猪链球菌的分离与鉴定

猪链球菌的分离与鉴定

作者：朱凤才 杨华富 胡晓杼 汪华 王广和 宋亚军 杨瑞馥

2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。

关键词：猪链球菌 分离与鉴定

论文完成日期：2000年6月15日

目 录

摘要………………………………………………1

前言………………………………………………2

1.试验材料……………………………………….2

2.方法…………………………………………….2

2.1病原分离……………………………………..2

2.2分离菌株的鉴定……………………………..2

2.3致病力及保护力试验………………………..3

2.4药敏试验……………………………………..3

3.结果…………………………………………….4

3.1分离菌的培养特性及形态特征….………….4

3.2生化试验结果………………………………..5

3.3血清学鉴定结果……………………………..5

3.4致病力试验及保护力试验结果……………..5

3.5细菌回收试验结果…………………………..5

3.6药敏试验结果………………………………..5

4分析与讨论…………………………………….6

参考文献…………………………………………7

猪链球菌的分离与鉴定

摘 要

2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。

关键词：猪链球菌 分离鉴定

前 言

猪链球菌（Streptococcosis suis）是猪的一种重要疾病，养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有本病发生。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。

猪链球菌截止到目前已发现的荚膜型已超过30种[1]。我国于1995年首例鉴定证实2型猪链球菌在我国的存在[2]。猪链球菌可致2—6周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等[3-7]。病猪和带菌猪是本病的重要传染源，病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节内均可检出病原体。未经无害处理的病死猪肉、内脏及废弃物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要传播途径。本病一年四季均可发生，但以4—10月份发生较多。本病常为地方性流行性，多呈败血性。短期波及全群，如不进行防治，则发病率、病死率很高，慢性常为地方性散发性传染。

2000年4月，岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎及败血症，多为2—6周龄仔猪。无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为2型猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。

1． 实验材料

1．1病料 无菌采取岐山县种猪繁育场患关节炎病猪的关节液8份，编号为1—8号，无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结8份，编号为9—16号。

1．2试剂 试验所用的各种糖均购自上海化学试剂二厂，批号自95—98年不等。

1．3培养基 绵羊鲜血平板、匹克氏增菌液、10ml/L猪血清肉汤及各种糖培养基按常规方法制备[8]。

1．4血清学试验 猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原均购自中国兽药鉴察所，批号为990705。

1．5药敏纸片 购自浙江省军区后勤部，批号20000312。

1．6试验动物 健康小白鼠（30—35g）50只，购自第四军医大学实验动物中心。

2． 方法

2．1病原分离

将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后，分别接种鲜血琼脂平板。37℃需氧培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种血清肉汤，纯化后放置4℃，冷藏备用。

2．2分离菌株的鉴定

2．2．1生化试验

随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别接种于蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠培养基，37℃培养24h后，观察其对糖的利用情况。

2．2．2血清学鉴定

将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用Ph7.2的0.01mol/L PBS制成1*1010~2*1010细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。

2．3致病力及保护力试验

2．3．1菌落形成单位的测定 按常规方法进行[9]

2．3．2致病力试验

无菌吸取上述血清肉汤培养物（含菌量5.0*108CFU/ml）以0.1ml/只、0.2ml/只、0.3ml/只、0.4ml/只、0.5ml/只分别腹腔注射小白鼠2只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7组。第一组，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二组每只注射8#菌0.2ml，第三组每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四组每只注射13#菌0.2ml，第五组每只注射15#菌0.2ml，第六组每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七组每只注射无菌血清肉汤1.0ml。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。

2．3．3保护力试验

将3#、8#、13#、15#血清肉汤培养物分别接种于18cm鲜血平板。37℃培养24h后，收菌，用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用0.3%甲醛灭活；37℃作用24h；作无菌检验。然后分别腹部皮下接种小白鼠2只，0.4ml/只。10天后，再分别人工感染，0.2ml/只。

2．3．4细菌回收试验

对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。

2．4药敏试验

采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20—24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药。结果评定参照表1。

