蛋白激酶A对NHE3的急性调节需多蛋白信号复合体参与

蛋白激酶A对NHE3的急性调节需多蛋白信号复合体参与

美国马里兰大学医学院的Edward J.Weinman博士及其同事就蛋白激酶A对NHE3的急性调节过程进行了研究。

有关成纤维细胞的生物化学和细胞学实验已证实，在Na+/H+交换蛋白3（NHE3）活性的抑制过程和cAMP介导的磷酸化作用中，需要含PDZ基序的Na+/H+交换蛋白调节因子家族（NHERF和NHERF2）中一个成员的参与。

NHERF通过支架蛋白ezrin与肌动蛋白细胞骨架相互作用，以识别浆膜上的一种多蛋白信号复合体。最新的实验研究均集中于该模型的各个要素上。

首先，应用特异性的抗体研究发现，NHERF定位于肾近端小管，而且与ezrin和NHE3位于同一部位。NHERF2见于肾小球、肾血管系统和集合管细胞，与ROMK位置相同。这种肾单位内的不同分布表明NHERF和NHERF2具有不同的生理学作用。

其次，成纤维细胞中NHE3蛋白激酶A调节的信号复合体模型已延伸到上皮细胞。这一结果是通过建立显性-阴性负鼠肾细胞系得出的。该细胞系表达ezrin结合结构域缺陷的NHERF截短体。初步研究表明这些细胞具有正常的基底侧Na+/H+交换蛋白活性，但对cAMP的抑制反应较为迟钝。

