加蒸馏水至所需量；生物素配制时可直接溶于水。

（3）高压灭菌和保存

配制培养基时，先将各种母液按所需容积分别取出并混合在一起，临时加入蔗糖、激素和其它附加成分，并与预先已加热溶化的琼脂（液体培养则不加琼脂）混合后，用氢氧化钠溶液或1N盐酸调节pH值至要求的一定值（5.5—5.8之间），然后再分别装入培养容器中。制备好的培养基在高压灭菌锅中，120℃，1.1kg/cm2的高压下灭菌15—20min。灭菌后的培养基可在室温下贮存（最适的温度为10℃），并应在两周内应用。

3.几种常用培养基的特点

在不同的培养基中，一般无机盐的变化较大，有时也因加入不同的氮源而形成各自的特点。MS是1962年Murashige，T.和Skoog，F.为培养烟草而设计的培养基，它对在固体培养条件下诱导愈伤组织，在液体培养条件下作细胞悬浮培养及用于胚、茎尖、茎段和花药等培养和形态发生研究方面，均获得了明显的成功。MS培养基中无机养分的数量和比例均较合适，足以满足很多植物细胞在营养上和生理上的需要。故在一般情况下，无需在培养基中加入酪朊水解物、酵母水解物或椰子乳等有机附加成分。与其它培养基相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它显著的特点。与MS培养基相近的，还有LS（Linsmaier，E.M.和Skoog，F.1965）和RM（田中，1964）培养基，它们的基本成分均与MS培养基相同，唯前者去掉了甘氨酸，维生素B6和烟酸，后者把NH4NO3的用量提高到4950mg/l，把KH2PO4提高到510mg/l。与MS培养基相比White（1963）培养基则是一个具有较低浓度无机盐培养基，但它的使用也十分广泛，无论在胚胎培养或一般组织培养上也有很好的效果。B5培养基是Gamborg等（1968）设计的，它的主要特点是含较低的铵，而铵这一营养成分可能对某些生长物有抑制生长的作用。N6培养基是中国科学院植物研究所和黑龙江省农业科学院设计的，也是一个很适用的培养基，目前在国内已广泛用于花药培养及某些植物的组织培养上，其成分与B5相似，但却不含钼。Heller（1953）培养基是欧洲使用得较普遍的一种培养基，它的无机盐含量低，同时还缺乏钼盐，但含有镍铝等化合物。

从总的趋势来看，近代的培养基都倾向于采用高浓度的无机盐。在氮的运用上，不少是采用硝态氮和铵态氮的混合，或只是硝态氮。微量元素的作用研究得较少，大多数配方也基本上接近MS培养基的，而所包含的这些微量元素成分已满足组织培养中愈伤组织和细胞生长的需要。对于铁盐通常则采用FeSO4与Na2-EDTA（螯合剂）的混合物居多。

二、植物组织和细胞培养在药物生产中的应用

近些年来由于自然环境的人为破坏，滥采乱伐，劳力费用上涨及引种野生植物在技术上和（或）经济上的困难，导致植物资源急剧减少，而确保药用植物充分供应的困难日益增加。六十年代以来，人们开始应用植物组织培养技术研究植物药的生产问题。近年来随着现代生物技术的发展，植物细胞大量培养获得成功，为植物药物开辟了一条崭新的工业化生产的新途径。

细胞培养系统比一般整体植物栽培，具有多方面的优越性：（1）有用物质的生产是在可控制的条件下进行，而不必依赖气候和土壤条件，并节省土地；（2）细胞培养无微生物和虫害；（3）生长周期短，缩短植物引种驯化和扩大繁殖的漫长过程；（4）可以进行特定的生物转化反应，可以探索新的合成路线和获得新的有用物质；（5）可以通过筛选新的细胞系，改变培养条件，以提高生产率和减少生产费用。