表1各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准

抗菌药物名称

抑菌圈直径（mm）

耐药

中度敏感

高度敏感

青霉素

土霉素

洁霉素

链霉素

庆大霉素

卡那霉素

头孢菌素

10~12

10~14

10~14

10~14

13~14

13~14

10~15

>13

>15

>15

>15

>15

>15

>15

3．结果

3．1分离细菌的培养特性及形态特征

3．1．1培养特性

37℃培养24h后，所采的12份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

3．1．2染色特性

关节液、鲜血琼脂、匹克氏增菌液及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状。

3．2生化试验结果（见表2）

表2分离菌生化试验结果

鉴定 蔗糖 山梨 棉实 葡萄 甘露 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨 马尿

项目 醇 糖 糖 糖 苷 酸钠

3#+--++++++-

8#+--++++++-

13#+--++++++-

15#+--++++++-

判定标准：“+”表示大多数（90%—100%）菌株为阳性；“-”表示大多数（90%—100%）菌株为阴性。

表2表明分离的3#、8#、13#、15#菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。

3．3血清学鉴定结果

将3#、8#、13#、15#细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。

3．4致病力试验结果及保护力试验结果

3．4．1致病力试验结果

第一组、第二组小白鼠注射血清肉汤培养物48h内均未见死亡，第三组48h内有一只死亡，第四组、第五组、第六组在注射血清肉汤培养物18h内全部死亡。死亡后，小白鼠皮肤发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。第七组健活。由于第一、二、三组死亡数量非常少，所以，再用相同剂量分别背部皮下接种小白鼠各2只，48h后处死，剖检发现注射部位有直径0.9~1.1cm的脓肿，浓汁呈黄绿色。

3．4．2保护力试验结果 免疫的小白鼠再经攻毒后均未发病。

3．5细菌回收试验结果

将上述死亡及发病的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离、生化试验及血清学鉴定，能得到原分离菌。

3．6药敏试验结果（见表3）

表3药敏试验结果

菌号

抑菌环直径（mm）

头孢菌素 青霉素 洁霉素 卡那霉素 土霉素 链霉素 庆大霉素

3#19151413877

8#18161313867

13#19161413778

15#19151314888

平均值18.7515.513.513.257.757.07.5

表3表明，结果敏感的药物依次是：头孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是：洁霉素和卡那霉素；而对土霉素、链霉素、庆大霉素具有抗药性。

4．分析与讨论

4．1猪链球菌（Streptoccus suts）是危害养猪业的一种重要病原菌。80年代初，加拿大由猪链球菌引起的疾病开始增加。那时仅检出9种夹膜血清型，其中2型是最常见的。

4．2猪链球菌病在临床上有败血型、脑膜脑炎型、关节炎型支气管炎型等。过去屡有败血型猪链球菌的报道，而关于集约化养猪场关节炎型链球菌病的报道较少。本次试验从患关节炎猪的关节液中成功的分离出了猪链球菌。另外，岐山种猪场，约有60%的仔猪流行关节炎，严重者可发生败血症而死亡，给种猪场造成巨大的经济损失。所以，研究本病可为生产中防制本病提供理论依据。

4．3病猪和带菌猪是本病的重要传染源。病猪的鼻液、尿液、肌肉、内脏和关节内均带有病原体，所以，我们建议，首先应加强对健康猪的免疫。另一方面，在发病后，加强病猪和健康猪的隔离，根据实验室所做的药敏试验结果，配合药物治疗，建议用头孢菌素、青霉素、洁霉素等药物治疗。岐山县种猪繁育场采纳我们的建议后，首先对所有的未发病仔猪用灭活疫苗免疫接种，对已发病的猪用青霉素等药物配合治疗。另外，注意卫生管理。目前该病已得到有效的控制。

4．4从致病力试验结果可以看出，引起猪关节炎的猪链球菌的致病力较小，而引起败血症的猪链球菌的致病力较强。但通过生化试验和血清学鉴定，它们又是同种细菌且血清型也相同。为什么同种血清型的猪链球菌的致病力差别很大？这个问题还有待于进一步研究。

参考文献

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[1]杨本升，刘玉斌，苟仕金等． 动物微生物学． 吉林科学技术出版社，1995

