海洋微生物应用前景

海洋微生物应用前景

近20年来，有关海洋微生物产生新的生物活性的次级代谢产物的报道逐渐增多，海洋微生物作为活性物质的新来源正日益为国内外海洋研究工作者所重视。，已经从海洋微生物中发现了许多结构新颖的化合物，其中许多化合物具有较高的抗肿瘤活性。海洋放线菌是海洋细菌抗肿瘤活性物质的重要来源，最先成为海洋微生物研究的热点。来自国际最著名的海洋天然产物研究机构加州大学的Wfenical研究组从放线菌中分离鉴定出一系列结构新颖的化合物（Slinosporamides），些化合物具有很强的抗癌活性，如Slinosporamides(1)对HCT—116细胞的ED50为0．016ug/ml。从报道化合物的结构类型来看，有生物碱、环肽、聚醚类毒素、萜类等[9]。

近年来从海洋小单胞菌中发现了引人注目的抗肿瘤活性物质，已引起人们的重视。Kosinostatin和异醌环素B[10]。是从海洋小单胞菌属的培养液中分离得到的一类醌环类抗生素。日本Furumai等发现Kosinostatin对人的骨髓性白血病U937细胞有明显的细胞毒性(ED50为0．09um/ml)，并对21种人类癌细胞具有抑制作用，IC50小于0．1um/ml。Francisco Romero研究组对印度洋海域的小单胞菌属代谢产物进行了抗肿瘤活性筛选，得到了2抗肿瘤化合物Thiocoraline和IB—96212。其中IB—96212[11]是结构新颖的大环内酯类化合物，对P388细胞有极强细胞毒性(ED50＝0.0001mg/l)，对A549、HT29及MEl28细胞有明显细胞毒性(ED50＝1mg/l)。

结合你所学到的环境微生物学方面的知识，谈谈对环境微生物学在环境科学和环境治理领域中的应用和发展前景

摘要：微生物在环境中充当着极其重要的角色，它在自然界的生态平衡和物质循环中起着不可替代的作用。同时，在环境污染和治理方面，微生物也起着重要作用。环境微生物学的兴起是微生物学与环境科学交叉发展的必然结果。它由普通微生物学发展起来的环境科学和环境工程的一门学科.它以普通微生物学为基础，在研究微生物学一般规律的同时，着重微生物和环境之间互相作用的规律，微生物活动对环境和人类产生的有益和有害的影响以及在环境污染控制工程中有关的微生物原理的研究，是环境科学和环境工程的重要理论基础。环境微生物学的内容十分广泛，而且该学科近年来的发展十分迅速，一些生物学的新技术手段被不断应用到环境微生物学领域中。
关键词:环境科学；环境工程；微生物学；环境微生物学
1 微生物学的发展简史
微生物学是研究微生物及其生命活动的科学。微生物具有种类繁多、体积微小、比表面积大、代谢类型多、代谢强度高、生长繁殖速度快、容易变异、种类多等多种特点。它广泛分布于空气、水、土壤、人体及动植物体内独立或寄生生活。大多数微生物对人类和动植物是有益的，特别是它与人类的生活有密切的关系，对工农业生产、人类的生活环境与健康卫生有极大的影响[1]。
人类对微生物的利用甚早。我国在利用微生物方面，更有着丰富的经验和悠久的历史。早在公元前3世纪，在《吕氏春秋》里就有“仪狄作酒禹饮而甘之”之说。在公元6世纪，后魏贾思勰所著的《齐民要术》一书中就详细记载了制曲和酿酒的技术，还记载了栽种豆科植物可以肥沃土壤，当时虽不知根瘤菌的存在，也不知固氮作用，而会利用根瘤菌积累氮肥等等。
1676年，微生物学的先驱列文虎克用自制的单式显微镜首次观察到了细菌的个体，为揭开微生物世界的奥秘打开了大门，具有划时代的意义。在之后近200年的时间里，人们对微生物的研究仅停留在出于个人爱好对一些微生物进行形态描述的低级水平上，包括细菌、原生动物和真菌，但对它们的生理活动机理及其与人类实践活动的关系却未加研究，因此，微生物作为一门学科在当时还未形成。