第三，生物化学、生物物理学和细胞实验已表明，NHERF自身以头对头构型相结合，因而存在这样的可能性，即该二聚体可改变活化型NHERF的可用性。

NHERF蛋白在肾脏中的潜在作用通过近年的研究已逐渐扩大，它们涉及了许多其它转运体、受体和信号蛋白的膜定位、聚集、分选和调节作用。

研究人员认为，NHERF和相关含PDZ基序的蛋白在肾脏转运体的调节过程中可能发挥着适配器的作用。

G0期细胞的重新增殖【Gβ类似蛋白－WDR26对细胞增殖的影响】

　　摘　要：WD40重复序列蛋白是一类结构保守、功能复杂的蛋白。关于此类蛋白和细胞内信号传导途径的研究显示，该家族成员很可能通过调控胞内信号转导而影响细胞基本生命活动。在此前的研究中，我们报道了一个新基因WD40 repeatprotein 26的克隆。其初步研究结果显示WDR26蛋白与MAPK信号途径的负调控相关。在最近的研究中，我们构建了稳定转染pCMV－WDR26表达载体的HeLa细胞系，结果显示WDR26蛋白在HeLa细胞系中的过度表达，能够促进细胞分裂，加快细胞的倍增速度。因此，WDR26很可能具有通过MAPK信号途径调节细胞增殖的功能。
　　关键词：WDR26蛋白；MAPK信号途径；细胞增殖
　　中图分类号：Q753
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2006)02－0123－05
　　WD40重复序列蛋白(WDR)家族的成员广泛地存在于真核生物中，其中研究最为深入的是G蛋白的β亚基(Cβ)。此类蛋白以4～16个保守的WD重复序列为家族结构标志。一个典型的WD重复序列由大约40个氨基酸组成，包括氨基端的GH、羧基端的WD和以Trp-Aspmotif为核心的中间序列。结构分析说明，该家族成员具有保守的序列及空间结构，WD40蛋白质家族之所以广受关注，不仅因为引人注目的保守性空间结构，而且因为这一庞大家族所具有的异乎寻常的功能多样性――其成员在真核生物中广泛存在，影响着细胞生命活动的方方面面。参与信号传导过程的WDR蛋白，除了研究得最为详尽的Gβ外，还有磷酸化酶亚基、蛋白激酶C的锚定蛋白以及多个信号途径的调控因子，如hPIP2等。在RNA合成过程中，一些WDR蛋白是snRNP颗粒的组成部分。而作为转录调控因子的WDR蛋白则包括TATA-box结合复合体的TFIID亚单位。此外该家族成员还涉及从细胞骨架构建、纺锤体组装、小泡形成和运输，到细胞分裂的调控及霉菌中硫代谢的调控等细胞生命活动。
　　在此之前，我们报道过关于WDR家族一个新成员WD40 repeat protein 26(WDR26)的初步研究工作。其结果显示WDR26蛋白具有高度进化保守性。该蛋白包含5个WD40重复序列，与该家族成员――PAK抑制蛋白hPIP1具有相似的蛋白结构。表达分析说明WDR26在成体和胚胎期的多数组织中都有表达，因此很可能与多类细胞的基本生命活动相关。而进一步的转录激活活性分析显示，该蛋白能够抑制有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)信号途径的效应因子――SRE和Elk－1的转录活性，很有可能对MAPK信号途径起到负调控作用。
　　MAPK信号途径是细胞信号传导过程的重要组成部分。目前的研究表明，MAPK将G蛋白耦联的受体等膜转导蛋白与其细胞内的关键调控靶蛋白联系起来，从而介导胞外的多种信号，如胰岛素信号、表皮生长因子等，并将这些信号级联放大后传递给相应的下游因子，通过激活包括SRE、ELK-1、c-Jun、c-fos、MEF2、ATF2，等在内的多种转录因子，最终开启细胞特定功能基因的表达，从而调控细胞的生存及对外界的适应能力。在对细胞增殖的调节中，MAPK表现出正负两方面的调节活性。ERKl／2可通过氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ(一个嘧啶合成限速酶)的磷酸化作用来刺激DNA的合成。此外，ERK很有可能通过一些MAP―KAPK，如细胞周期抑制性激酶MYTl，来促进细胞周期进程。同时也可以通过激活蛋白激酶p90Rsk使减数分裂细胞停留在分裂Ⅱ中期。ERK还可以通过激活APl活性，诱导产生细胞周期蛋白D1，从而间接刺激细胞增殖。
　　基于WD40家族的保守性结构特征，其家族成员(如C蛋白β亚基，hPIPl)的重要生物学功能，以及此前研究结果所揭示WDR26的基本特性以及它与MAPK信号途径的潜在关系，我们相信该蛋白在细胞的基本生命活动中起着重要的调控作用。因此，在本文中我们进一步分析WDR26对于细胞增殖过程的影响。
　　
　　1　材料和方法
　　1．1　细胞培养、细胞生长计数与流式细胞仪分析
　　生物安全柜及CO2培养箱(37℃／5％ CO2)均购自Forma公司。含氨苄青霉素(100mg／L)(BBl)和链霉素(100mg／L)(BBl)以及10％胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM培养基(GIBICBRL)，PBS(GIBIC BRL)，胰酶(0．05％)(GIBICBRL)，G418(Clontech)等分别用去离子水配制并按相应要求灭菌或滤菌。细胞复苏、接种、传代、冻存均按常规操作进行。
　　将HeLa细胞接种于DMEM培养基(无抗生素，无胎牛血清)的10cm细胞培养皿中，培养过夜。使用磷酸钙转染方法进行pCMV-WDR26以及对照质粒pCMV(均为10μg)的转染。将100μL2．5mol／LCaCl2与25μg质粒DNA在室温下混合；用移液器将等体积的2×HEPES盐溶液吹打起泡后，将以上2×钙-DNA溶液逐滴加入，静置1min；将磷酸钙－DNA悬液转移至上述单层细胞的培养基中，培养过夜。除去培养基，用1×PBS洗细胞两次，更换含氨苄青霉素和链霉素以及10％胎牛血清的DMEM培养基，并使用300、200、100mg／L的梯度浓度进行G418的筛选，3d更换一次培养基。稳定转染pCMV-WDR26的HeLa细胞，使用含100mg／L浓度G418的DMEM培养基维持，实验时接种于24孔板(每孔1×104个细胞)，分别于接种后48、72、96、120h将细胞用胰酶消化，并按1：10或者1：100稀释后进行细胞数目计数。使用标准细胞计数板，每次计算10个方格的细胞总数×1000二细胞数目／mL。每次计数取3个样品，重复实验3次，取平均值，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。