[2]张庚华．猪链球菌感染最新研究进展．国外兽医学—畜禽疾病，1995，16（2）：31

[3]黄毓茂,黄引贤．2型猪链球菌的血清学鉴定．中国兽医学报，1995，15（1）：63—65

[4]Gottschalk M.J Clin Microbiol，1989，27：2633—2636

[5]Higgins R et al．Can J vet Res，1990，54：170—173

[6]Sanford S E.JAVMA，1982，181：673—676

[7]Wiadsor.Vet Rec，1977，101：378—379

[8]李健强.兽医微生物学实验与实习指导．西北农业大学，1996

[9]张彦明，贾靖国，刘安典．动物性食品卫生检验技术．西北大学出版社，1996

[10]蔡宝祥．家畜传染病学．北京，中国农业出版社，1998

[11]甘肃农业大学主编，兽医微生物学．北京，中国农业出版社，1982

[12]刘荣标．兽医微生物学（上）．台北，艺轩图书出版社，中华民中73年

[13]郑明球．家畜传染病学实验指导．北京，中国农业出版社，1999

[14]甘肃农业大学主编．兽医微生物学（第二版）．中国农业出版社，1998

[15]郝天斌，陈雨田．猪非溶血性关节炎型链球菌病的诊治．中国兽医科技．1999，29（3）：34—35

[16]陈书琨，林庆燕．猪链球菌生化突变株的分离与鉴定

[17]汪诚天，叶祝年，一支方等．兽医实验手册．上海科学技术出版社，1984

猪链球菌病治疗方案

　　应用抗菌类药物治疗有效。当分离出致病链球菌后，应立即进行药敏试验。根据试验结果，选出具有特效作用的药物进行全身治疗。可以选用青霉素、新霉素、氨苄青霉素、盐酸林可霉素、卡那霉素以及磺胺类药物进行治疗。与此同时，饲料和饮水中添加维生素A、维生素K等，适当降低养殖密度，改善饲养环境，加强饲养管理可促进本病的治疗效果。

　　1．败血型全身疗法 对败血症型及脑膜炎型，采用抗败血性休克疗法，应早期大剂量使用抗生素或磺胺类药物，还应采用对症疗法，补充营养，如投予葡萄糖、电解质、维地塞米松等。

　　（1）初发病猪每头每次用青霉素或氨苄青霉素80-180万国际单位，链霉素lg混合肌注，连用3-5d：也可用先锋霉素Ⅵ。

　　（2）高热的重症猪可用较大剂量阿莫西林的氨基比林稀释后一侧注射，另一侧注射复方磺胺五甲氧嘧啶。按使用说明中规定的剂量首次加倍，每天两次，直至症状消失。

　　（3）加倍量青霉素肌注，每4-6hl次，连用3d。对危重病猪，首先肌肉注射医用青霉素G钠盐160万国际单位，30min后再静脉滴人5%葡萄糖盐水注射液200-500mL+医用青霉素G钠盐1 60万国际单位?(4-8)支，1日1次；同时按每4- 6hl次肌注医用青霉素G钠盐160万国际单位?(4-8)支，连用3日后每日肌注两次直至痊愈，可取得显著疗效。因败血型常发生肺炎、心内膜炎、脑膜炎等使病程拖长，治疗时间延长，故应作好对症疗法和加强护理工作，适时防止继发感染，选用支原净、氟苯尼考、强力霉素、乙基环丙沙星等敏感药物。

　　（4）复方磺胺嘧啶钠肌肉注射，首次用药加倍，1日2次，连用4-5d。复方敌菌净拌料对出现神经症状的病猪有一定的疗效。

　　2．脑膜炎型全身疗法 除可用磺胺嘧啶等药外，还可用林可霉素肌注，连用3-5d；或红霉素缓慢静注，1日2次，连用3 - 5d，同时可注山梨醇防止脑水肿。

　　3．淋巴结脓肿型局部治疗 先将皮肤、关节及脐部等处的局部溃烂组织剥离，脓肿应予切开，清除脓汁，用3%双氧水或1%高锰酸钾溶液清洗和消毒。然后用抗生素或磺胺类药物（悬液、软膏或粉剂）置入患处，必要时可施以包扎。

猪链球菌病的专家观点

1. 人感染猪链球菌病是一种严重的疾病，严重病例病情进展非常快，如果诊断、治疗不及时，预后较差，病死率极高，所以一旦怀疑此病，应该到有细菌培养条件的医院接受诊断和治疗，并积极做血培养和有关分泌物培 养，分离并原菌，以便得到准确的诊断治疗。
2. 人感染猪链球菌病是可治之病，早期发现，治疗及时非常重要。
3. 对于高危人群如屠夫、屠场工人或吃了不洁的凉拌病/死猪肉或吃生的猪肉丸子、洗切加工处理病/死猪肉的人，出现畏寒、发热等应该及时到医院接受检查和治疗，以免延误诊断和治疗。

如何防治猪链球菌病？

（1）治疗 对病猪进行隔离治疗。如已分离出病原菌，最好通过药敏试验，选用最有效的抗菌药物治疗；如尚未分离出病原菌，疑似本病时，采用对革兰氏阳性菌有效的抗生素治疗，如青霉素、金霉素等。中药治疗：生石膏300～500克，细生地30～60克，水牛角15～30克，川黄连30～60克，栀子15～30克，桔梗9～24克，黄芩15～30克，知母15～30克，赤芍15～30克，玄参15～30克，连翘15～45克，甘草9～24克，丹皮15～45克，鲜竹叶15～30克。水煎，1剂/天，分2～3次胃管投服，连服3～6天。同时配合解热类药物及抗生素治疗。

