丁公藤的作用

丁公藤碱降眼压作用机制的研究

中华眼科杂志1999年第3期第35卷 青光眼

作者：曾淑君　张延斌　彭大伟　伍宇平　余克明　周文炳

单位：曾淑君　张延斌　伍宇平(510089广州,中山医科大学药理教研室)；彭大伟　余克明　周文炳(中山医科大学中山眼科中心)

关键词：丁公藤碱；缩瞳；降眼压；M受体亚型；环核苷酸

【摘要】　目的　探讨丁公藤碱降眼压作用的分子药理学机制。方法　在恒定光源下用瞳孔尺测量兔瞳孔直径,用气动眼压计测量兔眼压，测量离体兔虹膜的收缩力，采用放射免疫法测定房水的环核苷酸含量。结果　测定丁公藤碱缩瞳作用的pD2值为3.60±0.15,降眼压作用的pD2值为3.49±0.07,离体虹膜收缩作用的pD2值为6.38±0.12。M1～M3受体拮抗剂均可拮抗丁公藤碱的缩瞳作用、降眼压作用及离体虹膜收缩作用,其中以M3受体拮抗剂的拮抗作用最强。0.01％丁公藤碱可使房水环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量降低,环磷酸鸟苷(cyclic guanosine3,5-monophosphate;cGMP)含量升高。结论　丁公藤碱的缩瞳和降眼压作用主要通过M3受体介导，其信号转导机制与环核苷酸系统相偶联。

Studies of the mechanism of lowering intraocular pressure on Erycibele alkaloid

ZENG Shujun,ZHANG Yanbin,PENG Dawei,et al.Department of Pharmacology,Sun Yat-sun University of Medical Sciences,Guangzhou510089

【Abstract】　Objective　To investigate the molecular pharmacological mechanism of lowering intraocular pressure of Erycibele alkaloid.Methods　Rabbit pupil diameter was measured by a pupillary ruler in constant illumination and the intraocular pressure(IOP)was measured by pneumatonometer.Iris contracting force was measured in an experiment of isolated rabbit iris.Radioimmune method was used to determine the content of cyclonucleotide.Results　The pD2value(the affinity to M-receptors of agonist)of Erycibele alkaloid's miosis is3.60±0.15and its IOP lowering action is3.49±0.07.In the isolated iris contracting experiment,its pD2value is6.38±0.12.M3receptor antagonist is the strongest antagonist in inhibiting the miosis,IOP lowering action and isolated iris pupillary contracting action of Erycibele alkaloid.0.01%Erycibele alkaloid can cause the decrease of cAMP and the increase of cGMP in the aqueous humor.Conclusions　The effects of miosis and IOP lowering of Erycibele alkaloid are all mediated by M3receptor subtype and its signal transductive mechanism is connected with cyclic nucleotide system.

【Key words】　Erycibele alkaloid　Miosis　IOP lowering　Muscarinic receptor subtype　Cyclic nucleotide

以毛果芸香碱(pilocarpine)为代表的拟胆碱药是一类历史悠久、效力较强的抗青光眼药物,均为毒蕈碱受体(muscarinic receptor,M受体)的激动剂,其降眼压作用机制尚未完全明了。多数学者认为是直接兴奋睫状肌的纵行肌，牵引巩膜嵴，开大小梁网间隙，增加房水外流（用于开角型青光眼）［1，2］；直接兴奋虹膜括约肌，引起缩瞳，减少虹膜在房角的堆积，开放房角，恢复房水的正常循环（用于闭角型青光眼）。1987年，Bonner等［3］应用分子克隆技术，证实了M受体的5个亚型，分别命名为M1～M5受体。M受体兴奋后，可通过一系列信号转导(signal transduction)机制发挥作用。信号转导机制主要有3个方面：（1）激活磷酰脂肌醇(phosphatidylinostal，PI)；（2）抑制腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)或激活鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,GC)；（3）离子通道(ionic channal)的变化，但至今各M受体亚型的确切信号转导机制尚未阐明。1992年Gabelt和Kaufman［4］的研究证实毛果芸香碱对猴眼的房水外流、调节痉挛及缩瞳作用均通过M3受体介导。

丁公藤碱(erycibele alkaloid)是我国特有的应用于临床的抗青光眼中草药，具有与毛果芸香碱相同作用的M受体激动剂［5-7］。但丁公藤碱作用于哪个M受体亚型？又通过哪些信号转导机制发挥其降眼压作用？为探讨丁公藤碱的分子药理学机制，我们进行了以下研究。

材料和方法

一、缩瞳、降眼压实验

1.瞳孔的测定:将兔固定于箱内,于恒定强度的光线下，用瞳孔尺测定瞳孔直径。

2.眼压测定:将兔固定于箱内，安静半小时,用0.4%丁氧普鲁卡因进行眼球表面麻醉,用气动眼压计(美国Digilab model30R-T pneuma-tonometer)测量眼压,重复测量3次,取其平均值,记录眼压曲线。