　　按照上述方法接种稳定转染pCMV-WDR26的HeLa细胞系于6孔板，每孔1×106个细胞，培养过夜后将细胞用胰酶消化法收获，并离心后进行流式细胞仪分析。
　　1．2 抗原簇的位点分析与抗体的制备及纯化
　　WDR26抗原簇位点分析使用DNAstar软件进行。将0．8mg抗原肽溶于0．5mL生理盐水中，先与弗氏佐剂(购自Sigma公司)在注射器中推成乳剂(1：1)，在第1d和第3d分别对新西兰大白兔(购自中南大学湘雅医学院)进行背部皮下免疫注射，分散10～20个点；在第28d再将溶于0．5mL生理盐水中的0．8g抗原肽与非完全弗氏佐剂(购自Sigma公司)在注射器中推成乳剂(1：1)，第3次进行背部肌肉多点注射，第30天取血。兔血放在4℃冰箱中静置过夜，以3 000r／min离心10本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文min，取血清分装保存于－80℃下。通过印记亲和吸附法纯化抗体。
　　1．3 Western Blotting
　　收获一个10cm细胞培养皿(细胞密度80％)中的细胞，使用MRCgene公司的试剂盒一次性制备蛋白质、DNA和RNA(操作步骤按公司说明进行)。蛋白质浓度测定按照Bradford方法进行。
　　按照标准程序制备10％SDS―聚丙烯酰胺凝胶，取10μL(50／xg)蛋白样品溶液，用等体积的2μSDS凝胶加样缓冲液稀释，95℃水浴3min，以使蛋白质变性，按顺序用微量注射器点样，接通电源，恒压96V电泳，溴酚蓝跑过积层胶后，恒定电压150V。直到溴酚蓝迁移到距胶的底部1cm处时，即停止电泳。
　　PVDF膜(购自Millipore公司)依次用甲醇预处理15s，去离子水浸润5min，转膜缓冲液浸润5～10min。使用半干电转法(北京六一仪器厂，DYCP-40C)把蛋白质转到PVDF膜上，稳流80mA(2．5 mA／cm2)，电转1．5～2．0h．凝胶经考马斯亮蓝染色，膜经1×丽春红染色，以确认转膜效果。在膜上作好标记后，用TBST漂洗数次，除去丽春红。
　　实验前用TBST(含1％脱脂奶粉)将膜在4℃下封闭过夜(缓慢摇动)。用TBST的稀释一抗(WDR26特异性多克隆抗体，1：10／His－Tag单克隆抗体，1：1 000，Novageu)将以上制备的膜在室温下孵育2h。膜用TBST漂洗3次，每次20min。用TBST稀释的二抗(HRP耦联的羊抗兔IgG单克隆抗体／HRP耦联的羊抗鼠IgG单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology)按1：1500稀释后，将膜孵育1h；TBST漂洗3次，每次20min；TBS漂洗30min。用新配制的按1：50稀释的DAB(Amresco，E885)显色20min(按照产品说明进行)，得到较好的信号-背景对比效果后用TBS中止反应。
　　2　结果与讨论
　　2．1 抗原簇的位点分析与抗体的制备
　　WDR26抗原簇位点分析使用DNAstar软件进行，结果如图1．其中亲水性较高、与家族基因的同源度较小的一段表面肽段(120aa－140aa)被选用作为抗原。我们利用化学合成的多肽为抗原，制备了WDR26的多克隆抗体，并利用抗原吸附的方法对血清进行了纯化。
　　
　　2．2 pCMV-WDR26稳定转染细胞系的鉴定
　　为了对WDR26进行进一步研究，我们用该抗体对稳定转染pCMV-WDR26的HeLa细胞系进行了鉴定。将从稳定转染pCMV-WDR26的HeLa细胞系及稳定转染pCMV的对照细胞系中提取的总蛋白转印到PDFV膜上，再分别用纯化后的WDR26特异性抗体和anti-Flag单克隆抗体对其进行Westernblot分析(图2)。结果说明该纯化抗体表现出较好的特异性，从而证明了稳定转染pCMV-WDR26的细胞系已经成功建立。在pCMV-WDR26稳定转染的细胞系中，WDR26的表达明显强于对照细胞系中WDR26的表达。这说明HeLa细胞中存在内源性WDR26蛋白，而我们转染的质粒则增强了这一蛋白的表达。
　　
　　2．3 WDR26对细胞生长的影响
　　如前所述，MAPK信号途径在细胞的生长过程中起着重要的调节作用。考虑到WDR26对该信号途径潜在的抑制作用，我们希望知道它对于细胞生长是否也有一定的影响。我们分别建立了稳定转染pCMV-WDR26的HeLa细胞系，并建立pCMV的稳定转染HeLa细胞系作为对照。通过对这两个细胞系进行生长计数并绘制出细胞生长曲线(图3)，24h之后，稳定转染pCMV-WDR26的HeLa细胞系的数目就已经达到对照组的两倍，并且这样的生长速度一直持续到120h之后。这一结果说明WDR26的过度表达加快了HeLa细胞的倍增速度，使其倍增时间有一定程度的缩短。进一步的流式细胞仪分析结果也表明过量表达WDR26蛋白使停留在分裂相的HeLa细胞数目增多(图4)，这说明WDR26具有促进细胞分裂的作用。
　　
　　
　　综上所述，我们初步认为WDR26蛋白对细胞的增殖有一定的促进作用。MAPK信号途径对细胞增殖和凋亡的调节依赖于一个复杂的调控网络。虽然多数研究结果表明该途径的激活可以促进细胞生长，但对于细胞生存，MAPK具有正负两方面的调控活性，例如Ras，ERK的激活因子被发现可以促进细胞凋亡，而WDR26蛋白――具有Gβ的类似结构，以及对MAPK信号途径潜在的负调控作用――能够促进细胞分裂，加速细胞的增殖过程。那么，WDR26与MAPK信号途径的关系，该蛋白与Gβ在信号传导调控中的相互关系都值得进一步地深入探讨。
　　致谢：感谢湖南师范大学生命科学学院刘筠教授实验室提供流式细胞仪!本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文