（2）免疫预防 在疫区或疫场，可用死菌苗或弱毒苗进行免疫预防。每吨饲料中加入土霉素400克，连喂2周，有一定预防效果。对刚产出的仔猪注意脐带的消毒，防止脐带感染。带菌母猪为主要传染源，应进行及时治疗，并及时淘汰无经济价值的母猪。

试分析发生猪链球菌病的因素有哪些

猪链球菌病的类型及防治

　　冬季天气寒冷，养殖场应警惕链球菌病流行爆发，避免给养猪场带来不必要的经济损失。猪链球菌病是一种急性、热性、败血性传染病，主要分为以下类型。
　　疫病类型

　　急性败血症型一般发生在流行初期，突然发病，往往还未见任何症状就死亡，体温升至41℃~42℃，在数小时至1天内死亡。精神委顿，腹下有紫红色斑。
　　脑膜炎型多发于哺乳仔猪和保育仔猪，发病初期，患猪体温升高，食欲废绝，便秘，有浆液性或粘液性鼻液，继而出现神经症状，转圈，空嚼，磨牙，直至后躯麻痹，共济失调，侧卧于地，四肢作游泳状，颈部僵直，角弓反张，甚至昏迷死亡。部分猪出现多发性关节炎、关节肿大，病程1~2天。
　　关节炎型多发生于小猪，关节肿大，跛行，卧地不起。病猪精神沉郁，食欲减退。体温升高到41℃以上，呈稽留热，呼吸促迫，心跳增速，粪便干燥，有的呈算盘子状，粪便表面常有粘液。后由一肢变为两肢疼痛。病猪耳部、胸部、腹部出现紫斑。
　　化脓性淋巴结炎型病猪淋巴结肿胀、坚硬、有热痛感，采食、咀嚼、吞咽和呼吸较为困难，多见于颌下淋巴结化脓性炎症，咽喉、耳下、颈部等淋巴结也可发生。病程为3~5个星期，病猪经治疗后，肿胀部分中央变软，皮肤坏死，破溃流脓，并逐渐痊愈。该病需通过实验室检验出猪链球菌方可确诊。
　　防治措施

　　预防措施发病后全场立即进行普查，隔离病猪，减少传播；对有脓肿，尿囊积液，后肢麻痹，瘫痪的病猪予以淘汰，实行独立防疫体系，可避免人员相互流动和生猪相互接触传播。
　　加强饲养管理加强通风换气，每栏宜养6~8头猪。加强卫生，尿粪分离，栏杆清洁。若免疫不及时或免疫失败发生链球菌病时，同群健康猪应立即接种链球菌病疫苗实行紧急预防，全场每周一次大消毒，消毒后在猪舍内喷洒护舍安，使舍内有益菌大量增殖，减少病原传播。
　　定期添加营养物质在饮水中交替添加优乐舒等，以增强生猪的免疫力和减少应激。
　　切断传播途径引种时，首先在隔离场饲养45天，经观察、检测确认该猪无病后回本场饲养。回场后在场区隔离场再饲养45天，实行仔猪早期免疫技术，即3~5日龄口服4头份猪链球菌病疫苗进行首次免疫，50~60日龄肌注2头份进行加强免疫以防止免疫失败。
　　免疫失败主要有2个因素：一是免疫给药期间使用抗菌药或饲喂含抗菌素的饲料，杀伤了部分抗原；二是免疫剂量不够。所以，在使用链球菌病疫苗的前后10天共20天内，不能使用抗菌药和含抗菌素的饲料。免疫前后10天添加1%的促免1号，增强疫苗免疫水平。
　　药物治疗对发病猪治疗首选药物是氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林和头孢噻呋，肌肉注射，每天3次，连用2天；5%葡萄糖溶液500毫升、维生素C注射液10毫升，静脉注射，每天2次，连用2天。对出现跛行症状猪，可配合使用镇痛药物治疗；对出现高热猪，应配合使用解热镇痛药物；对淋巴结脓肿猪，待脓肿成熟变软后，及时切开，排出脓汁，用0.1%高锰酸钾液冲洗后，涂上碘酊，配合注射青霉素等抗菌药物，短期内避免用水冲洗，以防感染。

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