3.给药方法:将兔的1只眼滴入平衡盐溶液100μl作为空白对照，另1只眼滴入某一浓度丁公藤碱100μl，分别于滴眼后30min、1、2、3、4、5及6h测定双眼瞳孔大小和眼压变化,选取瞳孔缩小和眼压下降最大值进行统计学处理,每一浓度丁公藤碱滴用10只兔眼，共5个浓度50只兔眼。2周后,对照眼仍滴用平衡盐溶液作为空白对照；实验眼先给予4%pirenezepine(M1受体拮抗剂),30min后,再滴入不同浓度的丁公藤碱,方法同上；观察家兔双眼6h内的瞳孔大小及眼压变化。另取100只兔，将4%pirenzepine改为2%gallamine(M2受体拮抗剂)或0.4%4-单磷酸脱氧腺苷(deoxyadenosine monophosphate,DAMP)(M3受体拮抗剂)重复上述实验,即可获得各亚型拮抗剂拮抗丁公藤碱对眼压和瞳孔的药效变化。

4.以各累积剂量的对数为横坐标,相应累积效应为纵坐标绘图,可获得S形曲线,按改良Lineweaver-Burk公式使之直线化,求得解离常数(KD)和最大效应(Emax)。将所得数据通过计算机软件,求得丁公藤碱的pD2值(激动剂解离常数的负对数,表示激动剂对M受体的亲和力)和各亚型拮抗剂的pA2值(竞争性拮抗剂解离常数的负对数,表示拮抗剂对M受体的亲和力)。

二、离体虹膜实验

静脉注射空气处死家兔,迅速摘出双眼球,置于冷Ringer-Locke营养液中，细心分离出完整虹膜,按虹膜内等腰三角形三顶端各穿一线,底边二线连于通气钩上,另一端连于拉力换能器上,负荷500mg，平衡1h后,制作不同浓度丁公藤碱虹膜累积量效收缩曲线，然后冲洗虹膜3次，分别加入M1受体亚型拮抗剂pirenzepine,M2受体亚型拮抗剂gallamine和M3受体亚型拮抗剂4-DAMP,其分子质量浓度均为10mol/L，共0.2ml，平衡30min后,再重复不同浓度的丁公藤碱,记录收缩曲线,以各累积剂量的对数为横坐标,相应累积效应为纵坐标绘图,得S形曲线,按改良Lineweaver-Burk公式使之直线化,求得KD和Emax。将所得数据通过计算机软件,求得丁公藤碱的pD2值和各亚型拮抗剂的pA2值。

二、信号转导的机制

M受体兴奋之后,其信号转导机制是加速磷酰脂肌醇的代谢,抑制腺苷酸环化酶,激活鸟苷酸环化酶,或者引起离子通道的改变［9，10］。我们的实验结果表明，0.01%的丁公藤碱可引起房水cAMP含量的下降，丁公藤碱激活了M受体之后，与抑制性G蛋白（Gi或Go）相偶联，抑制腺苷酸环化酶使cAMP含量下降；另一方面又与相应的G蛋白（如Gq）相偶联，增强磷酰脂肌醇的代谢，生成二酰基甘油（DAG），激活鸟苷酸环化酶，提高细胞内cGMP水平，说明丁公藤碱降眼压的信号转导机制是通过环核苷酸系统。

寻找疗效高、副作用小和选择性强的M受体亚型的拟胆碱药是青光眼药理学的重要课题。目前我们仅就丁公藤碱与M受体亚型的关系及其信号转导机制进行了初步探讨。今后尚待进一步精确地阐明眼前段组织中M受体亚型的分布、功能及其信号转导机制，为指导临床用药、寻找药效更强、副作用更小的胆碱能抗青光眼新药提供理论依据。

本课题受国家自然科学基金(基金编号39570753)和广东省自然科学基金(基金编号940225)资助

参考文献

1　Bartlett JD,Novack GD,Hiett JA，et al.Antiglaucoma drugs.In:Bartlett JD,Jannus SD,eds.Clinical ocular Pharmacology.3rd ed.Washington:Butterworth,1995.183-248.

2　Kaufman PL,Gabelt BT.Cholinergic mechanism and aqueous humor dynamics.In:Drance SM,Van Buskirk EM,Neufeld AH,eds.Pharmacology of glaucoma.Baltimore:Williams & Wilkins,1992.64-93.

3　Bonner TI,Buckley NJ,Young AC.Identification of a family of muscarinic acetycholine receptor genes.Science,1987,237:527-533.

4　Gabelt BT,Kaufman PL.Inhibition of outflow facility and accommodative and miotic responses to pilocarpine in rhesus monkeys by muscarinic receptor subtype antagonists.J Pharmacol Exp Ther,1992,263:1133-1139.

5　周文炳,彭大伟,刘嫣芬.丁公藤碱治疗青光眼的初步报告.中华眼科杂志,1981,17:65-68.

6　曾淑君,彭大伟,胡本荣.丁公藤碱降眼压作用的药理研究.中药药理与临床,1989,5(2):15-18.

7　彭大伟,曾淑君,周文炳.丁公藤碱缩瞳和降眼压作用的研究.中山医科大学学报,1988,9(3):27-30.

8　Honkoman RE,Howard EF,Abdol AA.M3muscarinic receptor subtype predominates in the bovines iris sphincter smooth muscle and cilliary processes.Invest Ophthalmol Vis Sci,1990,31:590-593.

9　Eglen RM,Hegde SS,Watson N.Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function.Pharmacol Rev，1996,48:531-565.

10　Shed DL,Clark AF,Pang IH.Effects of muscarinic gents on cultured human trabecular meshwork cells.Exp Eye Res,1996,62:201-210.

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