cAMP-PKA信号通路如何介导对基因表达的调控?

cAMP--PKA信号通路对真核细胞基因的表达的调控

这类反应属于慢反应

主要过程:激素，G蛋白偶联受体，G蛋白腺苷酸环化酶，cAMP，cAMP依赖的蛋白激酶A (PKA)PKA，催化亚基释放进入细胞核，使得基因调控蛋白(CREB) 磷酸化，磷酸化的基因调控蛋白与核内结合蛋白特异结合形成复合物，复合物与靶基因调控序列结合，激活靶基因的表达

异源三聚体G蛋白信号调节

木霉的G蛋白由3个a-亚基、1个β-亚基和1个γ亚基组成（Schmoll，2008）。在异源三聚体G蛋白信号通路中，信号配体结合受体后，向细胞质中释放游离的G蛋白，GTP将结合与Ga亚基交换下来的GDP，而后Ga脱离βγ复合体，这样Ga和Gβγ可以分别调控下游受体。真菌中G蛋白调控两条信号通路：cAMP依赖的PKA途径和促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）途径（图4.2）。深绿木霉发现了4个G蛋白偶联受体，其中1个是孢子形成必不可少的（Brunner et al.，2008）。

深绿木霉G蛋白a亚基tga1基因缺失突变体强烈地产生孢子，菌丝生长受到抑制；在tga1基因过表达菌株中孢子形成被抑制，菌丝生长加速（Rocha-Ramirez et al.，2002）。深绿木霉tga3基因缺失突变体强烈地产生孢子，并且可以在黑暗中产生孢子（Zeilinger et al.，2005）。在tga1和tga3基因缺失突变体中cAMP含量降低，然而，添加cAMP不能恢复tga3突变体的野生型表型。这说明Tga3 经cAMP依赖的通路介导了孢子的形成。然而，绿木霉tgaA和tgaB（tga1同源基因）基因敲除突变体的孢子形成表型与野生型一致（Seibel et al.，2009）。

图4.2 深绿木霉G蛋白信号通路示意

注：GPCR：G蛋白偶联受体；Tga1，Tga3：G蛋白a亚基亚组分Ⅰ和Ⅲ；Tmk1：促分裂素原活化蛋白激酶

（Omann et al.，2010）

tga1基因缺失突变体中几丁质酶基因 nag1（Nacetyl-glucosaminidase-encoding）和ech42（endochitinase 42-encoding）表达显著下降，胞外几丁质酶活显著降低，抗真菌物质6-戊基-a-吡喃酮（6-pentyl-a-pyrone）分泌显著减少（Reithner et al.，2005），然而，抗菌肽含量升高（Stoppacher et al.，2007）。tga3 基因缺失突变体中几丁质酶基因nag1和ech42表达升高，胞内几丁质酶活性增加，但是分泌到胞外的几丁质酶降低（Zeilinger et al.，2005）。