（一）植物组织和细胞培养技术

1.愈伤组织的诱发和培养

愈伤组织是植物组织和细胞培养的基本材料，所以诱发愈伤组织和进行培养是植物组织和细胞培养的基础性工作之一。

诱发愈伤组织的工作程序大致如下：

（1）植物材料（包括植物种类与部位）的选择；（2）材料的制备与消毒；（3）培养基的选定与制备；（4）接种与培养；（5）继代培养。

目前已经成功地从许多植物诱发出愈伤组织，其中以双子叶植物最多，单子叶植物较少。此外，裸子植物、蕨类和藓类植物也有成功的例子。因此可以说，所有的多细胞植物都有诱发愈伤组织成功的潜在可能性。双子叶植物除有广泛的实用价值外，且它们能够迅速地长出愈伤组织。植物的各种组织，如维管束形成层，贮藏器官的薄壁组织，根的中柱鞘，胚乳、子叶、叶肉组织及维管束组织等，在合适的条件下，都能形成愈伤组织。

愈伤组织的诱发多在固体培养基上进行。固体培养一般在25—28℃进行，每隔4—6周进行一次继代培养。

愈伤组织的培养方式一般可分为固体培养和液体培养两种。固体培养是指向培养基中加入一定量的凝固剂（0.6—1.0%琼脂等），加热溶解后，分别装入培养容器中，冷却后即为固体培养基。而不加凝固剂者则为液体培养基。

固体培养为静置培养，其优点是简便，只需一般玻璃器皿即可，不像液体振荡培养那样需要摇床、转床等复杂的机械设备，且占地少，一间小培养室就可以放置很多培养器皿。但固体培养也存在如下缺点：愈伤组织只有一部分表面和培养基接触，造成愈伤组织生长不均衡；接触培养基的底层组织气体交换不良，同时也使生长过程排出的有害物质堆积；静止放置时，由于重力作用或光线照射不均匀，而使组织出现极化现象，而难得相当一致的群体。

液体培养又分静置和振荡两种。液体静置培养与固体培养一样也是方法简便，且培养液中不会出现营养物质浓度差异现象；但由于使用的局限性较大，故目前已很少采用。振荡培养是使植物组织在液体培养基中不断转动，从而可以消除静置培养中的缺点。振荡培养又可分为两类：（1）连续浸没的，通过搅动或振动培养液的方法使组织悬浮于培养基中，常用摇床进行培养；（2）定期浸没的，用T型管，乳头瓶作培养容器，在转床上进行培养。在转动过程中培养材料在液相和气相中重复出现。

2.细胞悬浮培养

植物细胞悬浮培养技术是由愈伤组织的液体培养技术基础上发展起来的一种新的培养技术。近二十多年来，从试管悬浮培养发展到大容积发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养，直到近年来最新型的浊度恒定法和化学恒定法等自动控制的较大规模的连续培养。细胞悬浮培养的特点是：（1）能大量提供均匀的植物细胞；（2）细胞增殖的速度比愈伤组织快；（3）适合于大规模培养。因此有可能把植物细胞如同微生物一样来培养，应用于发酵工业中来，生产一些植物特有的产物，从而开辟一条工业化生产植物产品的新途径。细胞悬浮培养是使游离的植物细胞在液体培养基中进行培养，但是因为植物细胞具有聚集在一起的特性，故直到目前为止，还不能使悬浮液中只有游离的单细胞，而往往是一些小的细胞团。

（1）悬浮培养的设备和装置

①摇床 广泛地用于植物细胞悬浮培养中。易于碎裂的愈伤组织块，经摇床的连续振荡可以得到分散的细胞悬浮液。也可用于悬浮细胞的继代培养。

②转床 每分钟一转。用T型管或奶头瓶作为培养容器。

③自旋式培养架 可用较大的瓶作为培养容器。

④连续培养设备 通常依靠通入无菌的压缩空气或既通入空气又不断搅拌的方法，使细胞一直处于悬浮状态。在这样的搅动装置中，由于盛放培养液的容器是静止的，故能容易地把贮存新鲜培养液的容器，空气补给装置等和培养容器连接起来。培养容器内可安装一些蛇形管，管内放入电热丝就可加热，通入冷水就可降温，因此这类装置不必安装于恒温室内。这类装置一般都有能够简便控制温度，搅拌速度，通气速度，照明强度，营养液流入速度等的装置，而且还常与氧电极，pH电极，细胞密度测定器等联接起来，成为一套初步自动控制的连续培养装置。几种植物细胞大量培养装置有用搅拌的发酵装置，用振荡器的发酵装置，利用导管及旋转叶轮的发酵装置，气泡搅动的发酵装置和气升式发酵装置等。