在19世纪末和20世纪初微生物学被牢固地建立起来。法国的巴斯德和德国的科赫，分别被称为微生物学的奠基人和细菌学的奠基人。巴斯德在研究酿酒生产中酒质变酸的问题时，指出发酵是微生物的作用。巴斯德创立了培养基和玻璃器皿的灭菌方法及巴氏消毒，建立完成了稀释和次代培养的无菌技术。为生物学的发展做出了突出的贡献。科赫在培养细菌学的巨大贡献是发明了用固体培养基的“细菌纯培养法”和把混合培养物纯化的技术，并用在固体培养基上划线接种的方法获得了单一的纯种。这种技术使得培养细菌学发生革命性变化，并使得十九世纪最后二十年中这个学科得以开出绚丽的花朵。进入二十世纪，微生物学获得了飞速的发展，研究重点逐渐转移到了生化水平及分子生物学的水平上。工业微生物学与发酵工程、遗传工程、细胞工程、酶工程和生物反应器工程一起组成了生物工程学这个当代高科技领域。
随着社会经济发展的需要，人们不断加强对微生物的研究，己形成了许多微生物学的分支学科。例如有普通微生物学、微生物生理学、微生物生态学、微生物遗传学；有病毒学、细菌学、真菌学；还有土壤微生物学、海洋微生物学；再有医学微生物学、工业微生物学、农业微生物学、环境微生物学、石油微生物学等等，由此可见微生物学的发展无不体现着学科的交叉，特别是相关的细胞生物学，生物化学，遗传学及分子生物学间的相互促进，由此推动整个生命科学的飞速发展。同时物理，化学，计算机技术及材料科学的发展，为微生物学的发展提供了必要的技术手段。所以，微生物学的发展历史是辉煌的[2~4]。
2、环境微生物学的研究内容
环境微生物学主要是介绍环境微生物学的发展和生物学基础知识；在环境中存在的微生物主要种类和特点；微生物的生理和代谢，微生物生长和环境因子对微生物的影响；微生物的遗传和变异，微生物的生态及其分布；在各种环境条件下微生物的存在和变化，微生物的代谢活动对环境的影响；微生物在自然界中的地位和作用，在生物地球化学循环中的作用；在环境领域中微生物所起的作用，微生物对污染物产生抗性的分子机理，以及对污染物降解的代谢途径。
3、环境微生物学的发展
随着人类的生活要求和工农业生产的迅速发展，大量人工合成的并难以被天然微生物迅速降解转化的污染性化合物进入到自然环境中。严重威胁人类及其他生物正常生存发展。其中，普遍存在于土壤环境中的重要有机污染物如多环芳烃，农药类等，因其致癌性，致畸性，致突变性而被认为是危险物质。分子生物学技术的应用为污染治理、防治提供了新的思路和方法[5] 。同时，污染导致资源环境中的生物重组，对环境中复杂的混合微生物群落进行及时监控和准确鉴定变得越来越重要。而分子生物学技术因其快速、准确、灵敏的特点，正逐步取代某些传统的研究方法而被广泛用于环境微生物的监测[6] 。
3.1与环境微生物研究相关的各种分子生物学技术
3.1.1核酸探针检测技术
利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针分析DNA序列及片段长度多态性。被标记(放射性或非放射性的)的探针以原位杂交、Southern印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法，可直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术广泛应用于对环境中微生物的检测，定性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等研究目标。
荧光原位杂交(FISH)是目前单个细胞水平上分析微生物群落结构的常用分子生态学方法。目前可利用FISH的方法，使用一整套特异的寡核苷酸探针可进行单个细胞的快速分类[7~8]。流式细胞计(FCM)是另一种能快速分析和分类单细胞群体的技术。适用于对有关微生物群落的组成和动态进行快速和频繁的监测。RFLP标记基于Southern印迹杂交的技术，即DNA限制片段长度多态性，是在生物多样性研究中广泛应用的DNA分子标记。可作为一种能高度灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法。
3.1.2 PCR及相关技术