在研究里氏木霉光依赖的纤维素酶调控时发现：异源三聚体G蛋白信号通路参与了调控过程。cAMP信号通路参与了纤维素酶基因表达的调控和对光的响应，而Tga3 同源蛋白GNA3参与了cAMP信号通路，所以GNA3最有可能同时具备调控纤维素基因表达和光响应功能（Sestak et al.，1993；Tisch et al.，2009），基因gna3转录显著地受光调控。在工程菌中持续地表达GNA3可以显著上调光依赖型纤维素酶cbh1（cellobiohydrolase 1，纤维二糖水解酶）基因转录。然而在G蛋白a-亚基调控的纤维素酶表达过程中还需要一个诱导物（Schmoll et al.，2009）。在里氏木霉中光依赖型GNA3 调控纤维素酶表达，同时提高胞外几丁质酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶（N-acetylglucosaminidase）、β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase）脂肪酶（lipase）和磷酸酶（phosphatase）活性，在深绿木霉中光依赖型GNA3调控peptaibols抗菌肽的合成。敲除gna3基因后peptaibols抗菌肽产生和孢子形成受到完全抑制（Komon-Zelazowska et al.，2007）。因此，GNA3介导的信号通路在peptaibols抗菌肽合成中起到比光更重要的作用。

里氏木霉的G蛋白a-亚基GNA1介导了光调控的纤维素酶基因转录，然而这一通路与GNA3不同。里氏木霉gna1缺失突变体中cbh1基因不转录，但是可以检测到纤维素酶活性，在某些条件下cbh1可以在黑暗中大量表达（Seibel et al.，2009）。然而，即使作为组成性表达活性的G蛋白亚基GNA1 也无法在抑制性碳源甘油和葡萄糖存在时单独诱导纤维素酶基因表达，或者解除碳的分解代谢产物的阻遏作用。因此，GNA1介导了光依赖型纤维素酶基因表达调控，而不是必要的诱导作用。深绿木霉中的gna1同源基因tga1抑制孢子生成，在tga1沉默的转化株中孢子组成型地形成，然而过表达tga1基因的转化株或组成型表达tga1的等位基因都不能使木霉在光照下产生孢子（Rocha-Ramirez et al.，2002）。这些对孢子形成的影响机制在里氏木霉中没有被发现（Seibel et al.，2009）。里氏木霉 ENVOY 参与了 G 蛋白信号转导途径，ENVOY 可以回补 gna1 缺失造成的影响（Tisch et al.，2011b）。

真菌中G蛋白偶联的受体（G-protein-coupled receptors，GPCRs）（Lafon et al.，2006）分为9类：Ⅰ和Ⅱ是信息素（pheromone）受体（与啤酒酵母S.cerevisiae Ste2p和Ste3p同源）；Ⅲ和Ⅳ可能是碳源和cAMP感受器；Ⅴ包含裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe Stm1 p-like 氮源感受器；Ⅵ位于细胞质中，包含丝状真菌GPCRs特有的RGS结构域；Ⅶ是鼠生长激素释放因子；Ⅷ是类固醇受体mPR；元件Ⅸ包含真菌视蛋白。通过信息生物学分析在里氏木霉中发现超过50个GPCRs。基于信息生物学分析，深绿木霉中克隆得到了4个GPCR编码基因。Gpr1是第四类GPCRs，即cAMP受体相似蛋白（cAMP receptor-like proteins，CRL proteins），含有7次跨膜结构，在深绿木霉营养生长和孢子形成中起到重要作用（Brunner et al.，2008）。通过RNAi获得的gpr1基因沉默菌株完全丧失了重寄生功能，外源cAMP可以恢复这种功能缺陷（Omann et al.，2009），这种现象类似于深绿木霉tga3基因缺失突变体的表型。

钙调蛋白首先在绿木霉中被发现（Muthukumar et al.，1984）。使用钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪（trifluoperazine）和奎那克林（quinacrine）、钙拮抗元素La2+、钙螯合剂EGTA及Ca2+离子载体A23187进行处理后，发现Ca2+/钙调蛋白信号途径对里氏木霉的生长及光诱导的孢子形成非常重要（Harman et al.，2002）。绿木霉的分生孢子产生过程依赖于钙素平衡（Krystofova et al.，1995）。这个信号途径似乎需要一个Ca2+/钙调蛋白依赖型的蛋白激酶参与，该激酶能磷酸化一个20kDa的蛋白质（Mach et al.，1998）。在尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中发现该20kDa蛋白与转导蛋白同源，这就表明钙调蛋白信号途径与G蛋白调控途径紧密相关（Hoshino et al.，1992）。

本文地址:http://www.dadaojiayuan.com/zhongyizatan/50194.html.

声明： 我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本站部分文字与图片资源来自于网络，转载是出于传递更多信息之目的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们(管理员邮箱：602607956@qq.com)，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!

上一篇: 磷酸钙可能在狭窄动静脉瘘中存在沉积现···

下一篇: 青少年肾消耗病发现新分子遗传诊断方法