（2）悬浮细胞的培养基

常用的适合愈伤组织的培养基，不一定对细胞悬浮培养也最合适。通常诱发愈伤组织的培养基可以作为确定最适培养基的出发点。特别需要注意生长素类和细胞激动素类的用量对悬浮培养细胞聚集性的影响，必须选用使细胞易于单一游离的培养基。

在悬浮培养时pH常有相当大的变动，因此必须加入EDTA等螯合剂使铁和其他离子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间比例的调整也可作为稳定pH的一种方法。加入一些固态缓冲物，如微溶的磷酸氢钙、不溶的磷酸钙、碳酸钙也是稳定pH的一种方法。

（3）悬浮细胞的继代培养

悬浮培养过程中，细胞数目增长的变化情况见图13—1。基本上是一条S形曲线。一开始是延迟期，细胞很少分裂；接着是对数生长期，细胞数目迅速增长，增长速率保持不变；以后进入逐渐减慢的静止期；最后达到增长完全停止期。细胞在培养中，一般在静止期之初进行继代培养，有的在静止期之前增殖减慢时即需传代，有的甚至在对数生长期末立即传代，以求加速细胞增殖。

图13—1 悬浮培养细胞在一个培养世代中细胞数的增长情况示意图

近年研究采用DNA合成抑制剂和植物激素处理法等，使培养中的细胞在一定条件下，进入细胞分裂周期的某一个时期（如G期），然后从下一个时期开始，使大部分细胞或全部细胞同步分裂，即所谓同步培养。这样不仅可以详细了解细胞周期的真实过程，还可以认识控制着从亲代细胞到子代细胞过程中生化变化序列的因素。由于同步培养可以频繁地取样进行生化学和细胞学的分析，取样量可以较大，并且不会影响到剩下来的群体继续生长，这样对研究细胞周期、细胞分化、次生物质代谢等重要过程提供了必要的技术手段，是植物细胞培养技术发展中的又一重要进展。

综上所述，目前植物组织和细胞培养技术已从静止的固体培养发展到液体培养，其特点是可以使培养中的组织和细胞的养分和供氧情况得到改善。在规模和方法上正沿着从小量到大量，在应用上从试管到大罐和同步培养，在操作上从手工到自动化方向发展。这些进步和发展对植物组织和细胞培养的研究和生产应用产生重大的影响。

（二）植物组织和细胞培养产生的药物成分

自1950年Bonner等对用银胶菊愈伤组织产生天然橡胶进行研究以来，许多科学工作者围绕着愈伤组织能产生哪些有用物质，如何提高有效成分得率等问题，进行了大量的工作，并取得了一些成果。越来越多的人认为利用植物组织和培养细胞有可能生产用于治疗各种疾病的生物碱、萜烯类、醌类、固醇类、酶等，以及从培养物中提取肽类和蛋白质物质。Nickell（1980）概括介绍了植物组织培养能产生50余类化合物及其中28类潜在的产品。郑光植（1980）综述列表举出药用成分，来源植物与药物含量共60多条。日本协和发酵公司的见泽（Misawa，M.，1980）介绍了由工业实验室或政府进行的，通过植物组织培养产生生物碱，固醇类、萜类、醌类和其他生理活性物质包括酶等的研究成果。据世界卫生组织公布，从高等植物提取的最普通而又必不可少的药物有17种。其中11种药物的来源植物已有组织培养（表13—4）。