PCR是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术。根据扩增的模板，引物序列来源及反应条件的不同可将PCR技术分为以下几种：(1)反转录PCR技术是在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，可以用来分析不同生长时期的mRNA表达状态的相关性。(2)竞争PCR是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。竞争性PCR曾被用来测定受多环芳烃污染的沉降物中的编码邻基二酚-2，3-加双氧酶的dmpB基因浓度[9]。(3)扩增的rDNA限制酶切分析技术，是美国最新发展起来的一项现代生物鉴定技术，它根据原核生物rDNA序列的保守性，将扩增的rDNA片段进行酶切。然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性。
3.1.3电泳分离及显示方法
除我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE分离)银染的方法外，还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记。如变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、单链构象多态性等，都是通过实施一些变性条件改变DNA双螺旋结构(如添加线性梯度的变性剂或建立变性温度梯度等)，由于序列不同的DNA片段，其部分解链程度也不同，不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大，结果不同序列的DNA片段在凝胶上得以高分辨率的分离。
3.1.4 基因重组技术
利用DNA体外重组或扩增技术从供体生物基因组中分离感兴趣的基因或DNA片段，或经人工合成的方法获得基因，然后经一系列切割，加工修饰，连接反应产生重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。此技术用于环境微生物的研究可构建出各种生物降解特性增强的重组菌用于污染环境的治理修复或发酵某些废弃物生产天然气。如将微生物分解纤维素和木质素的基因转入到中温细菌中，使发酵能在较高温度下进行，提高转化速度，用于蔗糖发酵生产天然气[10] 。
3.1.5 基因芯片技术
基因芯片技术作为生物芯片技术一个发展最完备的分支，基因芯片可以分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片cDNA芯片有多种制备方法，在基因表达相关研究方面具有重大价值;寡核苷酸芯片主要应用于杂交测序、单核苷酸多态性分析和突变检测。基因芯片，又称DNA微阵列，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。cDNA芯片即在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上固定的成千上万个cDNA分子组成cDNA微阵列。
3.2 分子生物学技术在环境微生物研究中的应用
3.2.1重组细菌用于环境污染防治
Pseudomonas sp.P2是一株甲酰磷降解菌，罗如新等人(1999)[11]克隆了氯苯降解菌L1的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因，在表达载体PKT230携带下转入了P2菌中，使P2获得高效的邻苯二酚1,2-双加氧酶酶活，该酶活性甚至比天然宿主还高21倍。
植物根际是一个有潜力的污染降解地点，在植物根际由植物供给能被微生物利用的营养物质使微生物繁殖，最终进行污染物的消除。在外来微生物中表达与脱毒有关的酶类也能在实地应用中提供专一选择优势。该例利用了小麦根际微生物对土壤中的三氯乙烯(TCE)脱毒。D.C.yec等人(1998)[12]将洋葱伯克霍尔德菌G4的甲苯邻单加氧酶基因转入荧光假单子孢菌2-79中后，荧光假单孢菌比小麦根际其它菌长得好。
3.2.2 胞内酶在细胞表面表达更好发挥生物降解功能
当有重金属存在时，较高等植物可产生相应的金属硫蛋白(MTs)。MTs是含半胱氨酸丰富的蛋白质，能结合镉、铬、汞和铜等重金属离子。在E.coli中表达MTs是一项有希望的技术，但细胞内的MTs对金属离子的吸附能力有限。解决这一困难的一条途径是在细胞表面表达MTs，据报道把MTs插入LamB序列的153位点而证实了这一可能性[13]，杂合蛋白的表达提高了对镉的结合力达15~20倍，由于MTs定位于细胞表面，即使细胞死亡，仍可用于金属的吸附和积累。有机磷广泛用于农业制造杀虫剂，由土壤微生物中分离到的有机磷水解酶(OPH)能有效降解这些杀虫剂。但OPH纯化所需的成本高，而用完整的细胞脱毒受到转运有机磷通过细胞膜屏障的限制。在细胞表面表达0PH的完整细胞降解磷!硫和Paraoxon比在细胞内表达OPH的细胞快几倍[14]。得到的酶活定位于细胞表面的生物催化剂比纯化的0PH明显更稳定，也更活跃。
3.2.2 分子生物学技术在环境微生物监测中的应用
环境中存在的大量微生物中，仅有1%可通过传统的培养方法在培养皿上进行培养和进一步分离，而绝大多数细菌要求非常严格的营养条件或是难以培养 [15] PCR技术及衍生出的一系列生物技术，使得在复杂环境中对那些混合物内低含量的群体成员或生物群中某个特异基因的检测与研究成为可能。
Fantroussi等人[16]用嵌套式PCR(nestedPCR)来监测未被污染的土壤淤泥实验生态系中3-氯苯脱氯细菌的外源基因的种类。Selvaratnam等人[17]用编码苯酚单加氧酶的dmpN基因的PCR扩增来检测处理废水的分批式反应器中的降解酚的假单胞杆菌。PCR技术还与其它方法结合应用于环境监测中。Chandler等人[18]用MPN/PCR技术来估测被燃料污染的土壤中的萘过氧化物酶基因nahAc、链烷单加氧酶基因alkB及dmpB的数量。PCR技术与核酸杂交技术结合，用来进一步检测PCR扩增产物，核实被扩增的序列即目的序列。
环境微生物监测环境中微生物的研究难点是常常无法准确定性和直接定量地检测环境中可能存在的众多微生物种群。基因芯片技术的出现和发展为微生物学领域的研究者提供了高效快捷的技术方法，为科研迅速向纵深化发展提供了可能[19]。一些作为分子标记的基因工程菌也应用到环境生物技术中，主要用来监测投放到环境中的微生物的情况。许多学者对细菌中的荧光基因(luxgene)进行克隆，转移到具有分解能力的特种微生物体内，具有分解能力的菌体中就有了特定的荧光标记，通过对荧光菌和荧光量的监测可以达到对专门细菌的跟踪，并可以了解到它们与其它菌株之间在分解过程中的关系[20]。
3.2.3 分子生物技术在环境基因工程菌的稳定性和安全性研究中的应用
对转基因生物的环境安全问题需进行长期的系统的研究，因风险的出现有长期滞后性。在关于被引入遗传物质的稳定性和新的遗传物质是否转移到其他微生物中，通过生物的表型可初步判断，进一步的证实则可以利用DNA序列分析，探针杂交等。关于生物围堵，目的是加强对重组微生物的行为和命运的可预见性。生物围堵系统可以是被动的，如对菌株引入培养缺陷型，recA-等突变；或是主动的系统，指向细胞中引入诱导细胞死亡的自杀基因。化学诱导自杀作为生物围堵的基本原理，其策略是将杀伤功能与生物降解途径的调节系统相联系，细胞在非生物物质存在时存活(自杀基因被遏制)，但非生物物质完全降解后，自杀基因开启，细胞死亡。
随分子生物学技术的发展和对环境微生物研究的深入，分子生物学技术在环境微生物中的应用越来越广泛也越来越重要。分子生物学技术的应用不仅扩大了环境微生物研究的广度而且加大了研究的深度。随着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细菌体内降解基因的分布和表达会有更深入的了解，这方面技术的成熟必将对环境微生物的研究有一个整体的系统的生态水平上的认识，必将使研究更具目标性，应用更具可控性[21]。

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