表13—4 来源于高等植物的普通而又不可少的药物

1.生物碱

利用植物组织和细胞培养生产生物碱是格外地困难，然而产生生物碱的药用植物的组织培养是研究得最多的一个方面（表13—5）。但其含量通常比原植物低。

表13—5 植物愈伤组织中的生物碱

表13—5 植物愈伤组织中的生物碱（续）-1

（1）莨菪烷生物碱

Mothes、West、Chan、Metz、木岛正夫、Bhandary、Thomas、Stohs、Sairam、Tabata、Hiraoka、Cliokshi等先后对曼陀罗、颠茄、天仙子、莨菪等的根、愈伤组织、悬浮细胞进行了大量的研究，但药用目的物没有或含量很低。West（1957）首先肯定了颠茄根的愈伤组织中存在莨菪烷生物碱。检查到根愈伤组织中阿托品含量为0.47—0.53%。但茎叶的愈伤组织中未检查到。Chan等（1956）将曼陀罗、柏叶曼陀罗、无毒曼陀罗的各类器官诱导出的愈伤组织，进行静置培养与振荡培养，测定愈伤组织中生物碱含量。其中以曼陀罗和无刺曼陀罗种子愈伤组织中含量最高，达0.016—0.056%，根为0.012—0.015%，茎为0.004—0.014%，叶为0.007—0.010%。此结果表示因诱发愈伤组织的器官不同，生成生物碱的量亦有差异。West等还指出同一起源的曼陀罗的愈伤组织株之间，在合成生物碱的能力上也有差异。郑光植等（1976）在三分三愈伤组织培养中，最初测定莨菪碱含量为0.025%、东莨菪碱的含量为0.009%，均低于原植物（分别为0.127%和0.016%）。但因改良培养条件、增加营养、改变生长调节剂、补充前体物等各方面的研究，使两种生物碱的含量总共达0.554%（原植物为0.139%），其中东莨菪碱最高含量达0.495%（茎为0.016%），比最初愈伤组织的含量高4—4.5倍。程克棣等（1987）研究结果表明山莨菪等细胞不仅能产生托品类生物碱，还能将莨菪碱转化为山莨菪碱和东莨菪碱。

（2）吡啶生物碱

在产生吡啶生物碱的组织培养研究中，烟草研究得最早最多。早在1948年Dawson就对烟草中生物碱的生物合成进行了研究，他的1960年的报道粘毛烟草的组织培养中，烟碱的含量在最初阶段急剧减少，当成典型的愈伤组织时，就没有烟碱了。但Speake等（1964）证明，烟草（Virginia品种）根、茎、叶的

13， 简述植物组织培养技术的应用意义？

1、通过有茎尖培养脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等实现商业化的脱毒试管苗生产。2、省种，用试管苗进行植物栽培可节省大量种子。3、快速繁殖新品种, 防止品种退化。4、保护生态环境、挽救濒危植物。5、通过组织培养手段增加遗传变异性来改良作物, 已成为一条育种新途径。6、植物胚培养是采用人工的方法在无菌条件下从种子中将成熟胚和未成熟胚分离出来, 然后放在人工合成的培养基上培养, 使它发育成正常的植株, 从而有效地克服远缘杂交不实的障碍, 获得杂种植株。7、用单细胞培养的方法诱导单细胞突变, 筛选需要的突变体培养成植株, 经有性繁殖使遗传性状稳定下来。8、利用植物组织培养进行体细胞杂交育种。9、利用植物组织培养技术建立植物的遗传再生体系。10、植物组织培养能产生很多种药物, 主要有苷类、生物碱、固醇类、醌类、黄酮类、蛋白质及其它生理活性物质。利用细胞培养的方法, 可以获得次生代谢产物, 如色素、紫杉醇、人参皂甙、生物碱、萜内酯等。11、利用组织培养保存植物种质资源。

植物细胞工程可以利用组织培养技术丰富药用植物的有效成分吗

可以。植物组织培养是一种利用植物细胞、组织或器官，在特定的培养基中，以体外培养的方式，获得植物细胞，从而获得有效成分。因此植物细胞工程可以利用组织培养技术丰富药用植物的有效成分。细胞（英文名：cell）并没有统一的定义。

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